胡高宇 張 翔 陳 琛 范建勛 肖國強(qiáng) 蔡景波 柴雪良

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所,溫州 325005;2.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,溫州 325005;3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306;4.三門縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,臺州 317100)

隨著漁業(yè)資源的衰退,我國捕撈產(chǎn)業(yè)產(chǎn)量已經(jīng)難以高速增長,為了滿足國內(nèi)對水產(chǎn)品的需求,水產(chǎn)養(yǎng)殖進(jìn)入快速增長時期。2017年中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒[1]顯示,全社會漁業(yè)產(chǎn)值為12002.91億元,其中捕撈業(yè)占20.06%,養(yǎng)殖業(yè)占74.60%,我國水產(chǎn)品市場需求主要由養(yǎng)殖業(yè)提供。養(yǎng)殖帶來的不僅僅是經(jīng)濟(jì)效益,殘餌、排泄物、溶解性氮磷等成為養(yǎng)殖過程中的主要污染物。將未經(jīng)處理的養(yǎng)殖尾水排放至水環(huán)境中,會對水環(huán)境造成不良影響,因此,如何以較低成本和較高效率來凈化養(yǎng)殖尾水將成為綠色養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題之一。

生物膜法是養(yǎng)殖尾水處理中最常用也是最經(jīng)濟(jì)的方法,因其綠色環(huán)保、效果較好等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。生物膜法主要是利用濾料表面微生物的生長繁殖來消耗水體中有機(jī)物質(zhì),以此達(dá)到脫氮的目的,目前在水處理工程中以硝化和反硝化作用為核心的技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[2,3]。研究表明,通過添加生物填料可以增大生物膜與水體的接觸面積,以此加強(qiáng)對水體處理效果[4]。國內(nèi)對生物填料的研究有較多文獻(xiàn)記載,目前研究較多的材料有:陶粒、彈性填料、活性炭、聚乙烯材料、牡蠣殼和藤壺殼等。支瑩等[5]以粉煤灰為原料的輕質(zhì)陶粒作為生物填料,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對COD、TN和TP去除率分別可達(dá)83.57%、74.61%和80.17%;王威等[6]利用聚乙烯材料成功培養(yǎng)生物膜之后,24h內(nèi)氨氮去除率90%以上;以牡蠣殼為填料對城市生活污水處理時,COD去除達(dá)到38%,當(dāng)水力停留時間4h以上時氨氮去除率97%[7];藤壺殼對對蝦尾水進(jìn)行處理時發(fā)現(xiàn),隨著填充率的增加處理效果越好[8];李倩等[9]利用彈性毛刷對羅氏沼蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)的水質(zhì)進(jìn)行凈化,取得了較好的效果。

鹽生植物也是修復(fù)海水養(yǎng)殖尾水的重要手段之一[10],目前已經(jīng)有較多的鹽生植物被應(yīng)用于養(yǎng)殖尾水的治理當(dāng)中,有研究發(fā)現(xiàn)堿蓬對養(yǎng)殖富營養(yǎng)化水體進(jìn)行原位修復(fù)后,海水中的氮磷含量均有明顯下降[11];以蘆葦構(gòu)建人工濕地較好地去除了養(yǎng)殖尾水污染物[12];曾碧健等[13]通過種植海馬齒生態(tài)浮床不僅增加了池塘中的浮游生物多樣性也降低了有機(jī)質(zhì)含量。吳英杰等[14]利用北美海蓬子生態(tài)浮床對養(yǎng)殖海水進(jìn)行凈化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)生態(tài)浮床對水體具有顯著的凈化效果,其中以50%的覆蓋面積對海水中的N、P以及COD去除效果最好。

本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)不同類型的功能池對海水養(yǎng)殖尾水進(jìn)行分級處理,以16S rRNA基因高通量測序技術(shù)分析水體和生物膜的微生物群落組成,以期揭示在不同處理階段中微生物菌落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本實(shí)驗(yàn)裝置采用的生物填料有彈性填料(塑料毛刷,單元直徑15 cm,中心串聯(lián)一根尼龍繩周圍呈毛刷狀)、陶粒(規(guī)格為直徑2—3 cm)以及北美海蓬子生態(tài)浮床(植株長度20—30 cm,每平方米9盆,70—80株的正方形浮床),采用這三種不同的材料構(gòu)成填料組合,對南美白對蝦的養(yǎng)殖尾水進(jìn)行凈化處理,尾水處理系統(tǒng)由沉淀池、陶粒池以及除磷池組成(圖1)。養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)總長50 m,寬7 mm,高1.2 m,總面積350 m2,在每個處理池末端設(shè)置不同高度的多個平行出水管以形成落差,最高處水位1.2 m,最低處水位0.7 m,6個處理池高度和面積一致,每個池用底部連通的隔水墻分隔成兩部分,促使水流上下流動,避免產(chǎn)生靜水區(qū)。系統(tǒng)采用序批式處理,尾水日處理量約5×105kg,水力停留時間為1h,不進(jìn)行回流。高位池養(yǎng)殖尾水由水泵抽入1號沉淀池,在高度差的作用下逐級流入后續(xù)處理池。陶粒池裝填量為35 m3;4個沉淀池全部掛上塑料毛刷,懸掛密度為每平方15根(直徑15 cm,長1.2 m),并在池底做好固定以防止毛刷漂浮;除磷池中生態(tài)浮床占30 m2,剩余空間懸掛毛刷,懸掛方式與沉淀池相同。

圖1 海水養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)Fig.1 Mariculture waste-water treatment system

1.2 樣品采集

水樣采集順序分別是進(jìn)水口(W1)、1號沉淀池(W2)、2號沉淀池(W3和W4),3號沉淀池(W5和W6)、4號沉淀池(W7)、陶粒池(W8)、除磷池(W9)。垂直采集每個處理池的進(jìn)出水口水樣,混勻后以0.45 μm孔徑的濾紙進(jìn)行抽濾后再測定水質(zhì)。水質(zhì)檢測指標(biāo)有:化學(xué)需氧量(CODMn)、懸浮物顆粒(TSS)、營養(yǎng)鹽(氨氮NH3-N、亞硝酸鹽N、硝酸鹽以及活性磷酸鹽。水質(zhì)檢測均按照國標(biāo)GB17378.4-2007海洋監(jiān)測規(guī)范方法進(jìn)行。

生物膜樣品采集主要包括塑料毛刷,陶粒以及北美海蓬子根系。塑料毛刷的樣品采集順序?yàn)?號沉淀池(MS1和MS2)、2號沉淀池(MS3和MS4)、3號沉淀池(MS5和MS6)、4號沉淀池(MS7和MS8)以及除磷池(MS9),毛刷通過無菌剪剪下3根,長度為5 cm;陶粒樣品采集自陶粒池,按進(jìn)水先后順序編號C1和C2,每個處理池各隨機(jī)采集等重且規(guī)格一致的陶粒5顆;北美海蓬子根系樣品采集自除磷池生態(tài)浮床,隨機(jī)采集20 g根系(編號為Root1)。

1.3 環(huán)境基因組提取及高通量測序

將生物填料樣品用無菌生理鹽水沖洗,使用SB-5200DT超聲波清洗機(jī)(40 kHz,15min)分離生物填料上的生物膜,用0.22 μm孔徑的濾膜(MF-MillipoteTM,Ireland)對超聲后的懸液進(jìn)行抽濾,待液體不能被過濾之后保存濾膜,抽濾后留在濾膜上的樣品即生物膜;水樣微生物采集用相同的濾膜對水進(jìn)行抽濾,每個樣品均保存濾膜2片,抽濾結(jié)束后將濾紙保存于-80℃超低溫冰箱,用以后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

生物膜DNA的提取采用水樣基因組DNA快速提取試劑盒,將濾膜剪碎之后用試劑盒Water DNA kit(Omega)進(jìn)行提取。在完成基因組DNA抽提后,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。使用ABI GeneAmp?9700型PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增16S rRNA的V4+V5區(qū),采用TransStart Fastpfu DNA聚合酶,引物序列為515F:5′-GTGCC AGCMGCCGCGG-3′;907R:5′-CCGTCAATTCMT TRAGTTT-3′。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收。將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)檢測定量,之后按照每個樣本的測序量要求,進(jìn)行相應(yīng)比例混合,構(gòu)建Miseq基因文庫。

1.4 Illumina數(shù)據(jù)分析

高通量測序平臺為Illumina Miseq PE250,Miseq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾,區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析以及物種分類學(xué)分析。OTU(Operational Taxonomic Units)指的是在遺傳學(xué)的研究中,為了便于分析人為的給某一分類單元設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志,通?？梢哉J(rèn)為一個OTU代表一種微生物。利用Uparse Version(7.0.1001)對所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類,通常將高于97%相似性的非重復(fù)序列進(jìn)行聚類,在聚類過程中去掉嵌合體得到OTU代表序列。隨后再對OTU表進(jìn)行篩選,保留了至少3個樣本中序列數(shù)都大于等于5的OTU以及序列數(shù)總和大于等于20的物種,以此得到有效序列[15]。分析物種結(jié)構(gòu)組成時,為防止葉綠素干擾,去除OTU中的葉綠體以及豐度較低物種之后,再對OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

使用QIIME軟件分析α-生物多樣性,R語言分析β-生物多樣性,R語言的“Indicspecies”包分析基于指示值挑選顯著性(P＜0.05)的標(biāo)志物種,以STAMP軟件對指示種作多組別比較分析,用Canoco軟件作冗余分析(Redundancy Analysis,RDA)篩選與細(xì)菌群落變異相關(guān)的主要環(huán)境因子。

2 結(jié)果

2.1 測序質(zhì)量分析

對測序結(jié)果的微生物序列進(jìn)行分析(表1),21個樣品總共得到的有效序列數(shù)是932158條,平均有效序列數(shù)是(44388±8392)條,序列的有效覆蓋率全部達(dá)到98%以上,在測序條數(shù)達(dá)到30000條以上時Sobs稀釋性曲線趨于平穩(wěn),表明測序數(shù)據(jù)合理,因此該測序結(jié)果能夠較好地反映微生物的組成狀態(tài)。測序結(jié)果總共發(fā)現(xiàn)3781種OTU,水體樣品平均OTU數(shù)為(834±208)種,生物膜樣品組(生物膜樣品組是對毛刷、陶粒及根系樣品的總稱)平均OTU數(shù)為(1489±432)種,水體樣品中平均OTU數(shù)值明顯少于生物膜樣品(P＜0.05)。

表1 各樣品高通量測序數(shù)據(jù)結(jié)果分析Tab.1 Analysis of high-throughput sequencing data of each sample

2.2 α-生物多樣性分析

對篩選出來的細(xì)菌OTU序列結(jié)果進(jìn)行分析計(jì)算,得出相關(guān)α-多樣性指數(shù)(圖2),采用群落豐富度指數(shù)Chao和Ace、群落多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和文庫覆蓋率對養(yǎng)殖尾水系統(tǒng)內(nèi)浮游生物群落進(jìn)行評估。結(jié)果顯示,Shannon指數(shù)平均值為4.77±0.93,毛刷組隨著系統(tǒng)運(yùn)行先增大后減小,平均值為5.32±0.88,水樣組總體呈現(xiàn)先增大后減小,平均值3.99±0.39,陶粒組均值為5.49±0.25;Simpon指數(shù)平均值為0.04±0.04,毛刷組先減小后增大平均值為0.03±0.04,水樣組總體先增大后減小平均值為0.06±0.03,陶粒組平均值為0.01±0.01;Ace指數(shù)平均值為1610.10±473.17,毛刷組先增大后減小,平均值為1802.98±493.29,水樣組平均值為1331.93±266.79,陶粒組平均值為1605.63±47.91;Chao指數(shù)平均值為1562.38±506.22,毛刷組先增大后減小平均值為1894.69±548.76,水樣組平均值為1214.17±247.48,陶粒組平均值為1668.84±60.84。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

為了解樣品中細(xì)菌共有情況,繪制了Venn圖(圖3,未去除葉綠體序列)。結(jié)果顯示,樣品中總OTU出現(xiàn)于所有樣品的核心共有菌為546種,生物膜之間共有細(xì)菌有699種,僅出現(xiàn)于生物膜的核心共有菌為153種。生物膜組與水樣組中共有菌群最多的是毛刷組,最少的是根系組。毛刷組(2898種)和水體組(2415種)中細(xì)菌OTU總數(shù)較多,數(shù)量幾乎是陶粒(1768種)和北美海蓬子根系(1253種)的兩倍,但樣品OTU均值卻未明顯高于陶粒和海蓬子根系,而且生物膜與水樣之間共有菌數(shù)量從大到小依次是毛刷組、陶粒組以及根系組。

圖2 α-多樣性指數(shù)分析圖Fig.2 α-diversity index analysis chart

圖3 樣品中微生物組成分布Venn圖Fig.3 Venn diagram of the distribution of microbial composition in samples

經(jīng)過物種注釋(去除了葉綠體序列),在門分類水平上,以物種在樣品中的相對豐度構(gòu)建柱形圖(圖4),樣品中主要細(xì)菌類群為:變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)及浮霉菌門(Planctomycetes),平均相對豐度分別為(46.08±7.87)%、(24.43±8.87)%、(8.23±5.91)%和(7.09±5.68)%,生物膜和水樣之間差距大導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差偏大。變形菌門中以α-變形菌和γ-變形菌兩種細(xì)菌含量最高,在變形菌門中平均所占的比例分別為(58.93±19.63)%和(27.37±12.77)%。

在生物膜樣品中的菌群分布較水樣中更加復(fù)雜,菌群分布具有明顯差異。浮霉菌門、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、Verrucomicrobia門、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、Ignavibacteriae門及酸桿菌門(Acidobacteria)在生物膜中含量較高,而水樣中放線菌門(Actinobacteria)相較于生物膜豐度更高。

圖4 微生物門水平(Phylum)上的物種相對豐度柱形圖Fig.4 Community barplot analysis on the phylum level

硝化作用在水處理過程中具有非常重要的作用,在本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中主要的硝化菌是亞硝化單胞菌屬和硝化螺旋菌(Nitrospirae),它們被認(rèn)為是去除含氮污染物的重要菌群,在系統(tǒng)中主要分布在生物膜中,主要在黏土陶粒C1(1.01%,1.78%)和C2(0.28%,0.71%)及北美海蓬子根系(0.05%,1.67%)中含量較高,塑料毛刷和水樣中含量極低。

其他一些常見菌種在尾水系統(tǒng)中分布也有較大差異,如綠彎菌門,在生物膜和水樣中占比分別為4.44%和0.15%,該菌種主要分布在生物膜上,可能是生物膜骨架的基本組成成分;作為有機(jī)高分子的分解者黃桿菌綱(Flavobacteriia),在尾水系統(tǒng)中每個處理池中均有發(fā)現(xiàn),平均占比10.05%;芽孢桿菌(Bacillus)是水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的益生菌,在各處理池中檢測到的豐度均較低(陶粒組平均2.96%,毛刷組0.19%,水樣組0.28%,根系0.31%),而且在陶粒樣品C2中含量最高(C1中0.07%,C2中5.84%)。

2.4 β-生物多樣性分析

NMDS分析為了解不同樣本之間的差異性,對水體和生物膜進(jìn)行聚類分析,基于Bray-Curtis和Unweighted-Unifrac 兩種距離算法對尾水系統(tǒng)中的樣品進(jìn)行分析(圖5和圖6),在兩個圖中樣品均被分成兩個部分,表明了水體和生物膜上菌群群落組成具有明顯差別。在水樣中,樣品W1(進(jìn)水口)和W7(4號沉淀池)具有明顯的差異性,與其他樣品點(diǎn)的相對距離較遠(yuǎn);在生物膜樣品中,MS1、MS2、MS8和MS9與其他樣品均距離較遠(yuǎn),這可能是尾水系統(tǒng)中不同處理階段導(dǎo)致,陶粒以及北美海蓬子根系因?yàn)檩d體材料的不同,與塑料毛刷樣品點(diǎn)也相距較遠(yuǎn)?；趦煞N算法下的壓力系數(shù)(Stress)均小于0.2,表明結(jié)果具有較好的擬合度,能夠準(zhǔn)確地反映系統(tǒng)內(nèi)菌群的組成情況。

RDA排序分析根據(jù)表2分析結(jié)果顯示,尾水系統(tǒng)中對菌群分布產(chǎn)生最大的影響因子為磷酸鹽,磷酸鹽對整個菌群的影響具有顯著性相關(guān)關(guān)系(P＜0.05),其他環(huán)境因子對菌群結(jié)構(gòu)無顯著性影響(P＞0.05)(水質(zhì)檢測結(jié)果見表3)。根據(jù)圖7中樣品點(diǎn)在圖中占據(jù)的位置,可以分成4個部分:在尾水系統(tǒng)中分布靠前的MS1和MS2;處于系統(tǒng)中部的MS3,MS4和MS5;處于靠后位置的MS6、MS7、MS8、C1、C2及單獨(dú)的MS9。這反應(yīng)了在系統(tǒng)前期處理階段中,以化學(xué)需氧量作為主要的影響因子,到了處理階段后期影響較大是磷酸鹽和氨氮。

不同功能組的指示物種分析指示種可以用來反映自然環(huán)境的變化狀況,可以通過指示值(IndVal)方法進(jìn)行計(jì)算,該方法最早于1997年由Dufrêne 和Legendre提出[16],由于這種方法可以將某種環(huán)境狀態(tài)內(nèi)具有高專一性和高忠實(shí)性的物種篩選出來,對環(huán)境變化具有較好指示效果,因而被廣泛用于生物指示的研究中[17,18]。

圖5 基于Bray-Curtis距離NMDS分析Fig.5 NMDS analysis(based on the Bray-Curtis distance)

圖6 基于Unweighted-Unifrac距離NMDS分析Fig.6 NMDS analysis(based on the Unweighted-Unifrac distance)

表2 RDA排序分析環(huán)境因子表Tab.2 The environmental factors in RDA analysis

表3 水質(zhì)檢測結(jié)果Tab.3 The result of water quality

通過物種指示值進(jìn)行計(jì)算,對采集的樣品在P＜0.05顯著性水平上進(jìn)行指示種挑選,在屬水平上共選出160種細(xì)菌OTU,這160個物種主要屬于變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門及放線菌門,為了解這些物種在系統(tǒng)中分布情況,將其進(jìn)行聚類分析(圖8)。根據(jù)聚類結(jié)果可以明顯看出指示種被分成不同部分,不同材質(zhì)樣品被分成3組:黏土陶粒組、塑料毛刷和北美海蓬子根系組以及水樣組;同種材質(zhì)的樣品(主要是毛刷組和水樣組)按照其在系統(tǒng)中的處理階段被分開聚類(按處理前中后三階段將較為相似的樣品聚類到一起)。

采用STAMP軟件在P＜0.05顯著性水平對挑選出來的160種細(xì)菌在綱(Genus)水平上作熱圖分析(圖9),可以看出樣品的主要差異物種屬于藍(lán)細(xì)菌、α-變形菌(Alphaproteobacteria)及γ-變形菌(Gammaproteobacteria);浮霉菌、黃桿菌及δ-變形菌(Deltaproteobacteria)相對差異較小。

3 討論

3.1 水處理階段和載體對微生物群落的影響

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,高通量測序方法已經(jīng)逐漸成為研究微生物群落的主要手段,通過對16S rRNA基因測序分析可以獲得大量有效序列,包括那些非可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)據(jù),這就使得可以更加深入地探索微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。對高通量測序而言,測序的數(shù)量和深度是影響測序結(jié)果的主要因素。在本研究中,對序列采取隨機(jī)抽樣以及它們所表示的OTU數(shù)構(gòu)建Sobs稀釋曲線,在稀釋曲線中隨著抽取序列數(shù)的增加而曲線逐漸趨向平坦,這表示本次測序數(shù)據(jù)可以反映樣本的真實(shí)情況。

本實(shí)驗(yàn)尾水系統(tǒng)采用序批式處理,尾水通過不同類型的功能池分級處理,不同類型功能池中微生物群落分布具有較大差異。從Shannon指數(shù)圖變化可以看出,在尾水剛進(jìn)入處理系統(tǒng)時,由于水體之間混合作用以及尾水富營養(yǎng)的特點(diǎn)改變了生活環(huán)境,導(dǎo)致細(xì)菌不適應(yīng)而豐度減少,隨著處理池中營養(yǎng)被分解利用,細(xì)菌生長恢復(fù)并緩慢上升,這與毛刷中菌群變化不同,毛刷生物膜菌群在尾水高營養(yǎng)條件下迅速繁殖,但是在生物膜成熟的同時也伴隨著菌膜脫落,脫落的細(xì)菌一部分死亡,另一部分則在水體中存活而導(dǎo)致水中豐度增加,因此這可以解釋為什么在水中的營養(yǎng)被消耗殆盡之后,同一個處理池中水樣W7 的Shannon指數(shù)出現(xiàn)上升而毛刷MS8的Shannon指數(shù)出現(xiàn)下降的情況。陶粒內(nèi)外表面孔隙率較高且粗糙,對水體中有機(jī)物和細(xì)菌具有較強(qiáng)吸附效果[19],Shannon指數(shù)上陶粒高于水樣的原因可能是陶粒為細(xì)菌的生長提供了充分的載體。北美海蓬子根系的菌落豐度也大于水體,其原因可能是因?yàn)橹参锔底鳛橐粋€有機(jī)體,形成了其特有的根際微生物群落,從而導(dǎo)致了菌群差異。

圖7 生物膜樣品與水環(huán)境的RDA排序圖Fig.7 RDA ordination biplot between biofilm samples and environmental factors in the system

圖8 指示物種Cluster聚類分析圖Fig.8 Indicator species cluster analysis

為了解不同載體材料對菌群的影響,通過基于Bray-Curtis以及Unweighted-Unifrac距離來分析遺傳進(jìn)化和群落結(jié)構(gòu)關(guān)系,對比生物膜在該算法下的距離位置,發(fā)現(xiàn)與分析結(jié)果是相似的。在本研究結(jié)果中不同處理階段及不同材質(zhì)的生物膜樣品在NMDS圖中均相距較遠(yuǎn),在樹狀聚類圖中也分別進(jìn)行聚類。水樣組也有同樣的結(jié)果,根據(jù)處理階段具有不同的表現(xiàn)。同時利用距離矩陣對毛刷和水樣的菌落結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)其組內(nèi)變化無顯著差異(P＞0.05),這意味著整個水處理過程中,環(huán)境變化對毛刷生物膜和水體中菌群動態(tài)變化的影響程度是類似的,而造成群落之間差異的主要原因是載體材料不同。生物填料為生物膜的培養(yǎng)提供了附著條件,不同類型的載體材料由于內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其物理性質(zhì)不一樣,選擇性地篩選水體中的細(xì)菌作為附著細(xì)菌,生物填料通過富集作用導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)含量不同,從而造成了菌落在生物膜與水體之間的差異性。生物填料差異性在不同組分之間的共有菌群占比上也有體現(xiàn),毛刷(49.21%)、陶粒(32.53%)與水體的共有菌占比較高,說明該類型生物膜是通過富集水體菌群提供了強(qiáng)化的水凈化能力;然而,根系與水共有菌占比低(19.25%),這可能是根際微生物引起的菌群結(jié)構(gòu)差異,同時也暗示了根際生物膜可能具有不同于無機(jī)物填料生物膜的水處理能力。

3.2 不同水處理階段生物膜中的氮循環(huán)相關(guān)菌群

水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水中含有大量的氮元素,氮的轉(zhuǎn)化涉及了微生物的固氮、硝化與反硝化作用等,地球氮循環(huán)主要就是由微生物介導(dǎo),其中起著重要作用的一類菌群就是變形菌門[20—22]。α-變形菌綱包含許多固氮細(xì)菌;β-變形菌綱(Betaproteobacteria)中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)是常見的氨氧化菌;反硝化作用是生物脫氮的關(guān)鍵步驟,關(guān)系到廢水處理系統(tǒng)的除氮效率,負(fù)責(zé)反硝化作用的細(xì)菌主要分布于α-變形菌綱和β-變形菌綱[23];γ-變形菌和δ-變形菌綱主要是兼性異養(yǎng)細(xì)菌,可以通過有氧和無氧呼吸對有機(jī)物進(jìn)行分解代謝[24]。硝化細(xì)菌在水體氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽之間相互轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著不可替代的作用,硝化細(xì)菌由氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌兩類菌群組成,其中的亞硝化單胞菌屬、亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)、亞硝化弧菌屬(Nitrosovibrio)、亞硝化球菌屬(Nitrosocuccus)和亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)是常見的氨氧化菌,亞硝酸鹽氧化菌中的硝酸桿菌屬(Nitrobacter)、硝化球菌屬(Nitrococcus)、硝化螺菌屬(Nitrospira)和硝化刺菌屬(Nitrospina)在氧化亞硝酸鹽上發(fā)揮著重要作用[25]。

圖9 指示種按綱水平(Class)在不同樣品中的分布熱圖Fig.9 The heatmap of indicator species in different samples on class level

在本研究中海水養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)的氨氧化菌主要是亞硝化單胞菌屬,亞硝酸鹽氧化菌是硝化螺菌屬,在尾水系統(tǒng)中主要分布在黏土陶粒以及北美海蓬子根系中,在陶粒和根系樣品中占比分別是2.79%(C1)、1.00%(C2)以及1.72%(Root);塑料毛刷中有少量的亞硝化單胞菌屬分布,水樣中硝化細(xì)菌檢出極低,因此在尾水處理系統(tǒng)中陶粒和北美海蓬子根系可能是進(jìn)行硝化作用的主要場所。從黏土陶粒上硝化菌的比例來看,一級陶粒池生物膜上硝化細(xì)菌含量最多,二級陶粒池和除磷池中的硝化細(xì)菌含量較為接近,因此一級陶粒池硝化作用可能強(qiáng)于二級陶粒池以及北美海蓬子生態(tài)浮床。

除了變形菌的反硝化作用,有研究發(fā)現(xiàn)生物膜中還存在著其他菌群可以穩(wěn)定硝酸鹽濃度[26,27]。黃桿菌存在于生物膜內(nèi)層,在缺氧條件下可以利用硝酸鹽或者亞硝酸鹽進(jìn)行無氧呼吸,在去除氮同時也可以氧化有機(jī)質(zhì),這種被稱為異化性硝酸還原作用[28],黃桿菌在所有樣品中平均占比10.05%,在一定條件下它們也將發(fā)揮著凈化水體氮元素的職能。屬于厚壁菌門的芽孢桿菌是一種益生菌,它們也可以通過自身代謝顯著降低水體中的亞硝酸鹽濃度[29],孟睿等[30]用芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)菌種對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水進(jìn)行控制處理,發(fā)現(xiàn)廢水中的COD和亞硝酸鹽濃度明顯降低;王亞南等[31]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌在近海養(yǎng)蝦場底泥中具有超過50%的生物量,其中有一部分細(xì)菌具有還原硝酸鹽降低氮素含量的作用。芽孢桿菌在尾水系統(tǒng)中均有分布但是含量較低,在陶粒池中含量最高(陶粒組平均2.96%,毛刷組0.19%,水樣組0.28%,根系0.31%)。有研究指出[32],與水質(zhì)凈化具有相關(guān)聯(lián)的菌群中仍存在著大量不能培養(yǎng)或未分類鑒定的物種,這些功能性菌群的生長在維持水體氮平衡中起著至關(guān)重要的作用。

3.3 水處理系統(tǒng)指示物種

由于不同階段水處理過程中群落結(jié)構(gòu)存在顯著性差異,我們篩選出160種指示物種,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)篩選出來的指示物種能夠明顯地區(qū)分出樣品的來源與功能(圖8和圖9),因此,指示物種的豐度變化可以用來作為區(qū)分樣品來源和載體材質(zhì)的指標(biāo),同時也可以用來反映尾水系統(tǒng)中生物膜的成熟度和穩(wěn)定性。熱圖分析顯示指示種中差異最大的是藍(lán)細(xì)菌,聚球藻(Synechococcus)是其中差異最大的物種,大部分聚球藻可以利用硝酸鹽和氨作為他們生長所需的氮源,處理前期高濃度營養(yǎng)提供了合適的生長環(huán)境,是提供初級生產(chǎn)力的重要貢獻(xiàn)者。除了藍(lán)細(xì)菌,其次是α-變形菌綱和γ-變形菌綱,這兩類變形菌中的主要差異菌有紅桿菌科(Rhodobacteraceae)、交替假單胞菌科(Idiomarinaceae)以及著色菌科(Chromatiaceae)。除此之外,篩選出來的物種還有一部分未能分類鑒定,這些菌種缺乏相關(guān)資料文獻(xiàn)作為參考,其功能都有待進(jìn)一步去驗(yàn)證,這些敏感物種可能是作為評價不同階段下水處理效果的一個生物學(xué)指標(biāo),是改進(jìn)尾水處理系統(tǒng)的參考依據(jù)之一。

4 結(jié)論

在海水養(yǎng)殖尾水系統(tǒng)中,微生物群落主要為變形菌門、擬桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門、放線菌門、浮霉菌門和酸桿菌門。在不同水處理階段中,微生物多樣性指數(shù)總體呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢,表明養(yǎng)殖尾水中營養(yǎng)元素被充分利用,有機(jī)污染物也得到了有效降解。同一階段中生物膜載體材料不同是影響菌群結(jié)構(gòu)的主要因素。北美海蓬子根系和黏土陶粒生物膜中硝化細(xì)菌豐度占比遠(yuǎn)高于其他功能單元,是硝化作用的主要發(fā)生場所。系統(tǒng)前半段,化學(xué)需氧量是微生物組成主要影響因子,處理后半段影響較大是磷酸鹽和氨氮。通過物種指示值篩選出160種指示OTU,主要屬于變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門以及放線菌門,這些指示生物可能是作為評價海水養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)的指標(biāo),為水處理系統(tǒng)改進(jìn)提供參考依據(jù)。