利用Tet-On系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達Pdx1的小鼠ESC細胞株*

鐘 娃， 夏忠勝， 于 濤， 倪楚燕， 黎潔瑤， 陳其奎

（中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510120）

胰腺干細胞屬于未分化細胞，具備分化為胰腺內(nèi)分泌細胞、腺泡細胞和導(dǎo)管細胞的潛能，可以表達干細胞的一些分子標志，但尚未發(fā)現(xiàn)其特異性分子標志［1］。近年來研究認為，胰十二指腸同源異形框1（pancreatic and duodenal homeobox 1，Pdx1）是胰腺干細胞分子標志之一。Pdx1 是胰腺發(fā)育早期、β 細胞分化及成熟胰島細胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子［2］。Pdx1可以誘導(dǎo)內(nèi)胚層向胰腺定向發(fā)育和成熟，其活化可促進胰島素、生長抑素、葡萄糖激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運因子2 和胰島淀粉樣多肽等細胞重要基因的表達［3］。在胚胎發(fā)育早期，敲除Pdx1后導(dǎo)致小鼠胰腺發(fā)育不良［4］。在胚胎發(fā)育晚期，敲除Pdx1將影響 β 細胞的成熟，使小鼠糖耐量異常、血糖升高［5］。因此，Pdx1+細胞可以認為是胰腺的前體細胞。本研究采用Tet-On 系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達Pdx1的小鼠胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）株，實現(xiàn)Pdx1基因的定時、定點和定量表達，為下一步通過調(diào)控表達Pdx1誘導(dǎo)胰腺前體細胞分化奠定了基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細胞 小鼠ESC 名稱：ES-E14TG2a；小鼠品系：129/Ola，購于 American Type Culture Collection（ATCC）。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基（Gibco BRL）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于Biochrom；白血癥抑制因子（leukemia inhitory factor，LIF）購于Millipore；限制性內(nèi)切酶（NEB）；In-Fusion?PCR Cloning Kit（Clontech）；Taq polymerase（Sino-Bio）；Lipofectamine 2000、目的基因引物和 Trizol（Invitrogen）；293T 細胞、嘌呤霉素、強力霉素和大腸桿菌菌株DH5α（吉凱基因公司）；PrimeScriptTMRTPCR Kit 和 SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ（TaKaRa）；小鼠抗小鼠Pdx1 單克隆抗體（R&D）；Annexin V-FITC/PI 試劑盒（Becton Dickinson）；RNA 引物（上海生工生物技術(shù)有限公司）；羊抗兔IgG、兔抗小鼠IgG 和兔抗小鼠GAPDH 單克隆抗體（CST）。流式細胞儀（BD Biosciences）；LightCycler 480 熒 光 定 量 PCR 儀（Roche）；熒光顯微鏡（Olympus）。

2 方法

2.1 小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng) 小鼠ESC 在無飼養(yǎng)層細胞中貼壁培養(yǎng)，以高糖DMEM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10% FBS、0.12%碳酸氫鈉、0.1 mmol/L 非必需氨基酸、10 mmol/L HEPES、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、1×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素和 1×107U/L LIF，放在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，每天觀察并換液，2～3 d傳代1次［6］。

2.2 采用Tet-On 系統(tǒng)構(gòu)建具有綠色熒光蛋白標記及嘌呤霉素抗性的Pdx1過表達慢病毒載體 基因名稱：Pdx1（NM_008814），載體名稱：GV347（圖1）。元件順序：TetIIP-MCS-EGFP-3FLAG-Ubi-TetR-IRESPuromycin，克隆位點是AgeI/AgeI。首先，化學(xué)合成目的基因Pdx1序列，用AgeI/AgeI 酶切化學(xué)合成的含有Pdx1的質(zhì)粒；其次，通過將PCR 產(chǎn)物連接入線性化表達載體從而構(gòu)建Pdx1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞，熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達，Western blot 檢測Pdx1蛋白的表達；最后，將編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝元件載體質(zhì)粒，按Lipofectamine 2000 使用說明共轉(zhuǎn)染293T 細胞，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，在293T 細胞中測定并標定病毒滴度。

Figure 1.The lentiviral vector GV347.圖1 病毒載體GV347

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染ESC 實驗分為空白對照組（ESC組）、空載慢病毒對照組（PDX1-ESC 組）和Pdx1慢病毒轉(zhuǎn)染組（PDX1+ESC 組）。將1×105個胚胎干細胞接種于6 孔板培養(yǎng)板中，培養(yǎng)16 h 后細胞融合度達20%～30%時用于轉(zhuǎn)染。換無血清培養(yǎng)基，加終濃度為 5 mg/L 的 polybrene，加入滴度為 1×1012TU/L 的病毒6 μL，總體積為1 mL。轉(zhuǎn)染后12 h 更換為含10% FBS 的培養(yǎng)基2 mL，每日換液。轉(zhuǎn)染后48 h，按 1∶4～1∶6 傳代，次日換液，加入嘌呤霉素至終濃度為800 μg/L。篩選2 d 后，換無嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞至密度大于80%時，按1∶4～1∶6 傳代至6孔板中。

2.4 流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細胞陽性率以及穩(wěn)定表達Pdx1的ESC 株和陰性對照ESC 株的構(gòu)建 取ESC組及2 mg/L 多西環(huán)素（doxycycline，DOX）誘導(dǎo)24 h后的 PDX1-ESC 組和 PDX1+ESC 組細胞，PBS 清洗，消化、中和、離心后取5×105個細胞，再離心、去上清，用200 μL PBS 將細胞重懸成單細胞懸液，上機檢測細胞轉(zhuǎn)染率。按上述方法調(diào)整細胞密度為1×1010/L，用流式分選儀分選PDX1-ESC 組和PDX1+ESC 組GFP+細胞，ESC 組細胞作為對照。分選后的陽性細胞立即進行離心、去上清，接種至6 孔板中培養(yǎng)，時間定義為d0。d1 加入終濃度為800 μg/L 的嘌呤霉素，每天換液。d3 可見抗性克隆。用胰酶在單克隆附近消化干凈，用10 μL 的槍頭挑取單克隆，放入96孔板培養(yǎng)。24 h 后加入終濃度為400 μg/L 的嘌呤霉素，維持篩選出單克隆，再逐漸轉(zhuǎn)入24孔板-12孔板-6孔板培養(yǎng)，逐漸擴增起來，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。經(jīng)擴增、傳代、液氮灌凍存，為下一步實驗備用。

2.5 熒光顯微鏡下觀察GFP 的表達 ESC 組、PDX1-ESC 組和PDX1+ESC 組細胞分別接種至6 孔板中，每組接種2孔，24 h后其中一孔加DOX 至終濃度為2 mg/L。24 h后在熒光顯微鏡下觀察。

2.6 RT-qPCR 檢測 Pdx1 的 mRNA 表達 Trizol試劑提取細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行擴增。PCR 擴增體系為：SYBR Premix Ex Taq（2×）10 μL，Pdx1 上、下游引物（序列見表1）各0.4 μL，cDNA 2 μL，加單蒸水7.2 μL 至總體積20 μL。擴增條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

表1 RT-qPCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.7 Western blot 檢測Pdx1 融合蛋白的表達 收取細胞加入RIPA 緩沖液提取總蛋白。采用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用1∶1 000稀釋的小鼠抗小鼠單克隆Pdx1 抗體在4℃孵育過夜。洗膜3 次后，孵育1∶1 000 稀釋的兔抗小鼠IgG，室溫1 h。以βactin 作為內(nèi)參照，進行各目的條帶灰度的半定量分析，條帶的灰度分析采用ImageJ 軟件。實驗重復(fù)3次。

2.8 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的凍存 當轉(zhuǎn)染后的ESC 擴增到密度為70%～80%時進行凍存。棄去舊液，經(jīng)清洗、消化、中和，用吸管吹打后把細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心后棄上清，加入凍存液重懸細胞，細胞濃度約為（1.0～1.2）×1010/L。把細胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中，于4℃放置30 min，再轉(zhuǎn)至-30℃放置30 min，然后轉(zhuǎn)至-80℃過夜，第2天轉(zhuǎn)移至液氮罐中保存。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間的比較采用t檢驗；多組間的比較采用方差分析后，進一步采用Bonferroni 校正的t檢驗進行各組均數(shù)間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細胞流式術(shù)檢測結(jié)果

轉(zhuǎn)染細胞用嘌呤霉素篩選2 d 后，PDX1-ESC 組陽性率為90.72%，PDX1+ESC 組陽性率為94.01%（圖2）。用流式細胞分選儀分選后，PDX1-ESC組的陽性率為97.84%，PDX1+ESC 組的陽性率為98.13%（圖3）。

2 熒光顯微鏡下觀察

不加 DOX 時，ESC 組、PDX1-ESC 組和 PDX1+ESC組均未見綠色熒光細胞；加DOX后，ESC組未見綠色熒光細胞，PDX1-ESC 組和PDX1+ESC 組均可見綠色熒光細胞（圖4）。

3 Pdx1的mRNA表達

加 DOX 后 ESC 組 和 PDX1-ESC 組 Pdx1 mRNA相對表達量的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），而PDX1+ESC 組的 Pdx1 mRNA 水平 顯 著增高（P＜0.05）；不加 DOX，則 3 組 Pdx1 mRNA 相對表達量的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05）；組內(nèi)比較，加DOX前后 ESC 組和 PDX1-ESC 組內(nèi) Pdx1 mRNA 表達量的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），而PDX1+ESC 組加DOX 后Pdx1 mRNA 表達量顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

Figure 2.The transfection efficiency of lentiviral vectors determined by flow cytometry.The blue wave crest represented negative control cells，and red wave crest represented positive transfection cells.圖2 流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細胞的比例

Figure 3.The positive cells were selected and exhibited in blue frame by flow cytometry.圖3 流式細胞術(shù)篩選陽性細胞

Figure 4.Expression of green fluorescent protein was induced by activating the Tet-On system.The scale bar=100 μm.圖4 啟動Tet-on系統(tǒng)誘導(dǎo)增強綠色熒光蛋白的表達

Figure 5.The mRNA expression of Pdx1 was induced by activating the Tet-On system.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs PDX1+ESC+DOX group.圖5 啟動Tet-on系統(tǒng)誘導(dǎo)Pdx1 mRNA的表達

4 Pdx1蛋白的表達

加 DOX 后 ESC 組 和 PDX1-ESC 組 Pdx1 蛋 白 的表達差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），而PDX1+ESC組的Pdx1 蛋白水平明顯增高（P＜0.05），在46 kD 見Pdx1蛋白表達外，在75 kD左右見Pdx1與EGFP融合蛋白表達；不加DOX，則3組Pdx1蛋白表達的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05）；組內(nèi)比較，加 DOX 前后ESC 組和PDX1-ESC 組內(nèi)Pdx1 蛋白表達的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），而 PDX1+ESC 組加 DOX 后Pdx1 蛋白表達量顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。

5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的活性及調(diào)控

3 個月后，從液氮灌取出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，復(fù)蘇后培養(yǎng)，細胞仍然存活，并受DOX調(diào)控。

討 論

Iwashita等［7］發(fā)現(xiàn)Pdx1過表達導(dǎo)致胰島相關(guān)基因的表達增強。研究表明［8］，上調(diào)Ptf1α和Pdx1可以確定胰腺發(fā)育的方向，促進胰腺組織的分化；相反，下調(diào)Pdx1啟動子活性，將誘導(dǎo)內(nèi)胚層向腸道上皮的方向分化。在定型內(nèi)胚層表達Pdx1基因是定型內(nèi)胚層向胰腺細胞方向分化的前提。所以，定型內(nèi)胚層表達Pdx1 的細胞又稱為胰腺前體細胞。為了能夠分化獲得盡可能多的胰腺樣細胞，以滿足細胞移植的需要，上調(diào)Pdx1基因在定型內(nèi)胚層的表達，讓更多的定型內(nèi)胚層細胞表達Pdx1基因，是非常關(guān)鍵的一步。

Figure 6.The protein expression of Pdx1 was induced by activating the Tet-On system.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs PDX1+ESC+DOX group.圖6 啟動Tet-on系統(tǒng)誘導(dǎo)Pdx1蛋白的表達

Gossen 等［9-10］在 1995 年提出四環(huán)素基因表達調(diào)節(jié)系統(tǒng)（Tet-On 系統(tǒng)）。在Tet-On 基因表達系統(tǒng)中，當四環(huán)素或強力霉素增加時，外源基因表達逐漸增加，正向調(diào)節(jié)基因的表達，而且，Tet-On 基因表達系統(tǒng)只對四環(huán)素或強力霉素反應(yīng)，是一個嚴密、高效的反應(yīng)系統(tǒng)，同時也是目前廣泛使用的條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)，它可以人為地控制目的基因在靶細胞里按需表達。Tet-On 系統(tǒng)已經(jīng)運用多年，并且得到了不斷的完善，構(gòu)建技術(shù)成熟。該系統(tǒng)的使用，對目的基因的調(diào)控更加便利。鐘女奇等［11］報道建立了表達Tet-On 的人肝癌細胞模型，為研究任何感興趣的目的基因的調(diào)控打下了基礎(chǔ)。在Tet-On 調(diào)控系統(tǒng)中，目的基因表達的量與DOX 的誘導(dǎo)濃度有關(guān)。通過控制DOX 的誘導(dǎo)濃度可以對目的基因?qū)崿F(xiàn)定量表達。有研究認為，DOX 的濃度在0～10 mg/L 范圍中，誘導(dǎo)濃度與目的基因表達的量成正相關(guān)，DOX 的誘導(dǎo)濃度越高，目的基因表達的量就越大［12］。但不同的細胞對DOX 濃度的承受能力是不同的。有研究［13］用濃度為 1 mg/L 的 DOX 誘導(dǎo)目的基因在胚胎干細胞中的表達。D′Alessandro 等［14］用 2.5 mg/L 的DOX 誘導(dǎo)目的基因在腫瘤細胞中表達。我們在預(yù)實驗中曾試用3 mg/L 的DOX 誘導(dǎo)Pdx1在胚胎干細胞中的表達，結(jié)果細胞狀態(tài)差，大部分死亡。通過不同濃度的嘗試，最后用DOX 終濃度為2 mg/L 誘導(dǎo)Pdx1的表達，細胞保持良好的增殖狀態(tài)。在Tet-On 調(diào)控系統(tǒng)中，目的基因表達的量與DOX 的誘導(dǎo)時間亦有關(guān)系。Kumar 等［12］加入 DOX 后 0～24 h 誘導(dǎo)目的基因表達，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時間的延長，目的基因表達的量增加。本實驗中，我們采用DOX 誘導(dǎo)24 h 上調(diào)Pdx1表達。我們可以通過嘌呤霉素對感染的細胞進行篩選，篩選出成功轉(zhuǎn)染Pdx1基因的具有嘌呤霉素抗性的細胞。在篩選實驗前，我們先對未轉(zhuǎn)染的胚胎干細胞進行預(yù)實驗。用終濃度分別為100 μg/L、200 μg/L、300 μg/L、400 μg/L、500 μg/L、600 μg/L、700 μg/L、800 μg/L 和900 μg/L 的嘌呤霉素培養(yǎng)胚胎干細胞，2 天后，嘌呤霉素終濃度為 800 μg/L 培養(yǎng)的細胞，有大于80%的胚胎干細胞死亡，該濃度為嘌呤霉素的最佳篩選濃度。本實驗，我們構(gòu)建單質(zhì)粒模式的、具有綠色熒光蛋白標記及嘌呤霉素抗性的Tet-On調(diào)控系統(tǒng)Pdx1過表達慢病毒載體，并且感染胚胎干細胞。在熒光顯微鏡下觀察，加DOX 后，ESC組未見綠色熒光細胞，PDX1-ESC 組和PDX1+ESC 組均可見綠色熒光細胞；不加DOX，3 組均未見綠色熒光細胞。目的基因Pdx1位于熒光基因的上游，說明加DOX 可以誘導(dǎo)Tet-On 系統(tǒng)熒光蛋白和Pdx1的表達。RT-qPCR 和 Western blot 的 結(jié)果 發(fā)現(xiàn) ，加 DOX 后 ，PDX1+ESC組Pdx1的mRNA和蛋白表達明顯升高；不加DOX，3 組間 Pdx1 的 mRNA 和蛋白表達的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，提示本研究構(gòu)建的Tet-On 調(diào)控系統(tǒng)Pdx1過表達慢病毒載體受DOX 調(diào)控，調(diào)控正常。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株經(jīng)擴增、傳代，液氮灌凍存3 月后，取出凍存的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，復(fù)蘇培養(yǎng)，細胞仍然存活，并受DOX 調(diào)控。結(jié)果說明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株構(gòu)建成功。周光紀等［15］報道成功構(gòu)建Pdx1基因真核表達載體質(zhì)粒并且在胚胎干細胞中表達。我們進一步利用Tet-On系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達Pdx1的小鼠ESC 株，為下一步研究的實施提供了便利。

我們構(gòu)建的單質(zhì)粒模式的Tet-On調(diào)控系統(tǒng)Pdx1過表達慢病毒載體，不僅操作簡單，而且運用Tet-On調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控Pdx1在定型內(nèi)胚層的表達，實現(xiàn)了對Pdx1定時、定點、定量的調(diào)控，為進一步研究定型內(nèi)胚層向胰腺細胞分化奠定了基礎(chǔ)。