王靖舒，佟 平，陳紅兵，3，高金燕*

（1 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047 2 南昌大學(xué)食品學(xué)院 南昌330047 3 南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院 南昌330047）

食物過(guò)敏是部分特殊人群對(duì)食物產(chǎn)生的不良反應(yīng)，其發(fā)生率呈逐年升高的趨勢(shì)[1-3]。雞蛋作為世界公認(rèn)的八大類(lèi)致敏性食物之一，其過(guò)敏原多存在于蛋清中，主要包括卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白、卵類(lèi)粘蛋白和溶菌酶4 種[4-5]。其中，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（Ovotransferrin，OVT） 致敏性與卵類(lèi)黏蛋白相似，是致敏性較強(qiáng)的蛋白之一[6]。目前對(duì)OVT 的研究主要為抗菌，抗炎，抗氧化活性，免疫調(diào)節(jié)等功能特性方面[7-10]，而對(duì)其消化穩(wěn)定性、致敏性等方面了解非常有限。

過(guò)敏原蛋白耐胃、腸消化或形成較大片段，是其導(dǎo)致腸道黏膜免疫致敏的前提條件[11]，而且過(guò)敏原蛋白的胃、腸消化特性是食物過(guò)敏的關(guān)鍵因素[12]。小腸作為食物消化吸收中最主要的部分，主要分為腸腔消化和黏膜消化。小腸刷狀緣膜酶（Small intestinal brush border membrane enzyme，簡(jiǎn)稱(chēng)BBM 酶） 是小腸刷狀緣表面的一種消化酶，能夠逐步分解多數(shù)小肽段和一部分多肽段[13]，被應(yīng)用于很多研究[14-15]。曾有學(xué)者指出[16-17]，小腸粘膜期是蛋白質(zhì)消化的重要環(huán)節(jié)，BBM 酶包括氨肽酶A、氨肽酶N、膜甘氨酰亮氨酸肽酶、二肽基肽酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、羧基酞酶和鋅穩(wěn)定性天冬氨酰賴(lài)氨酸肽酶等7 種類(lèi)型，主要與各類(lèi)寡肽和二肽的水解、氨基酸吸收和二肽轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。James 等[18]也曾指出，黏膜消化是各種養(yǎng)分的最終消化階段，腸黏膜是所有養(yǎng)分的最終消化場(chǎng)所。目前有關(guān)BBM 酶進(jìn)一步消化OVT 的胃-小腸消化產(chǎn)物的研究鮮有報(bào)道。

結(jié)合OVT 的研究現(xiàn)狀及嬰幼兒、成年人的胃、腸發(fā)育狀況，本研究在體外靜態(tài)消化模式下，分別模擬嬰幼兒和成年人胃液、小腸液以及BBM酶對(duì)OVT 的消化。采用Tricine-SDS-PAGE 和MALDI-TOF-MS 結(jié)合方法分析各消化階段的產(chǎn)物，探討各階段不同條件下消化產(chǎn)物的變化，旨在闡明OVT 的胃、腸消化特性，為進(jìn)一步理解嬰幼兒與成年人食物過(guò)敏的差異性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)與試劑

新鮮雞蛋，市售。

DEAE-Sepharose Fast Flow，美國(guó)GE 公司；胃蛋白酶等消化酶及消化所需其它試劑，美國(guó)Sigma 公司；BBM 酶（活性為0.072 U/mg 蛋白），南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制；SDS-PAGE 凝膠配制所用試劑，上海生工生物工程有限公司；大分子預(yù)染蛋白Marker、小分子非預(yù)染蛋白Marker，美國(guó)Thermo 公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA），日本島津公司；HCl、NaHCO3、NaCl、NaOH、冰乙酸、無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 設(shè)備與儀器

DHL-A 電腦恒流泵、HD-21 核酸蛋白檢測(cè)儀、數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器、TH-500 梯度混合儀，上海青浦滬西儀器廠；N2000 色譜工作站，浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司；Mini 蛋白電泳儀、GS-800 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；MAL DI-TOF-MS 質(zhì)譜儀，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（OVT） 的分離純化 參考佟平[19]的蛋清預(yù)處理及分離純化OVT 的方法，提取蛋清蛋白，采用濃縮膠濃度4%、分離膠濃度12%的SDS-PAGE 對(duì)各洗脫峰進(jìn)行鑒定，收集純度符合試驗(yàn)條件的OVT 提取液進(jìn)行超濾濃縮，最終采用BCA 試劑盒測(cè)定濃縮的OVT 提取液濃度。

1.3.2 體外模擬嬰幼兒及成年人胃腸消化 參考Dupont 等[20]的方法，稍作改進(jìn)，并設(shè)置不同條件進(jìn)行胃、腸消化過(guò)程，具體如下。

1.3.2.1 體外模擬嬰幼兒胃腸消化 胃消化不同時(shí)間條件：pH 2.5，胃蛋白酶（22.75 U/mg 蛋白），75 mmol/L NaCl，37 ℃分別孵育0，30，60，90，120 min。取5 支10 mL EP 管，先后加入模擬胃液1 mL 和1 mg/mL OVT 提取液1 mL，混勻后進(jìn)行孵育。加入1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH 值至中性，終止消化。消化產(chǎn)物用于分析。

胃消化不同pH 值條件：胃蛋白酶（22.75 U/mg 蛋白），75 mmol/L NaCl，pH 值分別為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，37 ℃孵育1 h。取5 支10 mL EP 管，先后加入不同pH 值的模擬胃液1 mL 和1 mg/mL OVT 提取液1 mL，混勻后于37 ℃孵育1 h，加入1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH 值至中性，終止消化。消化產(chǎn)物用于分析。

腸消化不同時(shí)間條件：pH 6.5，牛α-糜蛋白酶（0.04 U/mg 蛋白），豬胰蛋白酶（3.45 U/mg 蛋白），1 mmol/L 牛黃膽酸鈉，1 mmol/L 甘氨脫氧膽酸鈉，26.1 mmol/L Bis-Tris 緩沖液，37 ℃分別孵育0，30，60，90，120 min。取5 支10 mL EP 管，先后加入嬰幼兒模擬胃液1 mL 和1 mg/mL OVT 提取液1 mL，混勻后于37 ℃孵育1 h，加入適量1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH 值至中性。再加入嬰幼兒模擬腸液2 mL，37 ℃孵育一定時(shí)間后，100 ℃恒溫加熱5 min，終止反應(yīng)。消化產(chǎn)物用于分析。

1.3.2.2 體外模擬成年人胃腸消化 胃消化不同時(shí)間條件：pH 2.0，胃蛋白酶（182 U/mg 蛋白），50 mmol/L NaCl，37 ℃分別孵育0，30，60，90，120 min。消化方法同1.3.2.1 胃消化不同時(shí)間條件。

胃消化不同pH 值條件：胃蛋白酶（182 U/mg蛋白），50 mmol/L NaCl，pH 值分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，37 ℃孵育1 h。消化方法同1.3.2.1 胃消化不同pH 值條件。

腸消化條件：pH 6.5，牛α-糜蛋白酶（0.44 U/mg 蛋白），豬胰蛋白酶（34.5 U/mg 蛋白），4 mmol/L牛黃膽酸鈉，4 mmol/L 甘氨脫氧膽酸鈉，26.1 mmol/L Bis-Tris 緩沖液，37 ℃分別孵育0，30，60，90，120 min。消化方法同1.3.2.1 腸消化不同時(shí)間條件。

1.3.3 體外模擬嬰幼兒及成年人BBM 酶消化取2 支10 mL EP 管，先后加入嬰幼兒/成年人模擬胃液1 mL，1 mg/mL OVT 提取液1 mL，混勻后于37 ℃孵育1 h；加入1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至中性，再對(duì)應(yīng)加入嬰幼兒/成年人模擬腸液2 mL，混勻后37 ℃孵育1 h 后加入50 μL BBM 酶溶液，混合均勻37 ℃溫度孵育2 h，100 ℃恒溫加熱5 min 終止反應(yīng)。消化產(chǎn)物用于分析。

1.3.4 Tricine-SDS-PAGE 及MALDI-TOF-MS 分析 OVT 經(jīng)體外模擬嬰幼兒和成年人胃、小腸及BBM 酶連續(xù)消化的各階段產(chǎn)物，采用Tricine-SDS-PAGE 及MALDI-TOF-MS 分別分析。Tricine-SDS-PAGE 所用致密膠濃度為16.5%，夾層膠濃度為10%，分離膠濃度為4%，量程設(shè)置為30 V（1 h）～100 V（2 h）。MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜分析試驗(yàn)參數(shù)：線(xiàn)性正離子譜模式，N2激光源，波長(zhǎng)337 nm，離子源加速電壓25 kV，脈沖寬度3 nS，疊加108，基質(zhì)為CHCA。取樣品0.5 μL 于樣品孔中心，加入基質(zhì)0.5 μL，室溫晾干結(jié)晶后放入質(zhì)譜儀中測(cè)試。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 超濾濃縮OVT 的濃度試驗(yàn)重復(fù)3 次，利用Microsoft Excel 2010 統(tǒng)計(jì)處理，采用Origin 9.0 作圖分析。Tricine-SDS-PAGE 采用GS-800 凝膠成像系統(tǒng)成像。MALDI-TOF-MS 采用Shimadzu Biotech Launchpad 軟件采集信息并成圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 OVT 的分離純化

通過(guò)SDS-PAGE 對(duì)蛋清分離產(chǎn)物鑒定，圖1a中泳道1～2 中78 ku 處出現(xiàn)OVT 條帶且純度大于92.5%，泳道3～4 中除OVT 外含有其它蛋白，純度較低。收集符合試驗(yàn)條件（泳道1～2）的所有OVT提取液，通過(guò)超濾濃縮、BCA 試劑盒測(cè)得其質(zhì)量濃度為6.24 mg/mL。

圖1 OVT 純度鑒定（a）及濃度測(cè)定（b）Fig.1 Purity identification（a） and concentration determination（b） of ovotransferrin

2.2 OVT 在體外模擬嬰幼兒和成年人胃液中的消化

在消化過(guò)程中，胃主要通過(guò)研磨（胃竇的機(jī)械研磨）和胃分泌物的聯(lián)合作用來(lái)分解食物結(jié)構(gòu)。一般研究食物胃消化時(shí)，設(shè)置模擬胃消化時(shí)長(zhǎng)為1 h，模擬胃液pH 值多為1.5～2.5。結(jié)合嬰幼兒及成年人胃發(fā)育及胃消化特點(diǎn)，本試驗(yàn)分別設(shè)置胃消化時(shí)間和消化液pH 值梯度變化，探討不同條件對(duì)OVT 的消化影響。

2.2.1 不同消化時(shí)間對(duì)胃消化的影響

2.2.1.1 消化時(shí)間對(duì)模擬嬰幼兒胃消化OVT 的影響 體外模擬嬰幼兒胃消化不同時(shí)間，OVT 產(chǎn)物結(jié)果分析見(jiàn)圖2。圖2a 中，嬰幼兒胃消化產(chǎn)物主要分布在5～15 ku 和30～50 ku。胃消化伊始，OVT 產(chǎn)物數(shù)量多且呈彌散狀。Hoppe 等[21]發(fā)現(xiàn)OVT 在胃蛋白酶消化液（pH 1.2）中孵育30 s 消失，Wang等[22]也提到OVT 對(duì)胃蛋白酶水解較為敏感，說(shuō)明OVT 對(duì)胃蛋白酶沒(méi)有抵抗力。隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，泳道2～5 的條帶表示消化產(chǎn)物基本相同而豐度不同，產(chǎn)物中分子質(zhì)量較大的產(chǎn)物進(jìn)一步逐漸分解為分子質(zhì)量較小的蛋白。圖2b 為質(zhì)譜圖出峰范圍5～13 ku 區(qū)域。胃消化伊始，OVT 產(chǎn)物分子質(zhì)量分布在5～13 ku，6.8，7.0，7.9 ku 及10.1 ku 處離子峰信號(hào)較強(qiáng)，相對(duì)強(qiáng)度較高。隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，譜圖2～5 中10 ku 處吸收峰消失，產(chǎn)物分子質(zhì)量均分布在5～8 ku 之間，出峰趨勢(shì)相同，部分離子峰信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間變化而變化，說(shuō)明胃消化時(shí)間對(duì)消化產(chǎn)物具有一定影響。

由圖2可知，體外模擬嬰幼兒胃消化OVT 的產(chǎn)物分子質(zhì)量范圍為5～15 ku 和30～50 ku，且胃消化形成的產(chǎn)物以前者居多。隨著胃消化時(shí)間的延長(zhǎng)，OVT 在嬰幼兒模擬胃液中逐步降解，也生成了分子質(zhì)量5.5，6.8，8.4 ku 的耐消化蛋白質(zhì)。

2.2.1.2 消化時(shí)間對(duì)模擬成年人胃液消化OVT 的影響 OVT 在成年人模擬胃液中的消化產(chǎn)物分析圖見(jiàn)圖3。圖3a 中，OVT 由78 ku 大分子蛋白分解為5～14 ku 和30～50 ku 蛋白。胃消化30～120 min時(shí)，10 ku 處條帶逐漸變淺至消失，而7 ku 處條帶逐漸變深，這與劉光明等[23]體外模擬胃消化日本鰻鱺膠原蛋白的降解趨勢(shì)一致，即隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)，分子質(zhì)量較大的降解產(chǎn)物逐漸減少，分子質(zhì)量較小的降解產(chǎn)物則增加。圖3b 顯示MALDITOF-MS 出峰范圍為5～10 ku。成年人胃消化伊始，產(chǎn)物以5～8 ku 蛋白為主，而圖2b 譜圖1顯示嬰幼兒胃消化0 min 時(shí)的產(chǎn)物以6～11 ku 的蛋白居多，說(shuō)明OVT 在成年人模擬胃液中更易被降解為分子質(zhì)量偏小的蛋白，即短時(shí)間內(nèi)成年人胃消化OVT 的能力較嬰幼兒強(qiáng)。OVT 在成年人胃液中消化30 min 時(shí)，生成5.5，6.8 ku 的蛋白，產(chǎn)物種類(lèi)明顯減少。隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，5.5 ku 的蛋白未發(fā)生變化，較耐胃消化；而6.8 ku 處吸收峰消失，即該分子質(zhì)量蛋白發(fā)生酶解。

圖2 OVT 在體外模擬嬰幼兒胃液消化不同時(shí)間的產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）圖譜Fig.2 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated infant gastric juice in vitro at different times

結(jié)合圖2及圖3可知，成年人胃消化的產(chǎn)物分子質(zhì)量范圍與嬰幼兒胃消化產(chǎn)物范圍一致。在成年人胃消化60 min 時(shí)，OVT 已基本消化完全。試驗(yàn)證明OVT 可隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)在成年人模擬胃液中逐步降解，生成5.5 ku 耐胃消化蛋白。

OVT 在嬰幼兒和成年人模擬胃液中均隨消化時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降解，這與簡(jiǎn)姍[24]的研究結(jié)果一致。黃園園等[25]對(duì)甲殼類(lèi)動(dòng)物中主要過(guò)敏原原肌球蛋白進(jìn)行模擬胃消化也得出相同結(jié)論。此外，嬰幼兒和成年人消化產(chǎn)物中均含有5.5 ku 耐消化蛋白，而成年人胃消化產(chǎn)物種類(lèi)較少，這是因?yàn)閶胗變何敢褐宣}酸和各種酶的分泌均較成人少且酶活力低，導(dǎo)致消化功能差[26]。成年人各消化系統(tǒng)發(fā)育完全，體內(nèi)消化液中各成分的分泌量均高于嬰幼兒，消化功能也隨之增強(qiáng)。

圖3 OVT 在體外模擬成年人胃液消化不同時(shí)間的產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）圖譜Fig.3 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated adult gastric juice in vitro at different times

2.2.2 不同pH 值對(duì)胃消化的影響 胃功能不健全的嬰兒、胃潰瘍患者等人群在功能紊亂或胃液分泌不足時(shí)，胃液的酸度較低，對(duì)食物的消化作用有一定影響。在用餐后，人體胃液pH 值會(huì)升至3或更高[27-28]。因此，本試驗(yàn)設(shè)置梯度pH 值變化，探究模擬胃液pH 值對(duì)OVT 胃消化穩(wěn)定性的影響，并根據(jù)不同pH 值條件，消化相同時(shí)間生成的產(chǎn)物種類(lèi)、含量和較大分子質(zhì)量產(chǎn)物的降解狀態(tài)，結(jié)合已報(bào)道的胃內(nèi)正常pH 值范圍，確定OVT 在嬰幼兒及成年人胃液中最易消化的pH 值。

2.2.2.1 胃液pH 值對(duì)模擬嬰幼兒胃液消化OVT的影響 體外模擬嬰幼兒在不同pH 值條件下消化OVT 1 h 的產(chǎn)物分析圖見(jiàn)圖4。圖4a 中，嬰幼兒模擬胃液pH 值在1.5～2.5 范圍時(shí)，OVT 多被消化為5～12 ku 左右的蛋白，pH 值的升高使OVT 降解產(chǎn)物中的大分子蛋白逐步被水解為小分子蛋白，在胃液環(huán)境pH 值為2.5 時(shí)，大于10 ku 的條帶已基本消失；胃液環(huán)境pH 值為3.0 時(shí)，OVT 被消化為10～30 ku 左右的蛋白，條帶數(shù)目較多并彌散狀；pH 值為3.5 時(shí)，OVT 基本不會(huì)被消化，在78 ku 處呈清晰條帶。簡(jiǎn)姍[24]的結(jié)果也表明，在模擬胃液pH 3.5 條件下，OVT 消化2 min 后仍有大量未降解的蛋白條帶。圖4b 中，模擬胃液pH 值為3.5時(shí)，OVT 發(fā)生不完全降解，可檢測(cè)到完整的OVT蛋白和少部分經(jīng)過(guò)胃消化生成的5～10 ku 的蛋白；在pH 1.5～3.0 條件下，OVT 都能夠被消化為分子質(zhì)量為5～10 ku 的蛋白。進(jìn)一步縮小譜圖范圍至5～10 ku，得到圖4c，胃液pH 值為1.5～2.5時(shí)，OVT 胃消化產(chǎn)物基本相同，然而隨著pH 值的升高，5.5，6.8，7.7，8.4 ku 等吸收峰強(qiáng)度有所變化，說(shuō)明pH 值對(duì)胃消化具有一定影響，與其它試驗(yàn)結(jié)果一致[29-30]；在pH 3.0 條件下，OVT 胃消化產(chǎn)物的吸收峰數(shù)量減少，消化產(chǎn)物分子質(zhì)量較大，消化能力減弱。因此，OVT 在模擬胃液pH 2.5 條件下進(jìn)行消化，產(chǎn)物中較大分子蛋白減少，更容易被降解。

圖4 OVT 在體外模擬嬰幼兒胃液消化不同pH 值的產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b，c）圖譜Fig.4 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b，c） of ovotransferrin digested by simulated infant gastric juice in vitro at different pH values

圖5 OVT 在體外模擬成年人胃液消化不同pH 值的產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）圖譜Fig.5 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated adult gastric juice in vitro at different pH values

圖4說(shuō)明OVT 在pH 1.5～3.0 條件下，嬰幼兒模擬胃液中可被完全消化，在pH 3.5 條件下少部分發(fā)生消化，其中最易消化pH 值為2.5。

2.2.2.2 胃液pH 值對(duì)模擬成年人胃液消化OVT的影響 據(jù)文獻(xiàn)[31]報(bào)道，成人胃在禁食狀態(tài)下的pH 值通常為1.7～1.9。本試驗(yàn)設(shè)置成年人模擬胃液pH 值范圍為1.0～3.0，消化產(chǎn)物分析圖見(jiàn)圖5。圖5a 中，OVT 在pH 1.0～3.0 條件下均可發(fā)生降解。當(dāng)pH 值為1.0～1.5 時(shí)，OVT 被消化為8，10 ku的蛋白；隨著pH 值升至2.5，10 ku 處條帶逐漸變淺直至消失；pH 3.0 時(shí)，胃蛋白酶的活力受pH 值的影響而較弱，OVT 被酶解的程度較低，生成30 ku 的大分子片段。相同pH 值條件下，嬰幼兒胃消化產(chǎn)物種類(lèi)比成年人的多，尤其在pH 3.0 時(shí)，嬰幼兒胃消化產(chǎn)物條帶分布在10～30 ku，遠(yuǎn)大于成年人的消化產(chǎn)物范圍5～10 ku。這與成年人模擬胃液中胃蛋白酶的酶活度較高有關(guān)。因此，在相同pH 值的胃消化條件下，成年人消化能力較嬰幼兒更強(qiáng)。圖5b 中，成年人模擬胃液pH 值為1.0～1.5時(shí)，OVT 消化產(chǎn)物基本相同，而對(duì)應(yīng)離子峰強(qiáng)度不同；在pH 2.0 時(shí)，產(chǎn)物種類(lèi)明顯減少，較大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)發(fā)生降解，且在pH＞2.0 條件下，均生成5.3，5.5 ku 蛋白。因此，在pH 1.0～3.0 的消化環(huán)境中，pH 值的升高使OVT 被消化成小分子產(chǎn)物的含量有所增加。這是因?yàn)殡S著pH 值的升高，胃蛋白酶形成較少，酶活受到部分抑制，導(dǎo)致蛋白消化能力有所降低[30]。產(chǎn)物5.5 ku 處蛋白未因pH 值的變化發(fā)生降解，較耐消化。

圖5結(jié)果表示，在pH 1.0～3.0 范圍內(nèi)模擬成年人胃消化，OVT 胃消化產(chǎn)物種類(lèi)隨著pH 值的升高而減少，pH 2.0 時(shí)，OVT 最易被消化，這與胃蛋白酶在pH 2.0 附近具有最大活性密切相關(guān)[32]。Dekkers 等[33]的試驗(yàn)也表明在一定范圍內(nèi)，pH 值越高消化能力越弱，pH 值越低越有利于食物蛋白消化。比較相同pH 值條件的嬰幼兒及成年人胃消化結(jié)果，可知嬰幼兒胃消化產(chǎn)物種類(lèi)多且分子質(zhì)量相對(duì)偏大；嬰幼兒與成年人胃消化不同時(shí)間、不同pH 值條件下均生成較耐消化的5.5 ku 蛋白，該片段值得進(jìn)一步研究。

2.3 體外模擬嬰幼兒和成年人小腸液中的消化

腸道是食物消化的主要部位，食物經(jīng)胃消化后，其產(chǎn)物進(jìn)入小腸，并通過(guò)胰蛋白酶和膽汁分泌物的協(xié)同作用進(jìn)行消化過(guò)程[34]。Bourlieu 等[26]詳細(xì)研究了嬰兒和腸道狀況的生化差異，Poquet 等[32]也提到消化道不成熟致使嬰幼兒胰蛋白酶消化能力有限。根據(jù)2.2.2 節(jié)的結(jié)果，OVT 分別在嬰幼兒和成年人最易消化的pH 值條件下胃消化1 h，再進(jìn)行小腸消化，以此探討不同腸消化時(shí)間內(nèi)OVT被消化的特點(diǎn)。

2.3.1 不同消化時(shí)間對(duì)體外模擬嬰幼兒腸消化的影響 OVT 經(jīng)嬰幼兒模擬胃液（pH 2.5） 消化1 h，小腸消化不同時(shí)間的產(chǎn)物分析圖見(jiàn)圖6。圖6a中，胃-小腸消化后的產(chǎn)物分子質(zhì)量大小在3.4～10 ku 之間，較OVT 的胃消化產(chǎn)物明顯發(fā)生進(jìn)一步酶解。隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，胃-小腸消化產(chǎn)物中分子質(zhì)量偏大的產(chǎn)物含量被進(jìn)一步消化分解，如10 ku 處條帶在消化120 min 時(shí)顏色變淺。圖6b 中，不同消化時(shí)間條件下的胃-小腸消化產(chǎn)物基本相同，產(chǎn)物分子質(zhì)量分布在0.5～1.0 ku，其中0.495，0.559，0.638 ku 等肽段受消化時(shí)間影響較小，較耐消化。

圖6 OVT 在體外模擬嬰幼兒腸液消化不同時(shí)間的產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）圖譜Fig.6 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated infant intestinal fluid in vitro at different times

2.3.2 不同消化時(shí)間對(duì)體外模擬成年人腸消化的影響 OVT 經(jīng)成年人模擬胃液（pH 2.0）消化1 h，小腸消化不同時(shí)間的產(chǎn)物分析圖見(jiàn)圖7。與圖6a 相比，圖7a 中成年人胃-小腸消化產(chǎn)物分子質(zhì)量較小，基本分布在5～10 ku。小腸消化0 min 時(shí)條帶呈彌散狀態(tài)，7 ku 處有一條較為清晰的細(xì)條帶；隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，該條帶逐漸被降解。圖7b 中顯示成年人的OVT 胃-小腸消化產(chǎn)物存在分子質(zhì)量＜1 ku 的肽。小腸消化時(shí)間對(duì)OVT 胃消化產(chǎn)物被進(jìn)一步酶解的影響較小，且不同時(shí)間消化形成產(chǎn)物基本相同，主要生成0.495，0.560，0.638 ku 及0.666 ku 的小分子肽。

比較圖6及圖7可知，嬰幼兒胃-小腸產(chǎn)物分子質(zhì)量范圍相對(duì)較大，生成片段也相對(duì)較多，說(shuō)明嬰幼兒小腸消化能力相對(duì)較弱；OVT 在嬰幼兒及成年人胃液-小腸液消化后均生成0.495，0.560，0.638 ku 較耐消化的多肽，且消化時(shí)間對(duì)腸消化產(chǎn)物影響較小。Picariello 等[35]表示腸道消化基本在2 h 內(nèi)完成，在較長(zhǎng)的孵育時(shí)間內(nèi)肽型未發(fā)生明顯變化。

2.4 體外模擬嬰幼兒及成年人BBM 酶消化

經(jīng)過(guò)胃消化的食糜進(jìn)人小腸后，在胰酶作用下產(chǎn)生可吸收的終產(chǎn)物，通過(guò)上皮細(xì)胞刷狀緣膜上表達(dá)的水解酶將腸腔里的養(yǎng)分進(jìn)一步消化[36]。有報(bào)道指出[16]，食物蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)腸腔內(nèi)消化后形成的大量寡肽發(fā)生進(jìn)一步水解時(shí)，其中大部分二肽和少量三肽經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)后由細(xì)胞漿肽酶水解，而約10%二肽、60%三肽及幾乎全部三肽以上的寡肽均由BBM 酶水解，最后形成氨基酸。

圖7 OVT 在體外模擬成年人腸液消化不同時(shí)間的產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）圖譜Fig.7 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated adult intestinal fluid in vitro at different times

OVT 經(jīng)過(guò)嬰幼兒和成年人胃、小腸分別消化后，加入BBM 酶進(jìn)一步消化得到終消化產(chǎn)物，其分析圖見(jiàn)圖8。圖8a 泳道1 中，嬰幼兒胃-小腸消化產(chǎn)物分子質(zhì)量為3.4～10 ku，30～50 ku，再經(jīng)BBM 酶消化后30～50 ku 處條帶數(shù)量明顯減少，顏色變淺，僅剩5～13 ku 范圍內(nèi)少數(shù)條帶。圖8a 泳道2 顯示，成年人胃-小腸消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布范圍為5～10 ku，經(jīng)BBM 酶進(jìn)一步消化后幾乎沒(méi)有條帶，說(shuō)明OVT 被消化的較為徹底。圖8b 中，嬰幼兒和成年人的OVT 終消化產(chǎn)物分子質(zhì)量集中在0.4～0.7 ku 范圍內(nèi)，0.560 ku 肽段含量均最多，而嬰幼兒消化產(chǎn)物的種類(lèi)居多，其中最大分子質(zhì)量產(chǎn)物為0.680 ku，超過(guò)成年人產(chǎn)物中最大分子質(zhì)量產(chǎn)物（0.666 ku）。再結(jié)合圖6、圖7對(duì)比可知，0.495，0.560，0.638 ku 處片段較耐酶消化，且嬰幼兒終消化產(chǎn)物中含有耐消化的大分子蛋白，可以推測(cè)嬰幼兒更易發(fā)生OVT 的腸道黏膜免疫致敏。

OVT 經(jīng)過(guò)胃、小腸消化后，增加BBM 酶消化可明顯增強(qiáng)嬰幼兒及成年人胃-小腸消化產(chǎn)物的進(jìn)一步酶解，該結(jié)論與其它研究報(bào)道相同。Picariello 等[37]發(fā)現(xiàn)加入BBM 酶后，牛奶蛋白水解程度高達(dá)80%，由此提出在體外模擬食物蛋白消化時(shí)應(yīng)增加BBM 酶消化階段。Mamone 等[38]也證實(shí)十二指腸消化肽可被BBM 腸上皮細(xì)胞的內(nèi)/外肽酶進(jìn)一步水解為單一氨基酸或短的雙或三肽。Gianfrani 等[39]表示在模擬腸消化后增加BBM 酶消化可以降低醇溶蛋白的免疫刺激活性。游義嬌[30]在麩質(zhì)蛋白消化中加入BBM 酶消化過(guò)程，終消化產(chǎn)物中麩質(zhì)含量降低，小麥蛋白的水解度明顯提高。

圖8 OVT 在體外模擬嬰幼兒及成年人BBM 酶消化產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）圖譜Fig.8 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated infant and adult BBM in vitro

目前有關(guān)蛋白質(zhì)在體外模擬消化方法多參照美國(guó)藥典的模擬胃腸消化，或采用傳統(tǒng)的口腔-胃-腸3 步消化法，然而這些模擬消化模型提供的信息有限，只能評(píng)估蛋白質(zhì)（或大多肽）的消化率，即消化穩(wěn)定性，而忽略了腸黏膜水解酶在人體生理學(xué)中的作用[40]。結(jié)合解剖學(xué)及生理學(xué)等多方面數(shù)據(jù)，有研究[40]提出BBM 酶可輔助食物最終消化，有利于蛋白質(zhì)在人體胃腸道中的消化和吸收，且在最終消化階段發(fā)揮關(guān)鍵功能，尤其是將多肽逐漸縮短為寡肽和游離氨基酸[41]。Minekus 等[42]通過(guò)對(duì)人體生理?xiàng)l件的分析，將BBM 酶的消化過(guò)程也納入多種食物通用的標(biāo)準(zhǔn)化靜態(tài)體外消化模型中，目前是國(guó)際公認(rèn)的一種標(biāo)準(zhǔn)化的消化模式。因此，在研究體外模擬胃腸消化蛋白質(zhì)時(shí)，應(yīng)加入BBM 酶消化階段以研究其在腸道消化中的降解作用。

3 結(jié)論

本文通過(guò)模擬嬰幼兒及成年人胃液、小腸液及小腸刷狀緣膜酶（BBM 酶）的體外靜態(tài)消化環(huán)境，發(fā)現(xiàn)雞蛋蛋清過(guò)敏原卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（OVT）在嬰幼兒和成年人消化體系中均可被降解。在模擬嬰幼兒消化體系中，OVT 胃消化產(chǎn)物分子質(zhì)量范圍為5～15 ku 和30～50 ku，進(jìn)一步經(jīng)小腸消化后的產(chǎn)物分布在0.4～10 ku，最后經(jīng)小腸刷狀緣膜酶消化生成0.5～0.7 ku 肽段及部分5～13 ku 蛋白。OVT經(jīng)模擬成年人胃消化的產(chǎn)物分子質(zhì)量范圍與模擬嬰幼兒的一致，胃-小腸消化主要生成0.5～0.8 ku肽段，再經(jīng)小腸刷狀緣膜酶消化生成0.5～0.7 ku肽段。此外，OVT 在胃液pH 值低于3.0 時(shí)可被消化，其在嬰幼兒和成年人胃消化中最易消化的pH值分別為2.5，2.0；隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，OVT 在模擬胃液中逐漸降解，可生成5.5 ku 耐胃消化片段，然而在模擬小腸液中，未隨時(shí)間發(fā)生顯著變化，生成0.495，0.560，0.638 ku 較耐腸、耐BBM 酶消化的多肽。這些耐消化片段均值得進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)表明成年人消化能力相對(duì)較強(qiáng)，而嬰幼兒消化能力則較弱，導(dǎo)致OVT 經(jīng)嬰幼兒胃、小腸及BBM 酶消化后，產(chǎn)物中仍含有耐消化的大分子蛋白，提示更易發(fā)生OVT 過(guò)敏。另外，該研究初步揭示了OVT 體外胃腸消化的規(guī)律，為進(jìn)一步明確OVT 耐胃腸消化片段與致敏性的關(guān)系提供了良好的工作基礎(chǔ)。