高旭東，傅 晶，崔洪昌,2

(1.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100; 2.佛羅里達州立大學 生物科學系，塔拉哈西，佛羅里達，美國 32306)

MYB(v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)蛋白是一類數(shù)量龐大，功能種類繁多，存在于幾乎所有真核生物的轉(zhuǎn)錄因子。MYB結(jié)構(gòu)域較為保守，主要包含3個重復，每個重復由編碼3個α-螺旋的50～53個氨基酸殘基構(gòu)成，其中第2和第3個α-螺旋形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)，可直接嵌入DNA的大溝，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能[1]。根據(jù)重復區(qū)域的數(shù)目和排布，MYB蛋白可以分為不同的種類，具有單一MYB結(jié)構(gòu)域的類MYB蛋白(R1/2或R3)、兩種重復結(jié)構(gòu)的2R-MYB蛋白(R2R3)、3種重復結(jié)構(gòu)的3R-MYB蛋白(R1R2R3)以及4種重復結(jié)構(gòu)的4R-MYB蛋白(R1R2R2R1/2)[2]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，MYB家族在植物體內(nèi)激素合成，發(fā)育以及抗逆過程中都起到至關(guān)重要的作用[1]。

地錢(MarchantiapolymorphaL.)是一種苔綱，地錢科地錢屬的孢子植物。其內(nèi)部含有的黃酮類、聯(lián)芐類、香豆素類和萜類化合物賦予了地錢在臨床上較高的藥用價值[3]。地錢在系統(tǒng)發(fā)生上位于萊茵衣藻和小立碗蘚這兩種模式系統(tǒng)之間，被譽為進化史上首次登陸的植物之一，其部分生理特征具有藻類植物所特有的特性。為了適應陸地生活，地錢還進化出了適應陸地環(huán)境的新特征[4]。近年來，隨著地錢的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立以及其基因組測序的完成，這種基因組小、冗余基因少、易于培養(yǎng)繁殖、便于遺傳操作的苔蘚逐漸成為研究植物進化和基因功能的新興模式系統(tǒng)[5]。鑒于MYB家族在植物發(fā)育與抗逆等方面的重要功能，在地錢中研究MYB家族基因的功能將有可能揭示植物在進化過程中適應陸地生活的 機制。

根據(jù)生物進化學及考古相關(guān)研究，植物從水生到陸生的過程發(fā)生在距今大約4.5億年前[6]，而植物氣孔的出現(xiàn)可追溯到距今約4億年前[7]。在植物登陸過程中，需要面對非常多來自陸地環(huán)境的威脅，從紫外線照射到干旱脅迫都對早期陸生植物造成嚴峻挑戰(zhàn)?？刂浦参矬w內(nèi)水分的流失以及通過呼吸作用代謝能量就成為植物適應陸地生活關(guān)鍵性的功能，所以氣腔(類似高等植物的氣孔)的產(chǎn)生是地錢的一項重要革新。在高等植物中，MYB亞家族S28具有控制氣孔細胞命運、抗干旱和冷害脅迫的功能[8-9]，因此選擇與亞家族S28同源的地錢MYB基因作為研究對象。

在整個演化過程中，從較原始的苔蘚植物以形成胞芽杯的形式無性繁衍，到后來的高等植物產(chǎn)生側(cè)生的器官生成更多的后代，在適應陸地生活的過程中，側(cè)生組織起到至關(guān)重要的作用。在擬南芥中MYB亞家族S14主要起到控制葉腋分生組織發(fā)育的功能[10-11]，而與S14同源的地錢MYB家族基因GCAM1(Mapoly0034s0034)具有調(diào)控胞芽杯發(fā)育的重要功能[12]，因此推測地錢中與GCAM1以及S14同源的MYB基因有可能與高等植物中側(cè)生分生組織的進化具有聯(lián)系，故選擇S14的地錢同源基因作為研究對象。另一方面，擬南芥MYB基因AtCDC5在植物中起到調(diào)控細胞循環(huán)的作用，與維持莖尖分生組織有關(guān)，而其在地錢中的同源基因MpCDC5可能參與分生區(qū)的維持，所以也將MpCDC5選作目的基因。

通過構(gòu)建擬南芥與地錢MYB家族(以R2R3-MYB為主)的系統(tǒng)進化樹，同時參考前人研究[4,13]，最終選擇MpR2R3-MYB20(Mapoly-0874s0001)、MpR2R3-MYB8(Mapoly0024s-0094)、MpR2R3-MYB3(Mapoly0007s0265)、MpR2- R3MYB18(Mapoly0123s0012)、MpR2-R3MYB16(Mapoly0092s0005)和MpCDC5(Mapoly0014s0195)6個基因作為目的基因，并對它們在地錢不同生長時期和組織部位中的表達量進行實時定量PCR分析。此外，前人研究表明，ABA能夠在抗旱過程中調(diào)節(jié)氣孔的導度以及調(diào)控胞芽杯的休眠[14-15]；外源施加較低濃度的IAA可以促進小立碗蘚配子枝的形成及生長，同時還能明顯促進原生質(zhì)體細胞的再生及分裂[16]，0.5 μmol/L的IAA能夠調(diào)節(jié)地錢的發(fā)育與胞芽的休眠[17-18]。鑒于此，在外源施加ABA和IAA處理下，檢測這些基因的表達水平是否發(fā)生變化。

1 材料與方法

1.1 材 料

植物材料：地錢Takaragaike(Tak-1，雄性)和Takaragaike(Tak-2雌性)，由福建農(nóng)林大學山室千鶴子教授實驗室饋贈。

1.2 方 法

1.2.1 目的基因的確定 使用擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子S14(共6個基因)、S28(共2個基因)亞家族和地錢全部MYB家族(共60個基因)的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。同時參考Bowman等[4]關(guān)于不同物種MYB家族進化樹，選取擬南芥S14與S28亞家族同源的地錢MYB基因作為目的基因。

1.2.2 實時定量PCR引物設計 確定目的基因后，按照產(chǎn)物總長度150～250 bp進行引物設計，MpEF1a為內(nèi)參基因。結(jié)果如表1所示，引物于北京奧科鼎盛生物公司合成。

表1 目的基因?qū)崟r定量PCR引物信息Table 1 Informationof primers for qRT-PCR of target genes

1.2.3 地錢的培養(yǎng)與激素處理 地錢于恒溫生長間培養(yǎng)(光照周期16 h光照，8 h黑暗；光照度 3 000 lx；室內(nèi)平均溫度22 ℃，平均濕度40%)，地錢生長于含1%瓊脂的1/2 B5培養(yǎng)基中。

激素處理采取0.5 μmol/L與0.1 μmol/L的IAA(BBIlife science公司)以及20 μmol/L的ABA(SIGMA公司)進行試驗，并于2周后取樣，與無處理對照組比較，對目的基因表達量的變化進行測定，每個處理設置4個重復。

1.2.4 樣品提取及保存 激素處理組使用Tak-2作為試驗樣品，其中每個處理組及對照組設置4個培養(yǎng)皿，平均每個培養(yǎng)皿種20個樣品，于2周大小時分別選取其中2個長勢類似的培養(yǎng)皿，取全株樣，鮮質(zhì)量約200 mg置于液氮中。組織特異性試驗使用的地錢樣品為Tak-1，每個不同樣品分別種4個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿種20個植株。取樣分為2周分生區(qū)、2周中脊、2周全株、3周分生區(qū)、3周胞芽杯和胞芽，選取其中長勢相同的2個培養(yǎng)皿取樣，每個樣品鮮質(zhì)量約200 mg并置于液氮中。地錢不同組織部位見圖1。

1.2.5 樣品RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR 每個樣品200 mg，使用液氮研磨后用Trizol(Takara公司的RNAisoplus，貨號9109)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄使用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(貨號6210A)進行cDNA第1鏈合成，產(chǎn)物稀釋至100 μL用于qRT-PCR分析。

實時定量PCR使用試劑為Vazyme公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，貨號Q711)，PCR總體積為20 μL，每個樣品設置3個技術(shù)重復，使用MpEF1a基因作為內(nèi)參進行對比分析。qRT-PCR反應程序為： 95 ℃預變性2 min，45個循環(huán)(95 ℃變性5 s，對應退火溫度30 s)，最后添加1次溶解曲線分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 使用MpEF1a作為內(nèi)參基因，組織特異性試驗以Tak-1(雄性)為材料。計算相對表達量時，將每組中表達量最低的樣品表達量設為“1”。不同激素處理以Tak-2(雌性)為材料，使用MpEF1a作為內(nèi)參基因?qū)?個目的基因進行qRT-PCR分析，對照組表達量設為“1”。使用Spss軟件中的Duncan’s分析法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 地錢中S14、S28亞家族和 AtCDC5同源基因的確定

使用MEGA 7軟件將地錢MYB與擬南芥MYB亞家族S14、S28以及AtCDC5基因的氨基酸序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖2，確定MpR2R3-MYB20為S14同源基因，S28的同源基因則有MpR2R3-MYB18和MpR2R3-MYB3，AtCDC5同源基因為MpCDC5(GCAM1已有研究，主要功能是調(diào)控胞芽杯的發(fā)育[12])。這與Bowman等[4]的結(jié)果基本一致，但缺少S14亞家族的MpR2R3-MYB8和S28亞家族的MpR2R3-MYB16，推測可能與選取的MYB基因數(shù)目及構(gòu)建系統(tǒng)樹參數(shù)的差異有關(guān)。由于這兩個基因可能與其他的S14和28亞家族基因功能相似，因此在試驗中同時對它們進行分析。

2.2 6個基因時空表達結(jié)果

6個基因時空表達結(jié)果(圖3)顯示，MpR2R3-MYB20在胞芽中表達量最高，而胞芽杯表達量卻較低，就2周結(jié)果而言，其分生區(qū)與中脊表達量較高，而全株卻遠低于前兩者，推測此基因在葉狀體中表達量低；MpR2R3-MYB8在2周與3周的分生區(qū)中高表達；MpR2R3-MYB18在胞芽杯中表達量最高，胞芽次之?；騇pR2R3-MYB16在全株以及中脊表達量較高，表明其可能在葉狀體中高表達。相較于其他基因而言，MpR2R3-MYB3與MpCDC5的時空表達差異性較小，主要在3周左右的分生區(qū)中高表達。

2.3 激素處理后地錢生長表型變化

對地錢進行IAA和ABA兩種植物激素處理，處理后的生長變化如圖4所示。通過對每個培養(yǎng)皿平均約20至25個地錢的面積進行測量，得出對照組每個地錢樣品平均面積約為0.95 cm2± 0.24 cm2，0.1 μmol/L IAA處理下平均面積約為0.97 cm2±0.30 cm2，0.5 μmol/L IAA處理下平均面積約為0.95 cm2±0.32 cm2，但IAA處理下地錢的假根明顯增多，且隨著IAA濃度增加，假根數(shù)量也隨之增加。在20 μmol/L ABA處理下，地錢樣品平均面積約為0.16 cm2±0.02 cm2，僅為對照組的16.8%，地錢生長狀態(tài)受到明顯抑制，假根數(shù)量無明顯變化。

2.4 激素處理qRT-PCR結(jié)果分析

如圖5所示，MpR2R3-MYB20在0.1 μmol/L IAA處理下表達量顯著升高，其表達量相較于對照組上調(diào)7.89倍，其他處理差異不顯著；MpR2R3-MYB8在兩種激素處理下表達量均出現(xiàn)小幅下調(diào)；MpR2R3-MYB3在IAA處理下顯著下調(diào)，0.1 μmol/L IAA處理相比0.5 μmol/L IAA處理下調(diào)幅度更大，但在20 μmol/L ABA處理下下降不顯著；MpR2R3-MYB18在20 μmol/L ABA處理下出現(xiàn)顯著上調(diào)。MpR2R3-MYB16在0.5 μmol/L IAA與20 μmol/L ABA處理下與對照組相比顯著下調(diào)，而在0.1 μmol/L IAA處理下表達量顯著上調(diào)；MpCDC5在IAA處理下下調(diào)顯著，而在ABA處理下變化不顯著。

3 討 論

與藻類相比，地錢演化出陸地生活所需的氣體交換、固著以及繁衍的一些基本組織結(jié)構(gòu)和功能，被認為是最為原始的陸生植物，其基因組也處于一種“原始”狀態(tài)。在之后的進化歷程中出現(xiàn)的陸生植物大多經(jīng)過全基因組倍增或多倍化過程，使這些結(jié)構(gòu)和功能變得更為精細和完善。通過同源序列法尋找高等植物中控制相應結(jié)構(gòu)和功能形成的相關(guān)基因在地錢中的同源基因，對這些基因在地錢中進行時空表達分析，能推測其在地錢中的作用，為闡釋植物登陸的機制提供線索。

通過對MpR2R3-MYB8與MpR2R3-MYB20表達模式比較發(fā)現(xiàn)，雖然兩者都是S14和GCAM1的同源基因，但表達模式卻有較大差別。與GCAM1的親源關(guān)系相對較遠的MpR2R3-MYB8在分生區(qū)中高表達，而在2周的中脊表達最低，且受IAA和ABA的影響較小，而中脊正是地錢周期性形成胞芽杯的部位，因此推測其可能與胞芽杯的發(fā)育關(guān)系不大，具體功能有待進一步研究。與GCAM1的親源關(guān)系較近的MpR2R3-MYB20，在胞芽、分生區(qū)和中脊表達量較高，與GCAM1的GUS染色得出的表達模式基本一致[12]，二者很可能功能冗余的調(diào)控胞芽杯的發(fā)育。另外，MpR2R3-MYB20受到0.1 μmol/L IAA誘導大幅上調(diào)，且在分生區(qū)較高表達，所以推測其功能與分生區(qū)細胞增殖有關(guān)。

擬南芥S28亞家族中的MYB124和MYB88通過抑制細胞周期蛋白CYCA2s來調(diào)節(jié)保衛(wèi)細胞的分化[19]。在S28亞家族的同源基因中，MpR2R3-MYB3在分生區(qū)高表達外，在全株中也有較高表達，這表明MpR2R3-MYB3可能在分生區(qū)和中脊以外的葉狀體部位有較高的表達，而MpR2R3-MYB16在葉狀體中的表達也較高，這兩個基因很有可能通過調(diào)控細胞周期蛋白來參與地錢氣腔的形成。此外，在ABA處理下MpR2R3-MYB16表達水平出現(xiàn)大幅下降，推測其可能與S28亞家族的抗干旱寒冷脅迫類似[9]，在脅迫條件下出現(xiàn)與ABA協(xié)同調(diào)節(jié)氣腔導度，而MpR2R3-MYB16在0.1 μmol/L IAA處理下顯著上調(diào)，表明其功能可能與地錢發(fā)育相關(guān)。MpR2R3-MYB18在胞芽杯和胞芽中高表達，且受到ABA誘導上調(diào)最為明顯，推測MpR2R3-MYB18可能與地錢適應陸地生活有關(guān)。此外，鑒于擬南芥中S28亞家族與細胞周期的關(guān)系以及ABA能調(diào)控胞芽杯的休眠，據(jù)此推測MpR2R3-MYB18可能通過ABA信號途徑調(diào)控了胞芽杯與胞芽形成的起始過程。

MpCDC5在3周分生區(qū)表達最高，低濃度IAA處理后表達量顯著下調(diào)。MpCDC5基因在擬南芥中的同源基因AtCDC5具有調(diào)控分生區(qū)細胞循環(huán)G2期到M期過渡的作用[20-21]，因此推測MpCDC5可能參與促進了分生區(qū)的形成，并且在IAA處理下出現(xiàn)下調(diào)以維持分生區(qū)穩(wěn)定。

本試驗通過對地錢中部分MYB基因在不同情況下表達量的差異進行分析，為日后在地錢中研究相關(guān)基因的功能進行鋪墊，為進一步研究植物進化過程中適應陸地環(huán)境的機制提供思路。