張繼祥，聶佩顯，張丁有，路超

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

隨著全球氣候變暖，我國極端天氣日益增多[1，2]，晚霜凍已成為制約我國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要自然災(zāi)害之一[3，4]。生產(chǎn)上，在霜凍來臨之前噴施具有抗寒效果的外源物質(zhì)以提高果樹的抗寒性，已有廣泛應(yīng)用。研究表明，水楊酸（SA）、油菜素內(nèi)脂（BR）和氯化鈣（CaCl2） 等物質(zhì)與植物的抗寒性具有一定關(guān)系。如，在黃瓜幼苗上葉面噴施1 mmol/L 的SA 溶液，可使黃瓜幼苗的冷害指數(shù)較清水對照降低40%[5]；在葡萄幼苗上葉面噴施0.25～5.00 mmol/L 不同濃度梯度的SA溶液，均可提高葡萄幼苗的抗寒性[6]；在草莓上葉面噴施3 mg/L 的BR 溶液，可提高葉片SOD、POD 和CAT 的活性，增強(qiáng)草莓的抗逆性[7]；Ca2+為一種細(xì)胞膜保護(hù)劑，Ca 處理可減輕自由基對膜系統(tǒng)的損傷，降低膜脂過氧化程度，提高蘋果對逆境的適應(yīng)性[8]等。但是，這些物質(zhì)對提高蘋果幼樹抗寒性的效果差異尚未見報(bào)道。以2 a 生嘎拉蘋果的新梢為試材，比較了低溫脅迫下CaCl2、SA 和BR 溶液處理對蘋果葉片抗寒性相關(guān)指標(biāo)的影響，并對噴施不同外源物質(zhì)后的枝條抗寒性進(jìn)行了綜合評價(jià)，旨為有效預(yù)防蘋果晚霜凍提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蘋果試材為樹勢健壯、長勢一致的2 a 生嘎拉/M9T337，種植于山東省濟(jì)寧市嘉祥縣國家小尾寒羊保種場果園 （北緯 35°36′、東經(jīng) 116°16′）。果園面積4 hm2，蘋果樹株行距為4.5m×2.5m，高紡錘樹形，南北行向，常規(guī)管理。

試劑有CaCl2（天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)）、水楊酸（天津凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)）和蕓苔素內(nèi)酯水劑（碩豐481，有效成分含量為0.007 5%，成都新朝陽生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)外源物質(zhì)設(shè)2 g/L 的CaCl2溶液（CaCl2，Ⅰ）、200 mg/L 的水楊酸溶液（SA，Ⅱ）、蕓苔素內(nèi)酯水劑750 倍液（BR 750 倍液，Ⅲ）、蕓苔素內(nèi)酯水劑1 500 倍液（BR 1 500 倍液，Ⅳ）、蕓苔素內(nèi)酯水劑3 000 倍液 （BR 3 000 倍液，Ⅴ） 和清水（CK）6 個(gè)處理，單株小區(qū)，3 次重復(fù)。從蘋果萌芽期開始進(jìn)行全樹噴施外源物質(zhì)處理，每7 d 噴施1 次，連噴3 次。第3 次噴施外源物質(zhì)后第10 天，在樹冠外圍東、西、南、北4 個(gè)方向剪取長勢一致的帶葉新梢，將剪口處封蠟，然后帶回實(shí)驗(yàn)室置于人工智能低溫箱內(nèi)進(jìn)行低溫脅迫處理，試驗(yàn)低溫梯度設(shè)4、0、-2 和-4 ℃計(jì)4 個(gè)水平，5 h 后用液氮速凍，備用。

1.2.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.2.1 葉片生理學(xué)指標(biāo)。參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[9]，測定葉片的相對電導(dǎo)率、保護(hù)酶（SOD、POD、CAT） 活性和主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)〔丙二醛（MDA）、脯氨酸、可溶性糖〕含量。

1.2.2.2 葉片半致死溫度（LT50）。相對電導(dǎo)率達(dá)到50%時(shí)的溫度可以作為半致死溫度[10]。為了準(zhǔn)確判斷各外源物質(zhì)處理的葉片LT50，根據(jù)其不同低溫脅迫下的相對電導(dǎo)率擬合出相對電導(dǎo)率（Y）與溫度（X）的Logistic 方程，求出曲線拐點(diǎn)所對應(yīng)的溫度，即為葉片的低溫LT50[11]。

1.2.2.3 枝條抗寒性綜合評價(jià)。利用葉片的抗寒性綜合評價(jià)結(jié)果作為枝條的抗寒性評價(jià)結(jié)果。利用隸屬函數(shù)法，對不同外源物質(zhì)處理的枝條抗寒性進(jìn)行綜合評價(jià)[12]。首先對各個(gè)抗性指標(biāo)進(jìn)行分類，與抗寒性呈正相關(guān)的指標(biāo)（脯氨酸含量、可溶性糖含量和3 種保護(hù)酶活性）利用公式（1）求隸屬度，與抗寒性呈負(fù)相關(guān)的指標(biāo)（MDA 含量、相對電導(dǎo)率） 利用公式（2）求隸屬度：

公式中，Zijk表示噴施第i 種外源物質(zhì)處理后的植物組織在第j 個(gè)溫度脅迫下第k 項(xiàng)指標(biāo)的隸屬度；Xijk表示噴施第i 種外源物質(zhì)處理后的植物組織在第j 個(gè)溫度脅迫下第k 項(xiàng)指標(biāo)的測定值，Xmax、Xmin分別表示所有參試材料中第k 項(xiàng)指標(biāo)的最大值和最小值。將同一外源物質(zhì)處理下各個(gè)指標(biāo)的抗寒性隸屬值累加起來，求平均值，即為該外源物質(zhì)處理的抗寒性隸屬度。參照龔月樺等[13]的方法，按照平均隸屬度將枝條的抗寒性進(jìn)行分級：隸屬度≥0.70 時(shí)為強(qiáng)抗，隸屬度為0.6（含）～0.7 時(shí)屬抗，隸屬度為0.4（含）～0.6 時(shí)屬中抗，隸屬度為0.3（含）～0.4時(shí)屬弱抗，隸屬度＜0.3時(shí)為不抗。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 使用Excel 軟件繪制圖表；使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外源物質(zhì)處理對蘋果葉片相對電導(dǎo)率和半致死溫度的影響

2.1.1 相對電導(dǎo)率 隨著低溫脅迫程度的增大，各處理的葉片相對電導(dǎo)率均呈逐漸增大趨勢；但相同溫度下，不同處理的指標(biāo)值除4 ℃低溫脅迫時(shí)差異不顯著外，其他低溫脅迫時(shí)差異均較大（圖1）。

圖1 不同外源物質(zhì)處理對蘋果葉片相對電導(dǎo)率的影響Fig.1 Effects of different exogenous substances on relative conductivity of apple leaves

CK 的相對電導(dǎo)率增加得最快，且指標(biāo)值始終處于最高，其中-4 ℃低溫脅迫時(shí)相對電導(dǎo)率高達(dá)78.83%。CaCl2處理的相對電導(dǎo)率增加得最為緩慢，≤0 ℃低溫脅迫時(shí)指標(biāo)值始終處于最低，其中-4 ℃低溫脅迫的相對電導(dǎo)率較CK 下降了47.69%。≤0 ℃低溫脅迫時(shí)，SA 與BR 1 500 倍液處理的葉片相對電導(dǎo)率十分相近，二者-4 ℃低溫脅迫時(shí)的指標(biāo)值均顯著＜CK以及BR 750 倍液和3 000 倍液處理，其中較CK 分別下降了34.04%和35.23%。

綜上分析可以看出，≤0 ℃的低溫脅迫時(shí)，試驗(yàn)的外源物質(zhì)處理均可降低葉片相對電導(dǎo)率，減輕葉片傷害，其中CaCl2處理效果最好，其次是SA 和BR 1 500 倍液處理。

2.1.2 半致死溫度 從圖1 發(fā)現(xiàn)，BR750 倍液和3000倍液處理的LT50在-2 ℃附近，SA 和BR 1 500 倍液處理的LT50在-4 ℃附近。根據(jù)各外源物質(zhì)處理不同低溫脅迫下相對電導(dǎo)率擬合出的Logistic 方程，計(jì)算得到SA、CaCl2、BR 750 倍液、BR 1 500 倍液、BR 3 000倍液處理的 LT50分別為-3.78、-6.79、-2.33、-3.92 和-2.64 ℃，均＜CK（表1）。說明試驗(yàn)的外源物質(zhì)處理均可減少低溫脅迫下葉片細(xì)胞內(nèi)離子的外滲，降低LT50，提高枝條的抗寒性，其中CaCl2處理效果最好，其次是BR 1 500 倍液和SA 處理，BR 750 倍液和3 000 倍液處理效果相對較弱。

表1 不同外源物質(zhì)處理的蘋果葉片相對電導(dǎo)率Logistic 方程及其半致死溫度Table 1 Logistic equation of relative conductivity and LT50 of apple leaves treated with different exogenous substances

2.2 不同外源物質(zhì)處理對蘋果葉片主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.2.1 MDA 含量 MDA 是一種膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物，在逆境下會大量積累，對生物膜產(chǎn)生傷害。隨著低溫脅迫程度的增大，各處理的葉片MDA 含量均呈逐漸升高趨勢，且均在LT50附近升高較快；但相同溫度下，不同處理的指標(biāo)值除4 ℃低溫脅迫時(shí)差異不顯著外，其他低溫脅迫時(shí)差異均較大，其中-2 和-4 ℃低溫脅迫時(shí)各外源物質(zhì)處理的葉片MDA 含量均＜CK，尤其是-4 ℃低溫脅迫的指標(biāo)值與CK 差異均達(dá)到了顯著水平（圖2）。

圖2 不同外源物質(zhì)處理對蘋果葉片丙二醛含量的影響Fig.2 Effects of different exogenous substances on malondialdehyde content of apple leaves

-4 ℃低溫脅迫時(shí)，不同外源物質(zhì)處理的葉片MDA 含量順序?yàn)镃aCl2＜SA＜BR 1500 倍液＜BR 750 倍液＜BR 3000 倍液，其中 CaCl2、SA 和 BR 1500 倍液處理三者差異不顯著，但均與其他2 個(gè)外源物質(zhì)處理差異達(dá)到了顯著水平；與4 ℃低溫脅迫的指標(biāo)值相比，SA、CaCl2、BR 750 倍液、BR 1 500 倍液、BR 3 000倍液處理的葉片MDA 含量分別增加了1.85 倍、1.78 倍、3.17 倍、2.94 倍和 2.64 倍，增幅均＜CK （3.20 倍）。

綜上分析可以看出，≤0 ℃的低溫脅迫時(shí)，SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理可顯著降低蘋果葉片MDA含量，減輕葉片傷害，其中CaCl2處理效果最好，其次是SA 和BR 1 500 倍液處理。

2.2.2 脯氨酸含量 在4 ℃低溫脅迫時(shí)不同處理已經(jīng)對葉片脯氨酸含量產(chǎn)生了顯著影響，隨著低溫脅迫程度的增大，各處理的葉片脯氨酸含量總體上均呈升高趨勢；但相同溫度下，不同處理的指標(biāo)值差異均較大，其中CaCl2、SA 和BR 1 500 倍液處理的指標(biāo)值顯著＞CK 以及BR 750 倍液和3 000 倍液處理，而BR 750 倍液和3 000 倍液處理的指標(biāo)值與CK 普遍差異不顯著（圖3）。

圖3 不同外源物質(zhì)處理對蘋果葉片脯氨酸含量的影響Fig.3 Effects of different exogenous substances on proline content of apple leaves

CK 的脯氨酸含量增加得最少，且指標(biāo)值始終處于最低。CaCl2處理的脯氨酸含量增加得最多，≤0 ℃低溫脅迫時(shí)指標(biāo)值始終處于最高，其中-2 和-4 ℃低溫脅迫的指標(biāo)值顯著＞其他外源物質(zhì)處理。-4 ℃低溫脅迫時(shí)，SA 處理的葉片脯氨酸含量也顯著＞BR 1 500 倍液處理。

綜上分析可以看出，≤0 ℃的低溫脅迫時(shí)，試驗(yàn)的外源物質(zhì)處理均可提高葉片脯氨酸含量，增強(qiáng)抗寒性，其中CaCl2、SA 和BR 1 500 倍液處理效果顯著，以CaCl2處理效果最好，其次是SA 處理。

2.2.3 可溶性糖含量 在4 ℃低溫脅迫時(shí)不同處理已經(jīng)對葉片可溶性含量產(chǎn)生了顯著影響，隨著低溫脅迫程度的增大，各處理的葉片可溶性糖含量總體上均呈先升高后降低的變化，且均在-2 ℃低溫脅迫時(shí)達(dá)到最高；但相同溫度下，不同處理的指標(biāo)值差異均較大，均以BR1500 倍液處理明顯較高（圖4）。

圖4 不同外源物質(zhì)處理對蘋果葉片可溶性糖含量的影響Fig.4 Effects of different exogenous substances on soluble sugar content of apple leaves

4～0℃低溫脅迫時(shí)，各處理的葉片可溶性糖含量均增加緩慢，其中0 ℃低溫脅迫時(shí)SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理的指標(biāo)值顯著＞CK。-2 ℃低溫脅迫時(shí)，各處理的葉片可溶性糖含量均迅速升高至最大，SA、CaCl2、BR 750 倍液、BR 1 500 倍液、BR 3 000 倍液處理的指標(biāo)值分別達(dá)到 18 9.92、164.25、128.63、202.15 和128.90 mg/g，均顯著＞CK （116.94 mg/g）；與 4 ℃低溫脅迫的指標(biāo)值相比，依次提高了114%、96%、86%、92%和69%，增幅均＞CK （37%）。-4 ℃低溫脅迫時(shí)，各處理的葉片可溶性糖含量均較-2 ℃低溫脅迫時(shí)降低，其中外源物質(zhì)處理的指標(biāo)值均顯著＞CK，但與4 ℃脅迫的指標(biāo)值相比仍然較高，SA、CaCl2、BR 750 倍液、BR 1 500 倍液、BR 3 000 倍液處理的可溶性糖含量分別較其4 ℃低溫脅迫的指標(biāo)值增加了31%、34%、22%、42%和10%；不同外源物質(zhì)處理的葉片可溶性糖含量差異較大，其中SA 與CaCl2處理差異不顯著，但二者均顯著＞BR 750 倍液和3 000 倍液處理。

綜上分析可以看出，≤0 ℃的低溫脅迫時(shí)，SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理可顯著提高葉片可溶性糖含量，增強(qiáng)抗寒性，其中BR 1 500 倍液處理效果最好，其次是SA 和CaCl2處理。

2.3 不同外源物質(zhì)處理對蘋果葉片保護(hù)酶活性的影響

2.3.1 SOD 活性 隨著低溫脅迫程度的增大，各處理的葉片SOD 活性均呈先升高后降低的變化，除BR 1 500 倍液處理是在-2 ℃低溫脅迫下達(dá)到最高外，其他處理均是在0 ℃低溫脅迫時(shí)達(dá)到最高；但相同溫度下，不同處理的指標(biāo)值除4 ℃脅迫時(shí)差異不顯著外，其他低溫脅迫時(shí)差異均較大，其中SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理的指標(biāo)值均顯著＞CK（圖5）。

圖5 不同外源物質(zhì)處理對蘋果葉片SOD 活性的影響Fig.5 Effects of different exogenous substances on SOD enzymatic activity of apple leaves

0 ℃低溫脅迫時(shí)，SA、CaCl2、BR 750 倍液、BR 1 500倍液、BR 3 000 倍液處理的葉片SOD 活性分別為149.28、139.24、39.61、91.24 和 67.98 U/g（FW），除BR 750 倍液處理略＜CK〔47.31 U/g（FW）〕外，其他處理的指標(biāo)值均＞CK，其中SA 處理最高，CaCl2處理次之，二者差異不顯著，但均顯著＞其他處理；與4 ℃低溫脅迫的指標(biāo)值相比，葉片SOD 活性分別提高了3.50 倍、3.25 倍、0.17倍、1.59 倍和 1.15 倍，增幅均＞CK（36%）。-2 ℃低溫脅迫時(shí)，BR 1 500 倍液處理的葉片SOD 活性升至最高，而其他處理的指標(biāo)值均較0 ℃低溫脅迫時(shí)有所降低，該溫度下指標(biāo)值以SA 處理最高，其次是BR 1 500 倍液和CaCl2處理，三者之間差異顯著，但均顯著＞其他處理；BR 750 倍液處理的葉片SOD 活性最低，BR 3 000 倍液處理次之，二者差異顯著，但均與CK 差異不顯著。-4 ℃低溫脅迫時(shí)，各處理的葉片SOD 活性均較-2 ℃低溫脅迫時(shí)的指標(biāo)值降低，其中SA 處理的指標(biāo)值最高，其次是BR 1 500 倍液處理，二者差異不顯著，但均顯著＞其他處理；CaCl2處理的指標(biāo)值也較高，顯著＞CK 以及BR 750 倍液和3 000 倍液處理；BR 750倍液和3 000 倍液處理的葉片SOD 活性較低，二者差異不顯著且均與CK 差異也不顯著，指標(biāo)值分別是0 ℃低溫脅迫時(shí)的52.31%和36.16%。

綜上分析可以看出，≤0 ℃的低溫脅迫時(shí)，SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理可顯著提高葉片SOD 活性，減輕葉片傷害，其中SA 處理效果最好。

2.3.2 POD 活性 POD 能降解植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，避免膜質(zhì)過氧化對細(xì)胞產(chǎn)生傷害。在4 ℃低溫脅迫時(shí)不同處理已經(jīng)對葉片POD 活性產(chǎn)生了顯著影響，隨著低溫脅迫程度的增大，各處理的葉片POD 活性均呈先升高后降低的變化，且指標(biāo)值均在0 ℃低溫脅迫時(shí)達(dá)到最高；但相同溫度下，不同處理的指標(biāo)值差異均較大，其中SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理的指標(biāo)值均顯著＞CK 以及BR 750 倍液和 3 000 倍液處理（圖6）。

圖6 不同外源物質(zhì)處理對蘋果葉片POD 活性的影響Fig.6 Effects of different exogenous substances on POD enzymatic activity of apple leaves

4 ℃低溫脅迫時(shí)，各外源物質(zhì)處理的葉片POD 活性均顯著＞CK，其中SA 處理的指標(biāo)值最高，且顯著＞其他處理；其次是CaCl2和BR1 500 倍液處理，二者差異不顯著，但均顯著＞CK 以及BR 750 倍液和BR 3 000倍液處理；BR 750 倍液和3 000 倍液處理的葉片POD活性相對較低，二者差異不顯著。0 ℃低溫脅迫時(shí)，SA、CaCl2、BR 750 倍液、BR 1 500 倍液、BR 3 000 倍液處理的葉片POD 活性均迅速升高，分別達(dá)到54.27、 53.28、 17.79、 69.61 和 26.45 ΔA/（min·g），均＞CK〔11.04ΔA（/min·g）〕，且除BR 750倍液處理外，其他處理與CK 差異均達(dá)到了顯著水平，其中BR 1 500倍液處理的指標(biāo)值最高且顯著＞其他處理，SA 與CaCl2處理差異不顯著但均顯著＞BR 750 倍液和3 000 倍液處理；與4 ℃低溫脅迫時(shí)的指標(biāo)值相比，葉片POD 活性分別提高了2.67 倍、4.15 倍、1.20倍、5.60 倍和2.16倍。-2 ℃低溫脅迫時(shí)，各外源處理的葉片POD活性均＞CK，其中SA 處理的指標(biāo)值最高，與CaCl2處理差異不顯著，但顯著＞BR 1 500 倍液處理；CaCl2與BR 1 500倍液處理差異不顯著，但均顯著＞CK 以及BR其他2 個(gè)處理；BR 750 倍液和3 000 倍液處理的葉片POD 活性較低，二者差異不顯著，且均與CK 差異也不顯著。-4 ℃低溫脅迫時(shí)，除BR 750 倍液處理的葉片POD 活性略＜CK 外，其他處理的指標(biāo)值均顯著＞CK，其中SA 處理的指標(biāo)值最高且顯著＞其他處理；CaCl2與BR 1 500倍液處理差異不顯著，但二者均顯著＞CK 以及BR 750倍液和3 000 倍液處理；BR 750 倍液和3 000 倍液處理的葉片POD 活性相對較低，分別是0 ℃低溫脅迫時(shí)指標(biāo)值的43.01%和56.70%。

綜上分析可以看出，低溫脅迫時(shí)，SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理均可顯著提高葉片POD 活性，減輕葉片傷害，其中0 ℃時(shí)BR 1 500 倍液處理效果最好，4、-2 ℃和-4 ℃時(shí) SA 處理效果最好。

2.3.3 CAT 酶活性 CAT 能催化H2O2分解，對細(xì)胞內(nèi)組分的活性狀態(tài)有保護(hù)作用。在4 ℃低溫脅迫時(shí)不同處理已經(jīng)對葉片CAT 活性產(chǎn)生了顯著影響，隨著低溫脅迫程度的增大，各處理的葉片CAT 活性總體上均呈先升高后降低的變化，其中BR 1 500 倍液和3 000倍液處理是在-2 ℃低溫脅迫時(shí)達(dá)到最高外，而其他處理均是在0 ℃低溫脅迫時(shí)達(dá)到最高；但相同溫度下，不同處理的指標(biāo)值差異差均較大，其中≤0 ℃低溫脅迫時(shí)，SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理的指標(biāo)值均顯著＞CK 以及 BR 750 倍液和 3 000 倍液處理 （圖 7）。

圖7 不同外源物質(zhì)處理對蘋果葉片CAT 酶活性的影響Fig.7 Effects of different exogenous substances on CAT enzymatic activity of apple leaves

0 ℃低溫脅迫時(shí)，各外源物質(zhì)處理的葉片CAT 活性均＞CK，其中 CaCl2處理的指標(biāo)值 〔2.20 ΔA/（min·g）〕最高，且顯著＞其他處理；SA〔1.39ΔA（/min·g）〕 與BR 1 500 倍液處理差異不顯著，但二者均顯著＞CK 以及BR 750 倍液和3 000 倍液；BR 750 倍液和3 000 倍液處理的葉片CAT 活性較低，二者差異不顯著，且均與CK 差異也不顯著。-2 ℃低溫脅迫時(shí)，除BR 750倍液處理的葉片CAT 活性略＜CK 外，其他外源物質(zhì)處理均顯著＞CK，其中 BR 1 500 倍液處理的指標(biāo)值 〔1.72 ΔA/（min·g）〕最高，且顯著＞其他處理；SA 與CaCl2處理差異不顯著，但二者均顯著＞CK 以及BR 750 倍液和3 000 倍液處理；BR 3 000 倍液處理和CK的指標(biāo)值均達(dá)到最大，分別為0.85 和0.45 ΔA（/min·g），但二者與其他處理相比均明顯較低。-4 ℃低溫脅迫時(shí)，CK 的葉片CAT 活性出現(xiàn)最小值；各外源物質(zhì)處理的葉片CAT 活性雖有不同程度的降低，但均仍高于其4 ℃低溫脅迫時(shí)的指標(biāo)值，SA、CaCl2、BR 750 倍液、BR 1 500 倍液、BR 3 000 倍液處理的葉片CAT 活性分別較其4 ℃低溫脅迫時(shí)的指標(biāo)值提高了12.67 倍、1.37 倍、0.40 倍、4.76 倍和 0.74 倍。

綜上分析可以看出，≤0 ℃的低溫脅迫時(shí)，SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理均可顯著提高葉片CAT 活性，減輕葉片傷害，其中0 ℃時(shí)CaCl2處理效果最好，-2 和-4 ℃時(shí)BR 1 500 倍液處理效果最好。

2.4 不同外源物質(zhì)處理的枝條抗寒性綜合評價(jià)

SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理的平均隸屬度分別為0.569 3、0.576 3 和0.579 4，枝條抗寒性綜合評價(jià)均為中抗；BR 750 倍液、BR 3 000 倍液和CK 的平均隸屬度分別為0.247 4、0.296 8 和0.219 0，枝條抗寒性綜合評價(jià)均為不抗（表2）。

表2 不同外源物質(zhì)處理的抗寒性綜合評價(jià)Table 2 Comprehensive evaluation of cold resistance of apple shoots treated with different exogenous substances

3 結(jié)論與討論

低溫脅迫會對植物細(xì)胞膜的穩(wěn)定性造成破壞，其破環(huán)程度隨著低溫脅迫程度的增大而加劇[14，15]。相對電導(dǎo)率的變化可以直觀地反映細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，前人研究表明，抗寒性強(qiáng)的植物在遭受低溫脅迫時(shí)，膜系統(tǒng)穩(wěn)定性強(qiáng)，相對電導(dǎo)率小；反之，亦然[10，16，17]。因此，相對電導(dǎo)率被作為衡量細(xì)胞膜破壞程度的重要指標(biāo)，并配以Logistic 方程計(jì)算得出的植物L(fēng)T50成為比較植物抗寒性差異的重要方法，已經(jīng)在葡萄[16]、梨[18，19]、蘋果[10，20，21]等果樹以及楊樹[22]上得到了廣泛應(yīng)用。MDA是膜脂過氧化過程的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映膜系統(tǒng)受傷害的程度和植物的抗逆性[22]。本研究中通過噴施不同的外源物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理均可顯著降低葉片的相對電導(dǎo)率、LT50和MDA 含量，有效維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，提高蘋果葉片的抗寒性。這與SA 在番茄[23]和栝樓[24]幼苗，CaCl2在庫爾勒香梨[25]，BR 在菜用甘薯[26]和葡萄[27]幼苗上的作用結(jié)果一致。

脯氨酸和可溶性糖為細(xì)胞中主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在果樹抗寒鍛煉中起著非常重要的作用。低溫脅迫下，植物常見的生理反應(yīng)是積累脯氨酸，其具有增加膜穩(wěn)定性、減輕質(zhì)膜損傷和清除自由基等功能[28]。植物組織中通過提高可溶性糖含量和細(xì)胞液濃度，使胞質(zhì)冰點(diǎn)值下降，從而提高植物體的代謝效率，增強(qiáng)其抗寒性[29]。SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理雖然均顯著地提高了葉片的脯氨酸含量和可溶性糖含量，但提高的幅度不同，其中CaCl2和SA 處理對提高葉片脯氨酸含量效果較好，BR 1 500 倍液處理對提高葉片可溶性糖含量效果最好。本研究結(jié)果與外源SA 處理對番茄幼苗[23]、CaCl2處理對楠木幼苗[30]、外源BR 處理對葡萄幼苗[27]上的影響結(jié)果一致。

SOD、POD 和CAT 是植物體內(nèi)的重要保護(hù)酶，可以降解逆境產(chǎn)生的活性氧自由基，保護(hù)膜系統(tǒng)免受過氧化物的傷害，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性[31]。本研究結(jié)果顯示，SA、CaCl2和BR 1 500 倍液處理均可顯著提高蘋果葉片的SOD、POD 和CAT 活性，但對3 個(gè)保護(hù)酶活性的影響程度存在差異，其中CaCl2處理對提高葉片CAT 活性效果最好，SA 處理對提高葉片SOD 活性效果最好，BR 1 500 倍液對提高葉片POD 活性效果最好。

目前，關(guān)于果樹抗寒物質(zhì)篩選的研究大多是通過測定一些生理生化指標(biāo)的變化來衡量其抗寒效果，但由于植物抗寒生理生化變化較為復(fù)雜，且不同指標(biāo)存在交互作用，如果孤立地使用單一指標(biāo)很難全面、準(zhǔn)確地衡量其抗寒性強(qiáng)弱[12]，只有對這些指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，才能準(zhǔn)確地判斷各物質(zhì)處理的抗寒效果。因此，眾多學(xué)者將聚類分析法[32]、主成分分析法[33]和隸屬函數(shù)法[34～36]等應(yīng)用于植物的抗寒性研究，其中隸屬函數(shù)法應(yīng)用得較為廣泛。本研究中通過隸屬函數(shù)法確定了幾種外源物質(zhì)處理的抗寒性綜合排名，篩選出了效果較好的3 個(gè)處理分別為BR 1 500 倍液、2 g/L 的CaCl2溶液和 200 mg/L 的 SA 溶液，與根據(jù) Logistic 方程計(jì)算得到的LT50結(jié)果基本一致。說明可以利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行蘋果抗寒性的綜合評價(jià)，同時(shí)表明本試驗(yàn)篩選出的3 個(gè)處理方法對于防御降溫幅度不是很大的晚霜凍是有效的。