王凱凱 王曉璐 蘇小運 張杰

（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193）

CRISPR-Cas9是十分便捷、有效的基因組編輯工具［1］，近年來已經(jīng)成功應(yīng)用于植物、動物、微生物等多種生物中。Xing等［2］在pGreen和pCAMBIA載體上設(shè)計組裝多個gRNA序列，引導Cas9蛋白同時特異性識別和切割多個基因序列，在玉米和擬南芥等植物中實現(xiàn)了基因高效編輯。Li等［3］以Tet家族基因作為靶標，經(jīng)顯微注射將靶向Tet的sgRNA與Cas9 mRNA一起引入大鼠胚胎細胞中完成了多基因高效編輯。甲基營養(yǎng)酵母巴斯德畢赤酵母是生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)最常用的表達系統(tǒng)之一，經(jīng)密碼子優(yōu)化的Cas9基因序列與不同啟動子組成表達盒，可實現(xiàn)接近100%編輯效率［4］。在大腸桿菌中，Zhao等［5］通過Golden Gate方法將Cas9系統(tǒng)與促進同源重組的蛋白基因recA組裝，成功構(gòu)建了pRed_cas9_recA_Δpoxb300質(zhì)粒，利用此單質(zhì)粒對lacZ基因敲除驗證了敲除效率，并且利用其攜帶的溫敏性復制起始位點通過提高培養(yǎng)溫度剔除質(zhì)?？蛇M行連續(xù)基因敲除。

理論上CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以靶向任何基因進行編輯，但實驗發(fā)現(xiàn)微生物中關(guān)鍵基因的敲除依然十分困難。CRISPR-Cas9系統(tǒng)針對不同的基因或宿主時，基因編輯往往會受到十分復雜的影響，除了gRNA選擇的影響外，基因組編輯效率還受到非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源重組（homology directed repair，HDR）DNA修復機制的影響［6］。前期關(guān)于CRISPR-Cas9系統(tǒng)已有大量報道提供了優(yōu)化策略，以提高基因編輯效率和避免脫靶效應(yīng)［7-8］，但依然未能解決關(guān)鍵基因敲除效率下降的問題。在微生物的代謝改造中，根據(jù)設(shè)計需求往往需要對影響宿主生長及代謝的關(guān)鍵靶點基因進行單個或連續(xù)的基因編輯，以改變宿主的生長狀態(tài)或代謝流流向，達成代謝改造目的［9-10］。但由于某些基因的特殊性以及突變體的代謝特性變化等，在編輯關(guān)鍵基因的過程中會出現(xiàn)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的“失靈”，造成編輯效率極低或者不能完成編輯［11］。gltA為檸檬酸合酶編碼基因，是控制代謝流進入三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，敲除可嚴重降低大腸桿菌的生長速率［12］，Heo等［13］對gltA基因的編輯效率僅為30%左右，低于其他基因（frdA等）的編輯效率。kefB基因編碼受谷胱甘肽調(diào)節(jié)的鉀外排系統(tǒng)蛋白KefB［14］，可防止鉀離子與親電試劑的結(jié)合，催化K+/H+逆濃度跨膜，對于細胞信號傳導以及維持細胞的滲透壓具有重要的作用，Jiang等［15］嘗試通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)對此基因進行改造，經(jīng)同源臂長度等優(yōu)化依然未能成功獲得基因缺失的突變株。由此可見，對于大部分基因，包括那些本身對細胞生長和代謝平衡影響較小的基因以及功能可被替代的基因進行編輯時，均可通過優(yōu)化編輯過程獲得較高的編輯效率。但對細胞生存具有重大意義的基因進行編輯時往往比較困難，因此在編輯宿主的關(guān)鍵基因時需要根據(jù)實際需求優(yōu)化基因編輯系統(tǒng)，以提升編輯效率。

大腸桿菌中，磷酸果糖激酶（pfk編碼）是糖酵解途徑的主要限速酶之一，包含由pfkA、pfkB兩個基因編碼的同工酶I和同工酶II，可依靠ATP提供的磷酸基團催化果糖6-磷酸生成果糖1，6-二磷酸［16］。果糖1，6-二磷酸屬于糖酵解途徑的主要中間代謝產(chǎn)物之一，決定進入糖酵解ATP和NADH產(chǎn)生階段的代謝流的多少。另外，葡萄糖的另一代謝去路是經(jīng)6-磷酸葡萄糖脫氫酶（zwf編碼）催化進入磷酸戊糖途徑［17］。6-磷酸葡萄糖脫氫酶是葡萄糖進入磷酸戊糖途徑的第一個催化酶，催化6-磷酸葡萄糖氧化為6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，控制著整個磷酸戊糖途徑的代謝通量。有研究表明，通過zwf基因的缺失可促進甘油的利用［18］。甘油代謝是由甘油激酶（glpK編碼）在ATP存在下催化甘油生成3-磷酸甘油后進入糖酵解途徑，該催化反應(yīng)是甘油代謝的限速步驟，對于甘油的利用至關(guān)重要［19］。此前研究表明，pfk、zwf基因缺失及glpK基因過表達的突變體在碳源利用試驗中表現(xiàn)出十分明顯的代謝表型差異。前期工作中，我們嘗試利用Zhao等［5］建立的單質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)進行pfk、zwf基因的敲除及glpK基因的敲入，但編輯效率很低，且有的基因無法獲得突變株。因此在本研究中優(yōu)化了雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)，成功獲得了pfkB敲除及glpK敲入的突變株，且提高了pfkA、zwf基因的編輯效率。對獲得的突變株利用碳源的效率進行了驗證，進一步確認了基因缺失與突變體代謝能力的關(guān)系。本研究優(yōu)化得到的雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)為關(guān)鍵基因編輯效率較低的問題提供了可行性解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Top10為克隆宿主，用于質(zhì)粒構(gòu)建；大腸桿菌MG1655（DE3）為代謝改造出發(fā)菌株；pEasy-T3質(zhì)粒購自北京全式金公司，用于構(gòu)建攜帶gRNA和同源臂的編輯質(zhì)粒；pRed_cas9_recA_Δpoxb300質(zhì)粒購自MolecularCloud，是Cas9表達載體。Sugar-ParkI，10 μm，6.5 mm×300 mm色譜柱購自Waters公司，用于分析發(fā)酵底物葡萄糖和甘油的消耗。DNA聚合酶、重組酶、質(zhì)粒小提中量試劑盒等相關(guān)的酶均購自Vazyme公司；卡那霉素、氨芐青霉素鈉購自北京索萊寶科技有限公司；其余試劑購自上海國藥集團化學試劑有限公司。A20高效液相色譜儀購自日本島津公司；凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；其余菌體培養(yǎng)搖床及恒溫培養(yǎng)箱均為國產(chǎn)設(shè)備。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 大腸桿菌克隆宿主Top10和大腸桿菌MG1655（DE3）在LB中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，200 r/min，抗生素根據(jù)質(zhì)粒攜帶標記基因進行添加，卡那霉素添加濃度為50 μg/mL，氨芐青霉素為 100 μg/mL ；攜帶有 pRed_cas9_recA_Δpoxb300質(zhì)粒的宿主MG1655-pox300在30℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加卡那霉素；在MG1655-pox300宿主基礎(chǔ)上導入靶基因敲除質(zhì)粒的宿主MG1655-pox300-pΔpfkA、MG1655-pox300-pΔpfkB、MG1655-pox300-pΔzwf、MG1655-pox300-pΔABE∷glpK在 30℃ 培 養(yǎng)， 培 養(yǎng)基中添加卡那霉素和氨芐青霉素。經(jīng)基因編輯的菌株 MG1655-ΔpfkA、MG1655-ΔpfkB 和 MG1655-Δzwf在M9培養(yǎng)基中發(fā)酵，MG1655-ΔABE∷glpK菌株在MK5（含0.5%甘油且無葡萄糖的M9培養(yǎng)基）和MK105（含1%葡萄糖和0.5%甘油的M9培養(yǎng)基）中培養(yǎng)，驗證突變株對碳源的利用情況。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 從MG1655（DE3）大腸桿菌基因 zwf、pfkA、pfkB、nagABE中選取靶向20 nt序 列（ 分 別 為 pfkA 5′-gtgtctgacatgatcaaccg-3′；pfkB 5′-cacgtacatgtggaagcaag-3′；zwf 5′-gcgtgctgactgggataaag-3′；nagABE 5′-cctgcagcgccagtgctttc-3′）， 設(shè)計引物并以pRed_cas9_recA_Δpoxb300質(zhì)粒為模板擴增出gRNA scaffold基因片段，啟動子J23119與gRNA scaffold序列通過overlap PCR連接在一起啟動gRNA的表達，獲得的連接片段與pEASY-T3載體使用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物導入大腸桿菌克隆宿主Top10中，37℃培養(yǎng)，PCR篩選陽性菌落，獲得質(zhì) 粒 pΔpfkA-gRNA、pΔpfkB-gRNA、pΔzwf-gRNA 和pΔABE-gRNA。使用Sbf I、Nde I限制性內(nèi)切酶37℃處理上述質(zhì)粒2 h，凝膠電泳回收載體片段，并與從MG1655（DE3）基因組中擴增的基因上下游同源臂片段（～500 bp）混合，使用2×Express clone試劑盒（諾唯贊）在50℃連接15 min，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10中，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子 獲 得 質(zhì) 粒 pΔpfkA、pΔpfkB、pΔzwf、pΔABE（ 表1）。以畢赤酵母GS115基因組為模板，擴增glpK基因片段，并與通過Xho I、Sbf I限制性內(nèi)切酶處理的pΔABE質(zhì)粒片段連接，導入大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞中，篩選獲得質(zhì)粒pΔABE∷glpK。glpK基因由T7啟動子啟動表達。大腸桿菌Top10化學感受態(tài)細胞外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法參照商品說明（天根，北京），大腸桿菌MG1655（DE3）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化均采用電轉(zhuǎn)化方式，感受態(tài)制備參照Yoshida等［20］的方法。本研究所用引物如表2所示。單質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)分別通過PCR方式將gRNA與同源臂序列組裝至pRed_cas9_recA_Δpoxb300質(zhì)粒上，單質(zhì)粒系統(tǒng)的20 nt靶向序列與雙質(zhì)粒系統(tǒng)相同。構(gòu)建成功 pRAΔpfkA、pRAΔpfkB、pRAΔzwf和pRAΔABE∷glpK，構(gòu)建參照Zhao等［5］的方法。

表1 本研究中使用的菌株和質(zhì)粒Table1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.3 基因敲除 雙質(zhì)?；蚯贸姆椒ㄈ缦拢菏紫葘Red_cas9_recA_Δpoxb300質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化導入 MG1655（DE3）中獲得 MG1655-pox300菌株；其 次 將 構(gòu) 建 好 的 質(zhì) 粒 pΔpfkA、pΔpfkB、pΔzwf、pΔABE∷glpK分別轉(zhuǎn)化至MG1655-pox300中，在含有卡那霉素和氨芐青霉素的雙抗性LB平板上篩選獲得包含有兩個質(zhì)粒的菌株分別命名為MG1655-pox300-pΔpfkA、MG1655-pox300-pΔpfkB、MG1655-pox300-pΔzwf、MG1655-pox300-pΔABE∷glpK，并將上述菌株接種到同樣的雙抗性LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)16 h后涂布于含有2 g/L阿拉伯糖的雙抗固體LB平板上，誘導CRISPR-Cas9表達進行基因編輯。篩選平板在30℃條件下培養(yǎng)18 h，通過使用滅菌的牙簽隨機挑選單菌落，并進行菌落PCR確認基因敲除或敲入的效果。獲得的突變菌株在42℃下傳代5次丟除所有質(zhì)粒。

單質(zhì)?；蚯贸襟E如下：將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pRAΔpfkA、pRAΔpfkB、pRAΔzwf、pRAΔABE∷glpK分別導入MG1655（DE3）感受態(tài)中，在卡那霉素抗性平板中進行基因編輯。具體基因編輯步驟參照Zhao等［5］的方法。

1.2.4 葡萄糖及甘油高效液相色譜（HPLC）檢測大腸桿菌MG1655（DE3）、MG1655-ΔpfkA、MG1655-ΔpfkB、MG1655-Δzwf、MG1655-ΔABE∷glpK 使用 M9、MK5、MK105培養(yǎng)基進行發(fā)酵，分別在0、3、6、9、12、24、72 h進行取樣。葡萄糖、甘油濃度測定采用高效液相色譜法。高效液相色譜儀為島津20A，使用 Sugar-Park I色譜柱（10 μm，6.5 mm×300 mm），流動相為H2O，流速0.6 mL/min，柱溫80℃，上樣量10 μL，利用示差檢測器RID-20A進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建

大腸桿菌CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)主要包括Cas9、gRNA和同源臂3個部分，其中Cas9蛋白起著切割基因組的作用，因此Cas9相對于細胞來說具有一定的毒性，其表達量過大可能會造成細胞的死亡［21］。而gRNA起著引導Cas9蛋白尋找靶位點的作用，同源臂則負責修復被CRISPR-Cas9系統(tǒng)切斷的基因組，因此如果兩者的濃度過低會造成Cas9無法找到靶位點或切斷的基因組無法被修復，由此會造成編輯效率的降低或編輯的失敗。通常的研究會把Cas9、gRNA和同源臂3個部分置于一個質(zhì)粒上（稱為單質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)，圖1-A），往往會造成三者之間的比例不協(xié)調(diào)，從而導致基因編輯效率低下。基于此，本研究中拆分Cas9蛋白和同源臂-gRNA單元為兩個獨立的部分，通過控制Cas9蛋白的表達，并增加同源臂-gRNA濃度的方式進行基因的編輯。Cas9蛋白被置于低拷貝的質(zhì)粒上（復制子pSC101，拷貝數(shù)約為5）［22］，并采用誘導表達的方式控制表達量；同源臂-gRNA單元被置于高拷貝的質(zhì)粒上（復制子pMB1，拷貝數(shù)＞500）［23］，并采用強啟動子J23119控制gRNA的表達，以提高gRNA的表達量及同源臂的濃度（圖1-B）。攜帶有Cas9蛋白和攜帶有同源臂-gRNA單元的兩個質(zhì)粒協(xié)同作用便可完成基因組編輯的功能，即為雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)。

圖1 雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化Fig. 1 Optimization of double-plasmid CRISPR-Cas9 system

續(xù)表Continued

2.2 糖酵解途徑關(guān)鍵基因的敲除

磷酸果糖激酶pfkA、pfkB是大腸桿菌糖酵解途徑中的關(guān)鍵基因，這兩個基因的敲除會對大腸桿菌利用葡萄糖的能力產(chǎn)生一定的影響。因此本研究首先選擇這兩個基因進行敲除驗證雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)的編輯效率。分別選擇5′-gtgtctgacatgatcaaccg-3′（pfkA 20 nt）和 5′-cacgtacatgtggaagcaag-3′（pfkB 20 nt）序列作為pfkA和pfkB基因敲除的引導序列，所用同源臂長度均為500 bp左右，以此分別構(gòu)建了單質(zhì)粒和雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9基因敲除系統(tǒng)。通過檢測引物對基因敲除結(jié)果進行確認，如表3和圖2所示。隨機挑選16個克隆子進行敲除效率驗證，其中雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)對pfkA基因敲除中共獲得6個陽性克隆子，基因敲除效率為37%；pfkB基因敲除中共獲得1個陽性克隆子，基因敲除效率為6%。單質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)可成功敲除pfkA基因，16個隨機樣本中陽性克隆子為1個，效率僅為6%，而在嘗試敲除pfkB基因時未能檢測到基因敲除的陽性突變株。由此可見，雙質(zhì)粒CRISPRCas9系統(tǒng)在敲除大腸桿菌糖酵解途徑關(guān)鍵基因時效率明顯高于單質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)。

圖2 pfkA、pfkB基因敲除電泳結(jié)果Fig. 2 Identification of pfkA and pfkB deletion by gel electrophoresis

表3 基因編輯效率比較Table 3 Comparison of gene editing efficiency

2.3 糖酵解基因敲除對細胞葡萄糖代謝的影響

將獲得的突變株MG1655-ΔpfkA和MG1655-ΔpfkB在以葡萄糖為唯一碳源的M9培養(yǎng)基中發(fā)酵，并表征糖酵解途徑關(guān)鍵基因pfkA和pfkB的敲除對菌體代謝葡萄糖的影響（圖3-A）。結(jié)果表明，敲除pfkA或pfkB基因會對大腸桿菌利用葡萄糖的能力產(chǎn)生不同的影響。pfkA被認為是主要的催化酶，敲除后對突變體葡萄糖分解代謝呈現(xiàn)出較大的影響。與野生株相比，突變株MG1655-ΔpfkA的葡萄糖消耗速率在發(fā)酵前期（12 h內(nèi)）明顯降低，但是經(jīng)過一段時間的適應(yīng)后，葡萄糖消耗速率迅速提高，最終的葡萄糖總消耗量略高于野生株，72 h消耗量為4 g/L。與葡萄糖的消耗相對應(yīng)，突變株MG1655-ΔpfkA的生長速率在對數(shù)生長期相較于野生株也有所降低（圖3-B）。敲除pfkB基因后的突變體MG1655-ΔpfkB的葡萄糖消耗速率相較于野生株也被減緩了，但略高于pfkA缺陷株，最終經(jīng)72 h培養(yǎng)后菌體消耗葡萄糖量為3.5 g/L，小于野生株的3.9 g/L。

圖3 pfkA、pfkB基因敲除菌株表型驗證Fig. 3 Verification of the phenotypes of pfkA and pfkB deleted mutants

2.4 磷酸戊糖途徑關(guān)鍵基因的敲除

為了進一步驗證雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)的敲除效率，再次選擇磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵基因zwf進行敲除。5′-gcgtgctgactgggataaag-3′序列被用作zwf敲除的引導序列，同源臂長度同樣為500 bp左右，構(gòu)建單質(zhì)粒和雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)。隨機挑選8個單克隆進行基因敲除效率的驗證，結(jié)果顯示，雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除zwf基因的樣本全部為陽性克隆子，敲除效率達到100%，而單質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)共獲得3個陽性克隆，敲除效率僅為37%（圖4和表3）。結(jié)果再次證明雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)在敲除大腸桿菌關(guān)鍵基因時效率優(yōu)于單質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)。

圖4 zwf基因敲除電泳結(jié)果Fig. 4 Identification of zwf deletion by gel electrophoresis

2.5 磷酸戊糖途徑關(guān)鍵基因敲除對葡萄糖代謝的影響

敲除zwf基因的缺陷型菌株MG1655-Δzwf在以葡萄糖為唯一碳源的M9培養(yǎng)基中的生長受到嚴重的阻礙，葡萄糖消耗速率降低了大約32%，經(jīng)72 h發(fā)酵葡萄糖消耗總量降低了1.2 g/L（圖5-A）。缺失zwf基因的突變株生長也受到了較大程度的影響，與葡萄糖消耗保持相似的規(guī)律（圖5-B）。zwf基因的缺失阻礙了磷酸戊糖途徑的下游代謝，導致NADPH合成受阻，其參與的代謝活動被抑制。NADPH在大腸桿菌代謝活動中的全局參與度較高，因此在其合成受到抑制時造成對葡萄糖分解代謝整體的影響較大。

圖5 zwf基因敲除菌株表型驗證Fig. 5 Characterization of the phenotypes of zwf deleted mutant

2.6 基因敲入效率

除了基因敲除外，對雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因敲入效率也進行了驗證。在大腸桿菌基因組中，nagA、nagB、nagE連續(xù)排列，通過選擇靶向于nagB 基因的引導序列 5′-cctgcagcgccagtgctttc-3′，選用nagA基因上游和nagE下游的長度約500 bp的序列作為同源臂，并在同源臂中間添加來源于畢赤酵母的glpK基因，構(gòu)建單質(zhì)粒和雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9基因替換系統(tǒng)。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pΔABE∷glpK導入MG1655-pox300中，依照建立的雙質(zhì)粒CRISPRCas9系統(tǒng)突變株篩選流程進行基因替換。如圖6所示，使用雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)在nagABE基因位點整合glpK，在10個隨機樣本中共獲得1個陽性克隆子，基因敲入效率為10%。與之相對比，使用單質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)時glpK基因未能整合至MG1655（DE3）的基因組中。結(jié)果說明，雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)在大腸桿菌基因敲入方面也具有一定的優(yōu)勢。

圖6 nagABE與glpK基因替換電泳結(jié)果Fig. 6 Identification of nagABE replaced by glpK via gel electrophoresis

2.7 MG1655-ΔABE∷glpK突變株的甘油利用效率

通過將來源于畢赤酵母GS115的甘油激酶基因glpK整合至大腸桿菌MG1655（DE3）的nagABE位點，獲得MG1655-ΔABE∷glpK突變株。在以甘油為唯一碳源或甘油、葡萄糖混合碳源的兩種培養(yǎng)基中測定MG1655-ΔABE∷glpK突變株的甘油代謝狀態(tài)，并繪制甘油代謝曲線如圖7所示?；旌咸荚碝K105（含葡萄糖和甘油混合碳源）中MG1655-ΔABE∷glpK突變株的甘油消耗速率遠大于野生株，野生株中的甘油利用受到強烈的葡萄糖抑制。而整合甘油激酶的大腸桿菌MG1655-ΔABE∷glpK受到葡萄糖的抑制作用減弱，在72 h發(fā)酵中消耗了0.8 g/L甘油。在MK5培養(yǎng)基中（以甘油為唯一碳源），MG1655-ΔABE∷glpK對甘油的代謝能力相比于野生株提高了30%，72 h消耗甘油量為3.2 g/L（圖7）。

圖7 MG1655-ΔABE∷glpK突變株甘油利用狀況Fig. 7 Glycerol utilization by MG1655-ΔABE∷glpK mutant

3 討論

近年來，CRISPR-Cas9基因編輯工具及其突變體如nCas9、dCas9等［24-25］因其在基因編輯及基因表達抑制中特異性較高、編輯效率高及編輯周期短等特點被廣泛應(yīng)用于多種生物中［26-28］。對于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化已經(jīng)有許多文獻的報道，通過設(shè)計合理的gRNA、延長同源臂序列長度以及額外表達λ-red等促進同源重組的蛋白都可以提高基因編輯效率［29］。李秋月等［30］利用在線軟件設(shè)計gRNA并通過體外檢測篩選出最優(yōu)的gRNA用于載體的構(gòu)建，在番茄子葉中顯著提高了CRISPR-Cas9的編輯效率。Baker等［31］為了優(yōu)化CRISPR-Cas9系統(tǒng)的編輯效率，在小鼠胚胎干細胞中使用次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶測定法測量了Cas9系統(tǒng)的編輯效率與同源臂長度之間的關(guān)系。研究表明，CRISPR-Cas9系統(tǒng)中基因的編輯效率隨著同源臂長度的增加而提高，與0.4 kb同源臂相比，在4 kb同源臂下可使基因編輯效率提升約5倍，同源臂長度為20 kb時編輯效率提升約10倍。Su等［32］利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在大腸桿菌代謝改造中通過λ-Red輔助的同源重組，將最大12 kb的DNA模塊整合到大腸桿菌W3110的染色體中。該方法的效率可以達到100%，顯著提高了外源基因敲入的效率。

雖然通過一些優(yōu)化策略可以提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)的編輯效率，但不得不承認，即使是針對大腸桿菌這種廣泛應(yīng)用于生化實驗中的模式宿主菌，CRISPR-Cas9系統(tǒng)也難以保證對基因組中的所有基因都可以高效編輯。由于某些基因在維持宿主生存或重要代謝過程中發(fā)揮極其重要的作用，因此這些基因的編輯效率相比其他非關(guān)鍵基因會有很大程度的降低，甚至不能編輯。本研究從增加gRNA的表達及同源臂在菌體中濃度的角度出發(fā)，將CRISPRCas9系統(tǒng)拆分成Cas9蛋白和同源臂-gRNA單元兩個部分，分別組裝至低拷貝質(zhì)粒和高拷貝質(zhì)粒上，進行非等濃度的表達。這樣既可以降低Cas9蛋白過量表達對細胞造成的毒害作用［33］，又可以通過飽和的gRNA和同源臂完成靶位點的尋找、切割及重組。試驗結(jié)果證明，在敲除糖酵解和磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵基因時，雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因敲除效率明顯優(yōu)于單質(zhì)粒系統(tǒng)。而且在大腸桿菌基因組整合試驗中，雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)也具有一定的優(yōu)勢。這些結(jié)果均說明，提高引導Cas9蛋白對DNA切割的gRNA的表達量和維持過量的同源臂片段有利于篩選獲得突變株。前期的實驗也表明，以卡那霉素維持菌體內(nèi)的Cas9蛋白表達質(zhì)粒pRed_cas9_recA_Δpoxb300，可輕易通過連續(xù)傳代在完成無痕基因編輯后去除同源臂-gRNA供體質(zhì)粒。因此，在保持pRed_cas9_recA_Δpoxb300質(zhì)粒的同時，通過更換攜帶有不同gRNA和同源臂的供體質(zhì)粒即可完成連續(xù)的基因編輯。這樣在提升編輯效率的同時也大大降低了代謝改造的工作量和操作難度，為高效構(gòu)建大腸桿菌工程菌株奠定了基礎(chǔ)，也為在其他微生物中建立更加高效、便捷的基因編輯方法提供了借鑒。

4 結(jié)論

本研究通過提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)中g(shù)RNA的表達量及同源臂在菌體中的濃度，在大腸桿菌中優(yōu)化了雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)高效敲除了糖酵解途徑關(guān)鍵基因pfkA、pfkB和磷酸戊糖途徑關(guān)鍵基因zwf，并成功將甘油激酶glpK基因整合到nagABE基因簇位點。與單質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)相比，優(yōu)化的雙質(zhì)粒CRISPR-Cas9系統(tǒng)無論在關(guān)鍵基因的敲除或外源基因的敲入方面均具有更高的效率。