劉寧，陳秀荔，黃欣

1.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁殖重點實驗室，武漢 430070;2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學研究院，南寧 530021

核糖核酸酶(RNase A)是一類在脊椎動物中存在的核酸水解酶。很多研究表明該基因家族的幾個成員具有明顯的消化、水解RNA、抗菌及抗病毒的作用[1-4]。胰核糖核酸酶(RNase 1)屬于RNase A超家族，具有RNase A超家族的結(jié)構(gòu)特征，其蛋白序列包含1個內(nèi)含子和2個外顯子，在第2個外顯子上具有完整的CDS(coding sequence)區(qū)[5]，包含6～8個半胱氨酸形成的2個二硫鍵，具有特有的“CKXXNTF”氨基酸序列。有關(guān)RNase 1在哺乳動物中研究很多，例如人類(Homosapiens)[6]、牛(Bostaurus)[7]及葉猴(Pygathrixnemaeus)[8]等，特別是在其基因進化以及生物學功能研究方向。RNase1基因在哺乳動物中普遍存在基因拷貝，葉猴通過基因復制產(chǎn)生的RNase1B具有與小腸一致的較低pH環(huán)境，是其對植食性的一種適應[8]。Yu等[9]發(fā)現(xiàn)食肉目鼬科(Mustelidae)RNase1出現(xiàn)基因復制，推測與它們的進食快又多的特點相適應。嚙齒類和食肉類動物腸道中缺少幫助消化的微生物，消化結(jié)構(gòu)簡單，卻廣泛表現(xiàn)出RNase1基因拷貝現(xiàn)象，促使研究者們?nèi)ヌ接慠Nase1基因重復所產(chǎn)生的新功能[10-12]。隨著對高等脊椎動物RNase1基因分子進化機制及食性適應性進化研究的深入，低等脊椎動物RNase1基因研究也在不斷開展。

關(guān)于魚類RNase 1的研究較少，目前僅在斑馬魚(Daniorerio)[13]、大西洋鮭(Salmosalar)[14]和團頭魴(Megalobramaamblycephala)[15-16]等有報道。鯉科魚類是我國分布最廣、種類最多的淡水經(jīng)濟魚類，它們的食性廣泛且存在差異。故本研究通過對基因組中不同食性鯉科魚類的RNase1基因進行序列和進化分析，進一步探討不同鯉科魚類RNase1基因結(jié)構(gòu)及基因表達水平的差異，研究魚類RNase 1結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，同時在不同食性魚類之間闡釋RNase 1的系統(tǒng)進化關(guān)系，旨在為進一步研究魚類RNase1基因提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

成年草魚(Ctenopharyngodonidella)、翹嘴鲌(Culteralburnus)、鳙(Hypophthalmichthysnobilis)和團頭魴來自華中農(nóng)業(yè)大學鄂州水產(chǎn)實驗基地。試驗用魚在實驗室暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間保證溶氧充足，水溫合適。樣品采集前用氨基甲酸乙酯對魚體進行麻醉，75%的乙醇消毒，在冰上采集團頭魴、草魚、鳙和翹嘴鲌的肌肉、肝臟、脾臟、性腺、心臟、腎臟、腸、腦、鰓和血液10種組織迅速放入凍存管，置于液氮罐，之后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱備用。

1.2 鯉科魚類RNase 1基因的鑒定及序列特征分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載青鳉(Oryziaslatipes)、斑馬魚、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)等RNase1基因序列作為比對序列，在團頭魴、草魚、鯉(Cyprinuscarpio)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙及翹嘴鲌的全基因組數(shù)據(jù)庫中比對分析，鑒定出7種魚類的RNase1基因序列。鳡(Elopichthysbambusa)及黃尾鲴(Xenocyprisdavidi)的RNase1基因序列由筆者所在實驗室前期克隆保存。對9種鯉科魚類的RNase 1蛋白序列進行序列分析，首先利用BioEdit軟件進行初級序列分析和氨基酸、核苷酸序列比對，然后在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)上BLAST檢測氨基酸序列的相似性。使用在線軟件pI/Mw(http://web.expasy.org/compute_pi)測定RNase 1蛋白質(zhì)等電點及分子質(zhì)量等基本物理化學性質(zhì)。用在線軟件SignalP 4.1對RNase 1進行編碼信號肽序列的預測。用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)同源建模的方法對9種鯉科魚類RNase 1的三級結(jié)構(gòu)進行預測，之后利用PyMOL軟件對鯉科魚類RNase 1的三級結(jié)構(gòu)進行可視化。

1.3 鯉科魚類RNase 1的系統(tǒng)進化分析

為分析硬骨魚類和哺乳動物RNase 1的進化關(guān)系，在NCBI數(shù)據(jù)庫分別下載陸生哺乳動物、水生哺乳動物RNase 1序列，大西洋鮭(Salmosalar)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的RNase1基因序列從Cho等[13]的研究中獲得，將上述序列與本研究鑒定的9種鯉科魚類的RNase 1序列采用CLC Sequence Viewer 6軟件進行多序列比對，利用MEGA 5.0[17]使用最大似然法(ML)和最大簡約法(MP)，重復檢測 1 000次，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 鯉科魚類RNase 1基因表達分析

用TRIZOL裂解法提取團頭魴、鳙、翹嘴鲌和草魚的心臟、腦、腎、肌肉、鰓、血液、脾臟、性腺、腸和肝臟的總RNA。然后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，并使用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific，美國)測量濃度。利用PrimeScript RT reagent KIT(TaKaRa，日本)試劑盒將每種魚類不同組織總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用PRIMER 5.0根據(jù)CDS區(qū)設計qRT-PCR引物(表1)。qRT-PCR反應使用Light Cycler 480(Roche，瑞士)，以β-actin作為內(nèi)參基因。qRT-PCR條件為95 ℃預變性45 s；95 ℃模板變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，進行35個循環(huán)，最后繪制熔解曲線?；虮磉_定量采用ΔΔCt 相對定量法計算。

表1 RNase 1基因的引物序列信息 Table 1 Primer sequence ofRNase 1 genes

2 結(jié)果與分析

2.1 鯉科魚類RNase 1的同源性和理化性質(zhì)

經(jīng)過數(shù)據(jù)庫搜索比對、鑒定與注釋，最終獲得9種魚的完整RNase1基因序列。鯉科魚類基因組中只存在1個RNase1基因。利用Bio-Edit軟件對9種魚RNase 1序列同源性進行分析比對，結(jié)果顯示9種鯉科魚類的RNase 1氨基酸序列相似度較高(圖1A)，其中鰱與其他魚類相似度范圍最高(0.686～0.992)，鯉與其他魚類的RNase 1氨基酸序列的相似度最低(0.594～0.695)。對RNase 1蛋白質(zhì)的等電點、分子質(zhì)量等基本物理化學性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，9種鯉科魚類RNase 1蛋白質(zhì)序列的物理化學特征非常相似，等電點在8.85～9.24、分子質(zhì)量在14.46～14.90 ku；9種鯉科魚類帶正電的殘留總數(shù)為18～21個(圖1B)。

Cc：鯉 Cyprinus carpio； Xd：黃尾鲴 Xenocypris davidi； Hn：鳙 Hypophthalmichthys nobilis； Hm：鰱 Hypophthalmichthys molitrix； Ci：草魚 Ctenopharyngodon idella； Ma：團頭魴 Megalobrama amblycephala； Eb：鳡 Elopichthys bambusa； Ca：翹嘴鲌 Culter alburnus； Dr：斑馬魚 Danio rerio； pI：等電點 Isoelectric point； Mw：分子質(zhì)量 Molecular weight； K No.：賴氨酸的數(shù)量 Number of Lys； R No.：精氨酸的數(shù)量 Number of Arg； Total：帶正電的殘留總數(shù)(賴氨酸和精氨酸) Total number of positively charged residues (Lys+Arg).

2.2 鯉科魚類RNase 1氨基酸多序列比對及三級結(jié)構(gòu)預測

多序列比對結(jié)果顯示，鯉科魚類的氨基酸數(shù)均在150個左右，具有RNase A超家族的結(jié)構(gòu)特征：N端有由20多個氨基酸組成的信號肽序列、His-Lys-His催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)、6個保守的半胱氨酸殘基及“CKXXNTF” motif序列(圖2A)。利用Swiss-Model在線軟件對其三級結(jié)構(gòu)進行同源建模，發(fā)現(xiàn)這9種鯉科魚類RNase 1的三級結(jié)構(gòu)非常相似，均由3個α螺旋、6個β折疊形成的二級結(jié)構(gòu)和6個Loop區(qū)域組成，保守位點分布在α螺旋和β折疊上(圖2B)。

2.3 RNase 1的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了更好地了解不同脊椎動物RNase 1的進化關(guān)系，構(gòu)建哺乳動物和硬骨魚基于RNase 1蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3、圖4所示：哺乳動物、嚙齒動物及硬骨魚RNase 1明顯分為不同的進化支。大多數(shù)嚙齒動物和陸生哺乳動物的RNase1基因都存在多拷貝，這是基因復制的結(jié)果，然而海洋哺乳動物及硬骨魚的RNase1基因均為單拷貝(圖3A、圖4A)。鯉科魚類RNase 1的MP與ML進化樹顯示，團頭魴與翹嘴鲌聚為一支，這與物種進化關(guān)系相符；MP進化樹顯示鳡與黃尾鲴聚為一支(圖3B、圖4B)。

圖3 哺乳動物和魚類RNase 1(A)與9種鯉科魚類的RNase 1(B)的ML的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 ML phylogenetic trees of RNase 1 in mammals and fishes(A) and nine of cyprinid fish(B)

圖4 哺乳動物和魚類RNase 1(A)與9種鯉科魚類的RNase 1(B)的MP的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4 MP phylogenetic trees of RNase 1 in mammals and fishes(A) and nine of cyprinid fish(B)

6個半胱氨酸(活動-位點殘基)用藍色圓圈標記，3個催化殘基用紅色三角形顯示；3個α螺旋(α1-α3)和6個β轉(zhuǎn)角(β1-β6)分別用紅色和黃色表示。The six structural cysteines (active-site residues) are marked with blue circle and three catalytic residues showed with red triangles. Locations of three α-helices (α1-α3) and six β-turns (β1-β6) are shown in red and yellow.

2.4 鯉科魚RNase 1基因的組織表達模式

選取植食性的團頭魴和草魚、雜食性的鳙和肉食性的翹嘴鲌進行不同食性魚類RNase1基因在不同組織中的表達模式的研究。qRT-PCR結(jié)果顯示(圖5)，RNase1基因在4種魚不同組織中的表達模式各不相同，其中在肝臟組織中的相對表達量高，差異達到極顯著水平(P<0.01)。除肝臟外，團頭魴RNase1基因在鰓和腎臟中也高表達，差異極顯著(P<0.01)，在心臟、血液、脾臟和性腺中也有表達(圖5A)；翹嘴鲌的RNase1基因只在肝臟和脾臟中高表達(P<0.01)，其他組織中均不表達(圖5B)；在鳙中，RNase1基因主要在肝臟和血液中表達，差異極顯著(P<0.01)，在其他組織中均不表達(圖5C)。與團頭魴不同的是，草魚RNase1只在肝臟中高表達，在其他組織中均不表達(圖5D)。

A:團頭魴 M. amblycephala； B:翹嘴鲌 C. alburnus； C:鳙 H. nobilis； D:草魚 C. Idella. M:肌肉 Muscle; H:心臟 Heart； B:腦 Brain； K ：腎 Kidney； G ：鰓 Gill； D： 血液 Blood； S：脾臟 Spleen； O：性腺 Gonad；I：腸 Intestine；L:肝臟 Liver.

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，硬骨魚與哺乳動物的RNase 1分為不同的進化支。在哺乳動物進化支中，大多數(shù)RNase1基因存在多個拷貝，特別是在草食性的葉猴和牛身上，然而魚類進化支上RNase1均為單拷貝基因，沒有發(fā)生復制，這表明RNase1基因復制是對其消化生理的一種適應[18]。魚類的RNase1基因在基因組中為單拷貝，一方面說明魚類RNase1進化過程中比較保守，另一方面說明RNase1在低等脊椎動物中適應性分化為特定功能。此外，不同食性鯉科魚類的RNase1進化顯示，相同食性的魚類并未聚類在一起，從進化角度說明鯉科魚類的RNase 1的進化與物種食性的關(guān)聯(lián)性不大，但符合物種進化的規(guī)律。

本研究中，9種不同食性的鯉科魚類RNase 1帶正電的氨基酸比例高。研究者們發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中，具有抗菌作用的RNase1具有較高的等電點[19-20]。Cho等[13]對斑馬魚RNase 1重組蛋白功能的研究發(fā)現(xiàn)，RNase 1蛋白具有較強的消化活性和抗菌功能，斑馬魚的RNase 1重組蛋白的等電點不高，但與雞一樣，帶正電的氨基酸比例很高。筆者所在實驗室前期對團頭魴RNase 1重組蛋白的研究也得出同樣的結(jié)論[21]。因此根據(jù)進化保守性，推測其在鯉科魚類中可能普遍具有抗菌功能。

目前對于RNase 1的生物學功能假設都集中于消化活性上。我們對RNase1在不同食性魚類的不同組織中表達模式進行研究，結(jié)果顯示不同食性的魚類表達模式存在差異，同種食性魚類相同組織的表達情況也不同。根據(jù)相對定量結(jié)果，不同食性鯉科魚類的RNase1基因在肝臟中的相對表達量均高。以往研究表明魚類的食性與其自身消化器官的構(gòu)造及內(nèi)源性消化酶的消化機能密切相關(guān)[22]。魚類肝胰臟分泌內(nèi)源性消化酶，是魚類重要的消化腺。而Cho等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚的成魚階段RNase1基因主要在肝臟和腸道中表達，其重組蛋白RNase 1的活性顯示出較強的抗菌功能，消化活性不強。在大西洋鮭中曾有報道，RNase的抗菌功能與消化活性之間沒有必然關(guān)系，它們互不影響，彼此獨立[23]。因此，4種鯉科魚類肝臟中高表達，其他組織中不表達或低表達，可能與斑馬魚一致，主要是在能量代謝方面發(fā)揮作用，是否具有消化活性，需要在今后的試驗中進行進一步基因功能驗證；同種食性的草魚和團頭魴在其他組織的表達存在顯著差異，表明RNase 1在同食性的魚類中可能具有不同的功能，故從基因表達水平也推測RNase1基因進化與其物種本身的食性相關(guān)性不大。在翹嘴鲌和團頭魴中，RNase1基因在脾臟中表達量較高，推測RNase 1可能與其免疫機能相關(guān)。RNase1基因在鳙血液中高表達，推測其可能參與了系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程，特別是血管穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。綜上所述，RNase1基因在不同組織中的表達模式各不相同，它們具體行使怎樣的生物學功能，還需要在進一步的試驗中進行深入探究。