韓光明，藍家樣，陳全求，張勝昔，李國榮

（湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中游棉花生物學與遺傳育種重點實驗室，武漢430064）

生物炭作為一種環(huán)境友好型土壤改良劑已被廣泛應用于農(nóng)業(yè)障礙性土壤的改良，對農(nóng)業(yè)土壤的質(zhì)量產(chǎn)生了積極的影響[1]。中國人口眾多，對基本農(nóng)產(chǎn)品的需求也較高，相對來說可耕地面積并不充足，因而連作現(xiàn)象比較普遍。然而，棉田連作不僅引起土壤嚴重退化，進而引起棉花產(chǎn)量下降。大多數(shù)農(nóng)民都采用土壤改良技術來幫助恢復土壤完整性[1]。盡管大多數(shù)研究關注使用生物炭對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的好處，長期連續(xù)施用生物炭被證實對棉田土壤細菌群落的多樣性有顯著影響[2]，但生物炭處理對不同連作年限棉田土壤細菌群落及代謝途徑的研究相對較少[3-4]。事實上，很少有關于施用生物炭對長期連作（超過20a）棉田土壤細菌群落組成的影響的研究。此外，這些研究也未能整合使用生物信息學技術提高研究結(jié)果和推論的準確性[2]。因此，為了確定生物炭作為土壤改良劑應用于多種長期連作土壤而引起的土壤細菌群落的響應，有必要整合生物信息學綜合分析技術以提高分析的可靠性[5]。通過探究在不同連作年限棉田中施用不同量的生物炭作為土壤改良劑對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響，利用16SrRNA基因的高通量測序和基于生物信息學技術測定土壤細菌群落組成、關鍵物種、土壤細菌結(jié)構(gòu)和代謝功能，以及土壤微生物成分、比例和多樣性，以期為確定生物炭在不同連作年限棉田的最佳施用量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗地點位于新疆博樂市新疆金博種業(yè)中心的中試基地（北緯44°46′56.0”，東經(jīng)82°23′57.0”）。該地區(qū)位于新疆西北部的溫帶地區(qū)，與哈薩克斯坦接壤。年平均氣溫-17～23°C，平均降水量為181mm。選用湖北省農(nóng)科院經(jīng)濟作物研究所自育棉花（Gossypiumspp）品種ZD2040，該品種早熟抗黃萎病性強，青枝綠葉吐白絮。供試土壤樣品是從常規(guī)連續(xù)耕種5，10，20，40a棉田的表層（0～15cm）獲取的。根據(jù)聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織（FAO）分類指南，獲得的采樣土壤分類為強淋溶土，粘土含量為66.3%。供試土壤理化性質(zhì)見表1。

供試生物炭為山東豐本生物科技有限公司生產(chǎn)，是玉米芯經(jīng)炭化爐高溫熱解獲得，加熱速率為10℃·min-1，加熱到550℃。供試生物炭的理化性質(zhì)見表1。

表1 供試生物炭及土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of biochar and soil in the study

1.2 方法

為研究不同生物炭施用量（0，20，40t·hm-2）對不同連作年限（5，10，20，40a）棉田土壤細菌群落的影響，試驗共設12個處理，每個處理重復3次，共36個試驗區(qū)。在各試驗區(qū)清除石頭和植物殘渣后，將表層土與生物炭均勻混合。于2017年4月15日播種，行距50cm，株距10cm。試驗采用完全隨機區(qū)組設計。在整個試驗過程中采用人工除草，并在必要時澆水。生育期各試驗區(qū)統(tǒng)一施用同種復合肥料（N∶P∶K=15∶15∶15）。

花鈴期（7月25日）在棉花植株周圍5cm的范圍內(nèi)0～15cm深的土壤中隨機取10個土壤樣本，每個樣本取土100g；將重復樣本混勻后裝入冰盒，6h內(nèi)運送到實驗室，1周內(nèi)分析理化參數(shù)。將一部分土壤樣品冷凍保存（-80°C），用于土壤微生物分析，另一部分進行風干，研磨、過篩（1～2mm）后進行理化分析。

1.2.1 DNA提取及16SrRNA的PCR擴增 參照HAN等[2]的方法，使用土壤微生物總DNA提取試劑盒（OmegaBio-Tec，Inc.，USA）從土壤樣品中直接提取基因組DNA。在1%瓊脂糖凝膠上運行10μL的DNA樣品評估提取DNA的質(zhì)量。利用融合引物（正向引物341F：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG；反向引物805R：GACTGGAG TTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC）通過PCR對微生物基因組DNA 16SrRNA V3～V4的高可變性區(qū)域進行擴增。反應總體積50μL，包含5μL 10×PCR反應緩沖液（日本TakaRa），10ng DNA模板，前后引物各0.5μL，0.5μL dNTPs和0.5μL白金聚合酶（TakaRa，日本）。PCR擴增程序為：初始94℃3min，94℃30s，45℃退火20s，65℃退火30s，重復5個循環(huán)，隨后94℃持續(xù)20s，55℃持續(xù)20s和72℃持續(xù)30s，然后重復20個循環(huán)，最后72℃延伸5min。在1.5%瓊脂糖凝膠上進行PCR擴增產(chǎn)物的特異性測試，并使用QIAquick凝膠提取試劑盒進行純化。

1.2.2 Illumina測序及數(shù)據(jù)處理 參考HAN等[2]的方法，略有改動。使用Illumina MiSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）系統(tǒng)的雙端測序法對V3和V4擴增子進行測序。對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制檢查，并使用Prinseq軟件（PRINSEQ-lite 0.19.5）刪除質(zhì)量較差的測序數(shù)據(jù)。使用Flash軟件（FLASH v1.2.7），在無錯配的10bp讀段重疊的基礎上，組裝V3和V4雙端測序讀段，丟棄未組裝的讀段。從組裝的重疊群中適當修剪編碼區(qū)和測序引物。使用Uclust軟件（Uclust v1.1.579）對序列進行聚類，并使用3%的相似度將其分配給操作分類單位（OTU）。使用Greengenes數(shù)據(jù)庫上核糖體數(shù)據(jù)庫（RDP）樸素貝葉斯分類器（v.2.2），為每個序列分配分類學等級[6]。

1.2.3 分類地位鑒定 使用QIIME軟件實現(xiàn)操作分類單元（OTU）的識別，該軟件將OTU代表序列與相應數(shù)據(jù)庫的模板序列進行比較，以獲得與每個OTU對應的分類信息。每個特定的數(shù)據(jù)庫都用作不同類別序列的OTU分類狀態(tài)標識的模板序列[7]。利用MEGAN軟件（http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan6/）[8]構(gòu)建系統(tǒng)進化樹和分類樹，將每個樣本中包含的OTU豐度信息和分類學組成數(shù)據(jù)映射到NCBI網(wǎng)站（https://www.NCBI.nlm.nih.gov/Taxonomy）提供的微生物分類學層次樹中，以在標準分類層次結(jié)構(gòu)中顯示每個分類級別上所有樣本的具體組成。通過GraPhlAn（Asnicar et al.2015）和Krona軟件[9]進行比較分析。

1.2.4 群落多樣性分析 使用QIIME軟件通過Chao 1，Ace，Shannon和Simpson指數(shù)計算群落多樣性。根據(jù)OTU分類鑒定的結(jié)果計算每個樣品在屬水平下的組成。

1.2.5 主要物種的篩選 通過PLS-DA（偏最小二乘判別分析）進行細菌的比較分析和關鍵物種的篩選。

1.2.6 微生物代謝功能的簇分布和預測 通過R軟件Venn圖分析計算唯一和共享功能組的數(shù)量。利用KEGG數(shù)據(jù)庫預測重要的微生物代謝功能（http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 使用SPSS、QIIME和R軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計算均值差異，p值為0.05，使用LSD確定平均值之間的顯著差異。使用Mothur中的t檢驗和Metastats（http://metastats.cbcb.umd.edu/）來比較差異，并使用R中mt.rawp2adjp功能的BH方法以錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）調(diào)整所有p值。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭對連作棉田細菌類別的影響

MiSeq Illuminas測序后，產(chǎn)生了超過400，000條有效序列，平均長度為400bp。具有97%以上同一性序列分布在24，417個OTU中。通過MEGAN和Krona分析軟件對OTU進行比較分析，結(jié)果表明在屬水平3種生物炭施用量下，代爾夫特菌屬和蒼白桿菌屬被確定為連作棉田土壤中存在的優(yōu)勢細菌群（圖1），與棉花連作的年限無關。0t·hm-2生物炭處理的優(yōu)勢菌屬有乳酸桿菌屬、代爾福特菌屬、蒼白桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、無色桿菌屬、鞘氨醇單孢菌屬、根瘤菌屬和甲基桿菌屬。20t·hm-2生物炭處理的優(yōu)勢菌屬有蒼白桿菌屬、代爾福特菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、根瘤菌屬、無色桿菌屬、鞘氨醇單孢菌屬、乳酸桿菌屬、甲基桿菌屬等。而40t·hm-2生物炭處理的優(yōu)勢菌屬有蒼白桿菌屬、代爾福特菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、無色桿菌屬、根瘤菌、鮭色沉積物桿狀菌屬、甲基桿菌屬和無枝酸菌屬。使用GraPhlAn分析進一步證實了在20個相對豐富的細菌類群中，生物炭0t·hm-2施用量下單胞菌屬的豐度最高，而生物炭在20t·hm-2和40t·hm-2的施用量下蒼白桿菌屬豐度最高。而且，在生物炭處理區(qū)，變形桿菌綱、布魯氏菌科和叢毛單胞菌科的相對豐度顯著增加，而黃單胞菌和丙型變形菌的相對豐度降低（圖1）。

圖1 生物炭對長期連作棉田土壤細菌分類學組成的影響Figure 1 Effect of biochar on bacterial taxonomy in long-term continuous cropping cotton fields

2.2 生物炭對連作棉田土壤細菌α多樣性的影響

使用多種指標（Simpson、Chao 1、ACE和Shannon）表征供試土壤樣品中微生物群落的α多樣性。總的來說，Chao1和Ace指數(shù)衡量了微生物群落的豐富度，而Shannon和Simpson指數(shù)對微生物的豐富度以及稀有OUT、微生物均勻度和優(yōu)勢OUT則更敏感。使用QIIME軟件計算了4種多樣性指數(shù)。結(jié)果表明，施加生物炭提高了連作棉田微生物群落多樣性，并且在生物炭施用量為20t·hm-2時最高，在連作20a棉田達顯著水平（p＜0.05）（表3）。

表3 生物炭對連作棉田多樣性指數(shù)的影響Table 3 The influence of index of diversity of biochar to continuous cropping cotton fields

2.3 生物炭對連作棉田土壤細菌β多樣性的影響

β多樣性反映不同連作年限間土壤微生物群落構(gòu)成。根據(jù)給定的樣本分布信息，對群落結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進行偏最小二乘判別分析（PLSDA）。樣品的空間距離越接近，表示樣品的物種組成結(jié)構(gòu)越相似。對不同生物炭施用量處理下不同連作年限土壤樣品進行PLSDA分析顯示，不施用生物炭處理，連作20a以下3個棉田較接近，而連作40a棉田被明顯分開，說明連作20a以下3個棉田細菌物種組成結(jié)構(gòu)接近，與連作40a棉田細菌物種組成有較大差異。生物炭施用量為20t·hm-2時，不同連作年限棉田細菌物種組成差異不大。生物炭施用量為40t·hm-2時，連作40a棉田與連作20a及以下棉田的物種組成差異較大，說明20t·hm-2生物炭施用量可以有效改善長期連作棉田土壤微物的多樣性，而40t·hm-2的生物炭施用量對連作40a以上棉田細菌群落影響較?。▓D2）。

圖2 不同生物炭施用量下不同連作年限土壤樣本間的偏最小二乘法判別分析Figure 2 Partial least squares discriminant analysis among samples with different continuous cropping years under different biochar application concentrations

2.4 微生物代謝功能的簇分布和預測

通過R軟件計算，Venn圖和PICRUSt功能預測分析獨特共享功能組的結(jié)果表明（圖3），在代謝功能上，最高細菌相對豐度（＞0.09）為碳水化合物和氨基酸代謝，而最低細菌相對豐度（＜0.01）為其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成。基于細胞過程，最高的細菌相對豐度（＞0.02）都表現(xiàn)出細胞運動性，最低的細菌相對豐度（＜0.005）表現(xiàn)出細胞訊息傳遞。在環(huán)境信息處理方面，最高的細菌相對豐度（＞0.10）都表現(xiàn)為膜轉(zhuǎn)運，而最低的細菌相對豐度（＜0.01）表現(xiàn)為信號分子和相互作用。在遺傳信息處理方面，最高細菌相對豐度（＞0.05）表現(xiàn)為復制和修復，而最低細菌相對豐度（＜0.02）表現(xiàn)為折疊、分選和去輻射。

圖3 不同生物炭施用量下不同連作年限獨特和共享功能組分析Figure 3 Unique and shared functional group analysis for different continuous cropping years under different biochar application concentrations

3 討論與結(jié)論

細菌多樣性及其在土壤中相對比例的變化取決于不同的棉田生物炭處理和棉花連作年限。在20t·hm-2和40t·hm-2的生物炭施用量下，顯著增加了連作20a棉田土壤的細菌多樣性，而施用生物炭顯著降低了連作40a棉田土壤細菌的多樣性和豐富度。這些結(jié)果與LI等[10]的發(fā)現(xiàn)一致。生物炭處理對土壤微生物的影響是復雜且變化的，并且與生物炭的應用時間、類型和數(shù)量密切相關[10-12]。編碼16SrRNA基因的測序已被廣泛用于土壤中細菌群落的深入分析[13-14]。其與Chao 1、Ace、Shannon和Simpson的豐富度和多樣性指數(shù)一起，用于評估生物炭處理棉田土壤中細菌群落的多樣性。細菌類群在所有試驗區(qū)差異顯著（表3）。施用0，20，40t·hm-2生物炭的土壤與放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和變形桿菌門等4種原生菌相關聯(lián)。這與前人研究一致[8，15-16]。另外，正如CARSON等[17]揭示的那樣，棉田持續(xù)連作改變了土壤環(huán)境的物理化學狀態(tài)（例如pH，礦物質(zhì)含量，孔隙和粒徑）及水分和養(yǎng)分利用率，這也可能是影響細菌群落和土壤微生境的關鍵因素。

本研究表明，在生物炭施用量為0t·hm-2的情況下，連作5a和20a的棉田土壤樣品間的OUT相似度更高；在生物炭施用量為20t hm-2，連作10a和20a的棉田土壤樣品間OTU相似度更高；生物炭施用量在40t·hm-2下，連作5a和40a棉田土壤樣品間OTU相似度更高。此外，UPGMA還證實了在生物炭3種施用量下，連續(xù)種植5a和20a的樣品之間的OTU相似性均最高。這與CANNAVAN等（2016）[18]研究發(fā)現(xiàn)相一致，其研究發(fā)現(xiàn)生物炭影響包括微生物構(gòu)成在內(nèi)的幾種土壤參數(shù)，并且生物炭可以潛在地容納重要的微生物。當然，已經(jīng)證明生物炭作為土壤改良劑對土壤細菌群落具有重大影響，這可能會改善棉田連作系統(tǒng)的微生物多樣性[4，17]。

通過PLSDA進行的群落結(jié)構(gòu)判別分析表明，組間差異主要表現(xiàn)在0t·hm-2生物炭施用量棉花連作5a和40a的樣品、20t·hm-2生物炭施用量棉花連作20a和40a的樣品、40t·hm-2生物炭施用量棉花連作20a和40a的樣品。這證明了生物炭施用量和棉花連作對細菌群落結(jié)構(gòu)的綜合影響。AMARAL等[19]的一項研究表明，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用生物炭不僅影響土壤碳、氮和磷的含量，而且還影響細菌群落的組成和結(jié)構(gòu)。根據(jù)微生物功能組的預測豐度，在20t·hm-2生物炭施用量下，共有的功能組數(shù)量最少，表明在該施用量下存在獨特的土壤特性。獨特功能組最高數(shù)量出現(xiàn)在0t·hm-2和20t·hm-2生物炭施用量下連作10a棉田，以及在40t·hm-2生物炭施用量下棉花連作40a棉田。研究表明細菌簇的分布與土壤性質(zhì)如碳含量有關[19]，資源的有限利用可能會通過增強微生物運動來促進早期微生物簇的形成[20]。此外，在資源有限的環(huán)境中，為了生存以及早期微生物簇的形成，及其隨后的動力學，微生物更喜歡相對簇生長模式而不是分散模式[20]。

理想情況下，細菌群落的整體代謝途徑可以根據(jù)各自實體在代謝途徑中起主要作用的必需資源的可用性，以及被用來調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能重要的種間相互作用來預測[21]。本研究表明，即使棉花連作會影響細菌多樣性，但基于其在整個生物炭處理中的代謝功能，這些細菌群落的豐度也沒有明顯變化。但是，代謝功能（碳酸鹽和氨基酸代謝，細胞運動，膜運輸，復制和修復等）表現(xiàn)為較高的細菌相對豐度。在生物炭處理下，連作20a棉田土壤表現(xiàn)出最佳的細菌豐度。碳水化合物和氨基酸代謝物相關細菌群落可能對整體土壤肥力有利。實際上，這提供了額外的證據(jù)，即生物炭的施用量和棉花連作不僅影響土壤細菌的多樣性，而且還影響特定代謝功能的特定群落的相對豐度，其中一些有益于提高作物生產(chǎn)力。

研究結(jié)果表明，在連作20a棉田，施用生物炭對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)、α多樣性、β多樣性和代謝功能性質(zhì)具有顯著增益的效果，并且在生物炭施用量為20t·hm-2和40t·hm-2時表現(xiàn)為最高的細菌多樣性。但是，與棉花連作20a相反，連作40a的較高生物炭施用量并未顯著改變細菌的多樣性?？傮w而言，施用20t·hm-2生物炭可促進40a以下連作棉田的細菌群落和代謝途徑向有益于提高棉花生產(chǎn)力的方向發(fā)展。