付 麗， 張東向， 劉麗杰， 劉安奇， 呂 晴， 李 偉

(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院/抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

甘草(GlycurrihizauralensisFisch.)為多年生草本植物[1]，我國著名的大宗常用的中藥材和輕化工原料，具有緩解止疼、清熱解毒、抗癌、抗衰老等療效[2]，國內、國際市場需求量巨大，甘草的用量遠超過杜仲、金銀花、人參、紅花、元胡等中藥材，缺了甘草，中藥難以成方[3]。除制藥[4-5]行業(yè)應用外，還應用在食品[6-8]、飲料[9]、煙草、化工、釀造、國防工業(yè)等行業(yè)[10]。當前，大量使用和過度開發(fā)使得野生甘草資源面臨枯竭，甘草組織培養(yǎng)體系的建立，為保護甘草資源和進行新品種選育提供了新途徑。

響應面分析法(response surface methodology，RSM)[11]，具有使用方便、試驗周期短、回歸方程精度高等優(yōu)點[12]，利用多元二次回歸方程，將多因子指標相互關系用多項式近似擬合[13]，建立關于因素與影響值的函數(shù)關系，可精確研究各因素之間的交互作用[14]。本實驗利用植物組織培養(yǎng)技術，采用 Box-Behnken Design設計方法篩選誘導甘草愈傷組織的最適培養(yǎng)基，探究不同激素組合對甘草愈傷組織誘導的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗于2019年4月至2020年12月在齊齊哈爾大學生命科學與農林學院植物代謝生理研究室內進行。甘草種子購自黑龍江省甘草種植基地，經專家鑒定為甘草(GlycurrihizauralensisFisch.)的干燥成熟種子，保存于4 ℃冰箱中。

1.2 方 法

1.2.1甘草無菌苗的獲得

選取干燥且飽滿的甘草種子，經蒸餾水浸泡24 h，置于超凈工作臺上，用 0.1%升汞浸泡10 min，取出后用無菌水沖洗5～6次，每次30 s，再用無菌濾紙將種子表面的水吸干，接種到蔗糖為30 g·L-1的MS固體培養(yǎng)基上，封口后置于(25±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強度2 000 lx、光照條件12 h·d-1，待其生長至21 d時獲得甘草無菌苗。

1.2.2甘草愈傷組織的誘導

取上述無菌苗作為外植體，在超凈工作臺上用滅過菌的鑷子取出，置于事先經高壓滅菌干燥冷卻后的培養(yǎng)皿上，用滅過菌的解剖刀和鑷子將幼莖切成約1 cm長，葉片切成0.5 cm2大小，接種到經121 ℃高壓滅菌20 min后的不同激素處理的誘導培養(yǎng)基內，每瓶接種6個外植體，封口后放入恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，溫度為25 ℃，光照2 000 lx，每種處理重復6次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計愈傷組織形成情況，以“+”多少表示愈傷組織長勢。

愈傷組織誘導率(%)=(長出愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種的外植體塊數(shù))×100%。

1)單因子試驗

將上述幼莖、葉片接種到6-BA濃度(0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1)的MS誘導培養(yǎng)基上，研究不同6-BA濃度對甘草愈傷組織誘導的影響。

2)不同激素組合試驗

不同6-BA、NAA、2,4-D組合試驗設計見表1、表2。

表1 不同6-BA和NAA濃度組合試驗設計

表2 不同2,4-D和6-BA濃度組合試驗設計

3)響應面試驗設計

以2,4-D、6-BA和NAA為單因素，每個因素取3水平，以愈傷組織誘導率為響應值，采用 Design-Expert 12 統(tǒng)計分析軟件進行響應面設計實驗，按照Box-Behnken 試驗設計，對誘導愈傷組織的激素進行篩選，設計3因素3水平的響應面試驗(表3)。

表3 Box-Behnken設計3因素3水平

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Microsoft Excel 2010軟件和Design-Expert 12軟件進行數(shù)據計算和統(tǒng)計學分析。

2 實驗結果與分析

2.1 不同6-BA濃度對甘草愈傷組織形成的影響

將甘草外植體接種在不同6-BA濃度的MS培養(yǎng)基上誘導愈傷組織。由表4可知，處理3愈傷組織誘導效果最好，愈傷組織生長狀態(tài)良好，大部分呈淡黃色，且愈傷誘導率最高，為97.22%；處理2次之，愈傷誘導率為94.4%；處理1愈傷生長狀態(tài)相對較差，誘導率最低，為72.22%。據此認為，在單獨使用6-BA誘導甘草愈傷組織時，6-BA濃度為1.5 mg·L-1最有利于甘草愈傷組織的形成。

表4 不同6-BA濃度對甘草愈傷組織誘導的影響

2.2 不同6-BA和NAA濃度組合對愈傷組織形成的影響

將甘草外植體接種在不同6-BA和NAA濃度組合的MS培養(yǎng)基上誘導愈傷組織。由表5可知，處理3、4、5愈傷組織生長狀態(tài)良好，誘導率均高于80%，其中處理4愈傷組織誘導效果最好，愈傷呈褐色數(shù)量最少，且愈傷誘導率最高，為97.22%；處理5次之，誘導率與處理4達到同一水平，愈傷組織長勢良好，多數(shù)呈淡黃色；處理1、2愈傷生長狀態(tài)雖相對較差，但有不定根生長；處理1愈傷組織長勢最差，誘導率最低，為47.22%，且有許多褐色組織增生。據此認為，NAA 0.4 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1最有利于甘草愈傷組織的形成。

表5 不同6-BA和NAA濃度組合對甘草愈傷組織形成的影響

2.3 不同2,4-D和6-BA濃度組合對愈傷組織形成的影響

將甘草外植體接種在不同2,4-D和6-BA濃度組合的MS培養(yǎng)基上誘導愈傷組織。由表6可知，所有處理愈傷組織誘導率均在80%以上，其中處理2愈傷組織誘導率最高，為97.22%，愈傷組織誘導效果較好，多數(shù)愈傷呈淡黃色；處理3愈傷組織誘導率為94.44%，且愈傷組織長勢最好，并有不定芽生長，生芽率為6.89%；而處理5誘導率雖為80.56%，但愈傷生長狀態(tài)相對較差。據此認為，6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 1.5 mg·L-1最有利于甘草愈傷組織的形成。

表6 不同2,4-D和6-BA濃度組合對甘草愈傷組織形成的影響

2.4 響應面分析法試驗結果

不同激素組合對甘草外植體愈傷組織誘導的影響不同。根據Box-Behnken 試驗設計，結合表7和表8可知，各處理組愈傷組織誘導率均高于75%，但有一定的褐變現(xiàn)象發(fā)生，褐化率2.50%～17.02%，處理2誘導率最高，達100%，長勢有12.50%達“+++”，53.12%達“++”，褐化率為15.63%；其次處理1誘導率為97.23%，處理1愈傷組織長勢比處理2長勢較好，長勢有16.38%達“+++”，53.19%達“++”，但其褐化率為17.02%，高于處理2；處理5、7愈傷組織誘導率分別為78.06%、79.41%，長勢一般，無“+++”，且褐化率均高于8.5%；處理15愈傷組織誘導率最低，為75.29%，但愈傷長勢比處理5、7長勢好，且褐化率較低，為5.89%。

表7 不同激素組合對甘草愈傷組織誘導的影響

以2,4-D(A)、6-BA(B)、NAA(C)為影響因素，誘導率(Y)為響應值，利用 Design-Expert 12軟件對表8數(shù)據進行統(tǒng)計分析，其回歸方程的顯著性檢驗及方差分析見表9。回歸結果表明，一次項A、B、C，交互項BC以及二次項A 2、C 2對愈傷組織的誘導率的影響達極顯著水平(p<0.01)，AC對實驗結果的影響顯著(p<0.05)，各因素對甘草愈傷組織誘導率的影響程度大小依次為2,4-D>NAA>6-BA。對試驗數(shù)據進行二次多元擬合回歸，得到回歸預測模型為：Y=140.75+24.08 A-21.75 B-110.08 C+3.4 AB+9.18 AC+35.9 BC-10.28 A2-10.31 B2+28.32 C2。

表8 Box-Behnken 試驗設計及結果

由表9可知，模型的回歸F值為184.04，p<0.01，表明該回歸極顯著，模型對試驗實際情況擬合較好。失擬項不顯著(p>0.05)，相關系數(shù)r2=0.995 8，校正決定系數(shù)R=0.990 4，表明該模型與實際的試驗擬合程度良好，誤差小，模型選擇合適，可以用該模型對響應值進行分析和預測來確定最佳誘導甘草愈傷組織的培養(yǎng)基配方，各因素對甘草愈傷組織誘導影響大小依次為2,4-D>NAA>6-BA。

表9 回歸方程顯著性檢驗及方差分析

根據回歸方程，繪制不同激素組合與甘草愈傷組織誘導率的響應面分析圖(圖2)。通過 Design-Expert 12統(tǒng)計分析軟件優(yōu)化，獲得誘導愈傷組織的培養(yǎng)基為 MS+2,4-D 1.44 mg·L-1+6-BA 1.18 mg·L-1+NAA 1.44 mg·L-1，預測甘草愈傷組織誘導率為100%。

為檢測結果的可靠性，采用最佳誘導愈傷組織的培養(yǎng)基進行驗證，結果表明，甘草愈傷組織誘導率為100%，愈傷長勢良好，呈淡黃疏松狀態(tài)，驗證了預測結果的正確性，說明響應面分析法得到的激素質量濃度真實可靠。

3 結 論

愈傷組織誘導和分化是植物組織培養(yǎng)過程中的主要研究內容，利用植物外植體來誘導愈傷組織，首要任務是無菌苗的獲取，常用的消毒劑有升汞[15]、次氯酸鈉和75%乙醇。本實驗選用0.1%升汞作為甘草種子消毒劑，成功獲取甘草無菌苗。其次，調節(jié)植物生長調節(jié)劑的種類及配比是愈傷組織誘導的重要手段[16]，通常使用細胞分裂素和生長素組合。響應面分析法是近年來各領域學者常用的實驗設計和優(yōu)化方法[17-20]，張晶等[21]研究了響應面法優(yōu)化艾蒿水提物的提取工藝；楊麗萍等[22]研究了響應面法優(yōu)化紅提果醋的發(fā)酵條件；陳兵兵等[23]進行了甘草中總黃酮和總多糖聯(lián)合的提取工藝研究；而利用響應面法優(yōu)化甘草愈傷組織誘導的研究較少。因此，在本實驗中采用Box-Behnken方法設計響應面分析試驗，以2,4-D、6-BA和NAA為單因素，設計3因素3水平的響應面試驗得到多種激素組合，確定甘草愈傷組織的誘導培養(yǎng)基為 MS+2,4-D 1.44 mg·L-1+6-BA 1.18 mg·L-1+NAA 1.44 mg·L-1，并進行了驗證，其誘導率可達100%，說明響應面分析法得到的激素質量濃度真實可靠。