符真珠，王 銳，張?zhí)┤唬趸劬?，?杰，李艷敏，蔣 卉，王利民，袁 欣，李彥邦，張和臣

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，河南 鄭州 450002；2. 上海交通大學 農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240）

矮牽牛是一類應用非常廣泛的花鏡、花壇及家庭園藝植物。其花色非常豐富，具有白色、紅色、粉色、紫色、藍色、復色以及黃色等多種類型[1-4]。研究表明，決定矮牽?；ㄉ闹饕镔|(zhì)是花青苷，主要包含天竺葵、矢車菊和飛燕草等色苷類型，它們分別由F3H、F3’H、F3’5’H等基因控制[5-6]。藍色是一種稀有色，主要有飛燕草素控制，其花卉種類較少。F3’5’H是合成飛燕草素的主效基因，是細胞色素P450家族重要成員，該基因的轉(zhuǎn)化應用是獲得藍色花種質(zhì)的關(guān)鍵[7-9]。近幾年,隨著分子生物學的發(fā)展，月季、康乃馨、菊花等一些重要切花的藍色花種質(zhì)遺傳改良已經(jīng)獲得突破，一些轉(zhuǎn)基因品種在日本、澳大利亞等已經(jīng)得到了商業(yè)化推廣應用[10]。如在康乃馨中共表達矮牽牛細胞色素b5和F3’5’H基因，可以使轉(zhuǎn)基因后代株系的飛燕草素苷含量明顯增加[6]。在切花月季中導入三色堇F3’5’H和鳶尾DFR基因，并同時抑制其內(nèi)源DFR基因的表達，成功創(chuàng)建了呈現(xiàn)藍色花瓣的月季種質(zhì)[5]。抑制菊花內(nèi)源F3’H，并導入三色堇F3’5’H基因，也成功獲得了藍色花轉(zhuǎn)基因株系[11]。矮牽牛中花青素苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)被解析，在Petunia inflata、P.axillaris基因組中F3’5’H基因由2 個基因座編碼，分別是HF1和HF2[12]。本研究對矮牽牛不同基因型的F3’5’H進行了鑒定和功能分析，以期為后續(xù)花色分子育種奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

矮牽牛材料P. inflata、P. axillaris、P. exserta以及P.hybridaM1（簡寫為M1，下同）、P.hybridaV30（V30）、P.hybridaR27（R27）等均由荷蘭Ronald Koes教授實驗室贈送，為了便于遺傳轉(zhuǎn)化和性狀分析，對一些矮牽牛進行了雜交，分別為M1×R27（粉色）、M1×V30（紫色）、P.axillaris×R27（紫色）及自交后代F2（白色、粉色、紅色或粉紫色）。矮牽牛植株在光照強度8 000～10 000 lx、光周期16 h 光照/8 h 黑暗、溫度25～30 ℃、相對濕度50%左右的條件下培養(yǎng)。

1.2 F3’5’H基因鑒定及克隆

矮牽牛F3’5’H基因序列在基因組網(wǎng)站中（https://solgenomics.net/tools/blast/）通過Blast分析獲得，并將獲得的DNA 序列進行內(nèi)含子/外顯子分析。各個品種（種）或轉(zhuǎn)基因后代的矮牽牛DNA 提取采用2×CTAB 方法；RNA 提取采用Trizol 試劑盒并通過NanoDrop 2000 進行質(zhì)量檢測，反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 進行。F3’5’H基 因 克 隆 采 用 高 保 真Taq酶 試 劑 盒PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]，所用引物（5′—3′，下同）如下，HF1-Fw：ATGCTACTTACTGAACTTGCTGC，HF1-Rv：CTATGGTACATAAACATCAAATTG，HF2-Fw：ATGGTGCTACTTAGTGAGCTTG，HF2-Rv：CAAGCTAAAGGTGCATAAACATC。不同矮牽牛HF1和HF2位點編碼基因的基因型分型所用引物為，HF1（F3’5’H1）-Fw：GCTTGGATGGATTTACAAGGGATAG，HF1（F3’5’H1）-Rv：CATAGCTTCAAGAGGGACAGC；HF2（F3’5’H2）-Fw：CTATAACTAACGGCCGGCGTC，HF2（F3’5’H2）-Rv：CTCTCCCCTTCTCTGCTCATATC。

1.3 F3’5’H基因序列比對及進化分析

進化樹分析通過MEGA 6.0 軟件進行，將獲得的F3’5’H基因所編碼的氨基酸序列進行比對，并通過Construct/Test maximum Likelihood Tree 程序建立進化樹。所用其他植物的F3’5’H基因編碼氨基酸序列根據(jù)GenBank 序列號在NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得。氨基酸序列比對采用DNAMAN軟件進行。

1.4 F3’5’H及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄分析

以P. axillaris×R27 自交F2代的花瓣為材料，對F3’5’H及其上游調(diào)控基因AN2、PHZ、DPL、AN4（R2R3-MYB家族成員）的表達進行分析。所用相關(guān)引物如下，F(xiàn)3’5’H-Fw：GCTTGGATGGATTTACAAGGG，F(xiàn)3’5’H-Rv：TGGTTCGTTCGAGATCCTAGG（F3’5’H1和F3’5’H2通 用 引 物）；AN2-Fw：GAGGGGACTTCTCTTTGGATG，AN2-Rv：CGATGGTGCTGTTTCCTCATGCAA；PHZ-Fw：GGGACTTCTCTGAGGATGAAGTA，PHZ-Rv：ATCATTTTCGTTGCAGTTAGCTAG；DPL-Fw：GACTTTTGTCCGGAGGAAGTGGAC，DPL-Rv：GCATTCTTGGCCATGGTCCTAATTTC；AN4-Fw：GACTTCTCTCCAGATGAAGTGG,AN4-Rv：TTGAGAGGTTCCGAGGTTGAGG；actin-Fw：CTACGAGGGTTATGCTTTGCC，actin-Rv：GCTGGAATGTGCTAAGGGATG。

1.5 矮牽牛F3’5’H基因超表達載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

將克隆得到的矮牽牛F3’5’H基因采用gateway載體系統(tǒng)首先通過BP反應構(gòu)建至pDNOR207載體，然后通過LR反應構(gòu)建至超表達載體pK2GW7，并轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌Agl1。載體構(gòu)建所用引物序列如下，F(xiàn)3’5’H1-Fw：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGCTACTTACTGAACTTGCTGC，F(xiàn)3’5’H1-Rv：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTATGGTACATAAACATCAAATTG，F(xiàn)3’5’H2-Fw：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGTGCTACTTAGTGAGCTTG，F(xiàn)3’5’H2-Rv：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAAGCTAAAGGTGCATAAACATC。

矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化所用品種類型為M1×R27，采用葉盤轉(zhuǎn)化法。首先將培養(yǎng)好的矮牽牛葉片在70%乙醇中消毒5 s，然后在0.5%次氯酸鈉中消毒10～12 min，再用無菌水沖洗5 遍。將沖洗后的矮牽牛葉片切割成10 mm 左右的方塊，在農(nóng)桿菌中浸染10 min。浸染后的葉片在共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS+20 g/L蔗 糖+10 g/L 葡 萄 糖+0.1 mg/L 萘 乙 酸+1.0 mg/L 玉 米素+2.0 mg/L 6-芐基腺嘌呤+8 g/L 瓊脂粉，pH 值5.7）中培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基（共培養(yǎng)培養(yǎng)基+100 mg/L 卡那霉素+250 mg/L 頭孢噻肟鈉）中培養(yǎng)40～60 d，獲得矮牽牛轉(zhuǎn)化植株。將轉(zhuǎn)化植株進一步轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基（MS+20 g/L 蔗糖+10 g/L 葡萄糖+8 g/L 瓊脂粉+100 mg/L 卡那霉素+250 mg/L 頭孢，pH 值5.7）中培養(yǎng)30 d。將生根后的矮牽牛植株移栽到基質(zhì)中培養(yǎng)至開花，進行表型和基因型分析。

1.6 矮牽?；ò晟睾繙y定

矮牽?；ò曛谢ㄇ嗨睾繙y定采用高效液相色譜法（HPLC）。分別采集對照矮牽牛M1×R27、M1×V30 及每個F3’5’H轉(zhuǎn)基因后代中10 個矮牽?；ò辏ㄍ耆归_期）進行凍存?zhèn)溆?，測定試驗在蘇州科銘生物技術(shù)有限公司進行。測定的花青素類型包括飛燕草素、矢車菊素、二氫槲皮素和二氫楊梅素。

2 結(jié)果與分析

2.1 矮牽牛F3’5’H基因型分析

通過Blast對矮牽?；蚪M中F3’5’H基因分析表明，P.inflata共有HF1和HF2兩個位點，其中HF1位點有1 個編碼基因，命名為F3’5’H1inf，HF2位點有2個基因連鎖在一起，分別命名為F3’5’H2-1inf和F3’5’H2-2inf。P. axillaris基因組也有HF1和HF2兩個位點，但是HF2位點只包含1 個F3’5’H2axi基因。在編碼區(qū)內(nèi)這些F3’5’H基因都含有2 個內(nèi)含子，其中第1 個內(nèi)含子的插入位置相同，但是F3’5’H1axi（F3’5’H1-i）第2 個內(nèi)含子序列比F3’5’H1inf（F3’5’H1-ii）長813 bp。同時，對矮牽牛P. exserta以及R27、V30（不同矮牽牛品種花瓣呈色表型見圖1A）中的F3’5’H基因進行了克隆分析。結(jié)果表明，F(xiàn)3’5’H1R27編碼區(qū)的DNA序列長達5 099 bp，在第3個外顯子區(qū)域有1 個dTPH9轉(zhuǎn)座子的插入（F3’5’H1-iii），而F3’5’H1V30可以正 常 編碼。F3’5’H2與F3’5’H1基因結(jié)構(gòu)和序列長度類似，都有2 個內(nèi)含子插入，而且第1 個內(nèi)含子的插入位置相同（圖1B）。對基因型分析表明，在P.axillaris、P.exserta、R27 等矮牽牛中都含有1 個F3’5’H2成員，而在P.inflata中含有2 個成員，并且緊密連鎖在一起。已有報道表明，F(xiàn)3’5’H1R27類型的基因在一些矮牽牛園藝品種中被檢測到，說明存在該類型基因的矮牽牛種質(zhì)參與了現(xiàn)代園藝品種的創(chuàng)制[13]。因此，根據(jù)F3’5’H基因內(nèi)含子序列的長度差異設計引物，在不同矮牽牛中進行PCR 擴增，通過凝膠電泳可以定向檢測F3’5’H在不同矮牽牛中的基因型（圖1C）。F3’5’H基因型差異可為后續(xù)進行矮牽?；ㄉ肿釉O計育種提供重要遺傳依據(jù)。

2.2 矮牽牛F3’5’H序列及進化特性分析

對鑒定和克隆得到的F3’5’H基因所編碼的氨基酸序列建立進化樹，結(jié)果表明，矮牽牛的HF1位點與HF2位點所在的F3’5’H基因分布在一個分支單元，屬于典型的CYP75A 基因家族類型，而F3’H屬于CYP75B 型[14]。但是F3’5’H1和F3’5’H2基因在聚類上出現(xiàn)了明顯的分離，它們各自聚類在一起（圖2A），說明它們在矮牽牛物種分化之前就已經(jīng)產(chǎn)生。對其編碼的氨基酸序列比對分析表明，F(xiàn)3’5’H1inf、F3’5’H1axi以及F3’5’H2編碼氨基酸數(shù)目相同，它們之間的序列相似性高達97.0%以上。F3’5’H1R27基因編碼的氨基酸由于dTPH9轉(zhuǎn)座子的作用，使正常編碼的轉(zhuǎn)錄本多出了2 個氨基酸（圖2B）。

2.3 F3’5’H基因的表達特性及對花瓣的呈色作用

為了檢測矮牽牛F3’5’H基因?qū)ò瓿噬淖饔茫瑢Π珷颗. axillaris和R27 雜交獲得的F2進行表型和基因型分析。由圖3 可知，F(xiàn)2的花瓣呈色表型主要有4類，分別是白色花瓣黃色雄蕊、粉紫色花瓣紫色雄蕊、粉紫色花瓣黃色雄蕊以及紅色花瓣黃色雄蕊（圖3A 的L1、L3、L6、16）；占比較多的為粉紫色花瓣紫色雄蕊和粉紫色花瓣黃色雄蕊類型，這2種類型的后代中都含有能正常編碼的F3’5’H1axi基因，說明該基因在紫色花瓣的形成中起著重要作用。對F2中（L1—L20）的F3’5’H1基因型進行分析（圖3B），20株后代中，F(xiàn)3’5’H1R27基因型有16個（純合型2 個），F(xiàn)3’5’H1axi基因型有13 個（純合型3個）。對L2 和L17 兩種類型后代中相關(guān)基因表達特性的分析結(jié)果表明，F(xiàn)3’5’H基因的表達，在花冠和花管中都是隨著花瓣的發(fā)育（S2—S7，即花瓣露出花萼期至花瓣完全展開期）逐漸增強，而在雄蕊中的表達逐漸減弱（圖3C）。F3’5’H基因在雌蕊中盡管也有表達，但是并沒有呈現(xiàn)花青苷積累的表型。前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)3’5’H1基因主要受AN2 和ASRs 等轉(zhuǎn)錄因子的特異性調(diào)控，而F3’5’H2主要受AN4 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[15]。說明F3’5’H對花瓣的呈色作用跟基因型關(guān)聯(lián)密切，并受制于不同R2R3-MYB 基因成員的表達特性。

2.4 F3’5’H轉(zhuǎn)基因功能分析

在矮牽牛M1×R27中，對F3’5’H基因的轉(zhuǎn)錄本測序表明，F(xiàn)3’5’H1R27具有可變剪切現(xiàn)象，其中1 條轉(zhuǎn)錄本可以正常編碼，而另1 條轉(zhuǎn)錄本不能正常編碼。因此，該品種的花瓣中積累以矢車菊素苷為主的花青苷類型，導致花瓣呈現(xiàn)粉色。為了驗證不同F(xiàn)3’5’H基因型的分子功能，在矮牽牛M1×R27 中進行遺傳轉(zhuǎn)化（超表達）分析。結(jié)果表明，OE（Over expression）-F3’5’H1inf、OE-F3’5’H1axi、OEF3’5’H2-1inf以及OE-F3’5’H2-2inf都可以使轉(zhuǎn)基因矮牽牛后代中的花瓣呈現(xiàn)明顯的紫色變化趨勢（圖4A）。與對照M1×R27 相比，轉(zhuǎn)基因后代的花瓣顏色明顯加深，接近于M1×V30 的呈色表型；但是，OE-F3’5’H1R27卻沒有表現(xiàn)出明顯的呈色變化，說明該基因編碼的氨基酸不能促使底物向飛燕草素方向有效轉(zhuǎn)化。

對矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株和對照M1×R27花瓣花青素成分的HPLC 分析表明（圖4B），M1×R27 對照只有4.03 mg/kg 的飛燕草素，說明該品種中的F3’5’H編碼蛋白具有一定的活性，但是較弱，進一步驗證了F3’5’H1R27的可變剪切事件。轉(zhuǎn)基因矮牽?；ò曛械纳睾?，除了OE-F3’5’H1R27之外，其他轉(zhuǎn)基因植株中的飛燕草素含量明顯增加（57.56～70.23 mg/kg），F(xiàn)3’5’H的直接反應產(chǎn)物二氫楊梅素也明顯增加（129.58～152.64 mg/kg）；其競爭產(chǎn)物二氫槲皮素（13.52～20.00 mg/kg）和矢車菊素含量（9.01～21.22 mg/kg）卻明顯減少。說明F3’5’H基因?qū)ㄇ嗨睾铣煞较虻母淖兤鸬搅酥匾饔?，使花瓣呈色由粉色向紫色發(fā)生改變。

3 結(jié)論與討論

花青苷成分與含量是決定花瓣呈色的化學基礎[16-17]。其中飛燕草素類型是紫色和藍色花瓣的主要色素類型?？刂骑w燕草素合成的一個主效基因是F3’5’H，其分子功能的有無和強弱直接決定花瓣中飛燕草素的含量[9，18-19]。矮牽牛是研究花瓣呈色的一種重要模式植物[1]，對其F3’5’H基因功能進行細化和系統(tǒng)研究可以揭示紫色、藍色及粉色花瓣呈色的分子基礎。本研究表明，在矮牽牛中存在HF1 和HF2 兩個位點，分別編碼不同的F3’5’H基因。說明該基因在矮牽牛的物種進化過程中非常活躍。本試驗通過研究矮牽牛不同F(xiàn)3’5’H基因型、表達特性、轉(zhuǎn)基因表型等，揭示了F3’5’H基因與矮牽?；ò瓿噬g的關(guān)系，即粉色花瓣的呈色主要源于該基因的突變，不能正常編碼行使酶功能；正常編碼的F3’5’H基因可以促使合成飛燕草素，使花瓣呈現(xiàn)紫色。因此，F(xiàn)3’5’H基因能否正常編碼是矮牽?；ò瓿噬町惢闹匾肿踊A之一。該基因的轉(zhuǎn)錄直接受AN2、ASRs、DPL 等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，不同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控不同的F3’5’H基因型，F(xiàn)3’5’H1基因主要與花瓣中花冠的呈色直接相關(guān)，而F3’5’H2基因主要與雄蕊、雌蕊、花管等呈色相關(guān)[7]。F3’5’H基因型差異可以作為今后矮牽牛分子設計育種的一個關(guān)鍵位點，通過父母本基因型的標記檢測，一定程度上可預測雜交后代的花色性狀分離特性。

在花青苷合成基因中，F(xiàn)3H、F3’H和F3’5’H是決定花青苷合成類型的3 個關(guān)鍵基因，它們分別控制天竺葵素、矢車菊素和飛燕草素。其中F3’H和F3’5’H是細胞色素P450家族成員，不同植物中，它們的成員數(shù)量、進化特性、表達方式具有很大差異，這些分子特性都是控制下游花青苷差異化的基礎[20]。在矮牽牛中，3 個類型的基因都存在，但是AN2、ASRs、AN4等基因主要控制F3H和F3’5’H的表達，而F3’H基因的表達特性并不受R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的影響[21-22]。這些結(jié)果表明，一方面，矮牽?；ò曛谢ㄇ嘬疹愋偷姆e累主要受F3’5’H基因的影響（基因型和表達特性），另一方面，雖然F3H基因的表達也同步受到調(diào)控，但是矮牽牛中的DFR（二氫山奈酚4-還原酶）活性可能對二氫楊梅素具有偏好性，更能促使飛燕草素類的合成[23]。本研究揭示了矮牽?；ò瓿噬囊环N重要分子機制，也為今后研究其他植物的花瓣呈色機制提供了重要線索。