芪苓益腎顆粒高效液相色譜指紋圖譜物質(zhì)基準(zhǔn)研究及7種成分含量測定

王隆隆，楊忠杰，張海風(fēng)，陳恒文，杜躍亮，吳作敏，王韻旨，寧萌，于曉濤*（.漯河市中心醫(yī)院，河南 漯河 46300；. 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 00000）

芪苓益腎顆粒由黃芪、當(dāng)歸、茯苓、枸杞子4 味藥材組成，是根據(jù)經(jīng)典名方《當(dāng)歸補(bǔ)血湯》結(jié)合本院長期臨床應(yīng)用加減形成的有效臨床驗(yàn)方，進(jìn)而研制而成的新制劑，具有益氣養(yǎng)血、健脾益腎等功效，臨床用于氣血兩虧、脾腎不足所知的頭暈?zāi)垦！⒚嫔S、食少納差、氣短無力、病后體虛。對腫瘤化療后白細(xì)胞減少、慢性腎功能不全、蛋白尿等療效顯著。

目前中藥新藥研發(fā)較為困難，其難點(diǎn)就在于不同產(chǎn)地、批次的中藥飲片對復(fù)方中物質(zhì)基準(zhǔn)的影響不易控制[1-4]。而中藥復(fù)方指紋圖譜注重完整性，中藥化學(xué)模式識別強(qiáng)調(diào)差異性，兩者結(jié)合即保證了中藥數(shù)據(jù)的完整性又能揭示不同批次間的差異[5-7]，可為中藥質(zhì)量的控制提供標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究應(yīng)用HPLC 法建立15 批芪苓益腎顆粒的指紋圖譜，通過指紋圖譜相似度評價(jià)，并結(jié)合聚類分析（CA）、主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）法，綜合比較不同批次間的差異并查找產(chǎn)生差異的因素，同時(shí)對毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、藁本內(nèi)酯7 種成分進(jìn)行含量測定，為芪苓益腎顆粒的開發(fā)和質(zhì)量控制提供參考，進(jìn)一步為制劑工藝及藥效研究提供依據(jù)[8-11]。

1 材料

高效液相色譜儀（日本島津LC-20AD 型，包括二元泵，全波長紫外檢測器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，工作站）；DHG-9070 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SB25-12D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；FW-80 型微型高速萬能試樣粉碎機(jī)（天津市工興電器廠）；AUW-120D 型十萬分之一電子天平（日本SHIMADZU 公司）；Milli-Q 超純水機(jī)（美國Millipore 公司）；5810R 高速離心機(jī)（美國Eppendorf 公司）。

對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：111920-201606，純度：97.6%）、阿魏酸（批號：110773-201614，純度：99.0%）（中國食品藥品檢定研究院）；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（批號：DSTDY000901，純度：99.45%）、芒柄花苷（批號：DSTDC004401，純度：98.99%）、毛蕊異黃酮（批號：DST-18120901，純度：99.84%）、芒柄花素（批號：DST-19033005，純度：99.03%）、藁本內(nèi)酯（批號：DST190315-007，純度：98.52%）（成都德思特生物科技有限公司）；乙腈、甲醇均為色譜純（美國Fisher 公司）；磷酸為色譜純（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙醇為分析純；水為飲用水或超純水。

制備15 批芪苓益腎顆粒所用的中藥飲片均來自道地藥材主產(chǎn)區(qū)或栽培品主產(chǎn)區(qū)，具體信息見表1。經(jīng)鄭州大學(xué)藥學(xué)院賈陸教授鑒定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus mongholicusBunge）的干燥根；當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸（Angelica sinensis）的干燥根，茯苓為多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]的干燥菌核，枸杞子為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果實(shí)，均符合2020年版《中國藥典》一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。

表1 15 批芪苓益腎顆粒藥材產(chǎn)地信息Tab 1 Origin of 15 batches of Qiling Yishen granules

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[11-12]

采用GL Sciences ODS-3（5 μm，4.6 mm×250 mm，UP）色譜柱，以（0.05%磷酸-水）（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0 ～10 min，11%B；10 ～40 min，11% ～27%B；40 ～50 min，27%B；50 ～65 min，27% ～40%B；65 ～75 min，80%B；75 ～80 min，80%B；80 ～81 min，80% ～11%B；81 ～100 min，11%B）；柱溫35℃；進(jìn)樣量10 μL；流速1 mL·min－1，檢測波長254 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、藁本內(nèi)酯對照品適量，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為1.86、1.92、1.75、2.14、2.02、1.96、1.42 mg·mL－1的對照品儲(chǔ)備液；精密量取上述各儲(chǔ)備液適量，混勻，制得各成分質(zhì)量濃度為181.18、20.04、17.10、24.60、44.82、29.24、50.42 μg·mL－1的混合對照品溶液（純度均已折算），密封保存。

2.2.2 供試品溶液 依據(jù)芪苓益腎顆粒處方稱取飲片，按工藝方法制備S1 ～S15 共15 批芪苓益腎顆粒，為干燥細(xì)粉。取樣品5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加50%甲醇30 mL，超聲0.5 h，用50%甲醇補(bǔ)足失重，13 000 r·min－1離心3 min，取上清液為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 分別制備缺黃芪、當(dāng)歸、茯苓、枸杞子的陰性樣品細(xì)粉，參照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取芪苓益腎顆粒供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對保留時(shí)間的RSD均≤1.0%，各色譜峰相對峰面積的RSD均≤1.6%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取芪苓益腎顆粒樣品（樣品S11），平行制備供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對保留時(shí)間的RSD均≤0.9%，各色譜峰相對峰面積的RSD均≤1.1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取芪苓益腎顆粒供試品（樣品S11）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、6、9、24、48 h 測定，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對保留時(shí)間的RSD均≤1.0%，各色譜峰相對峰面積的RSD均≤2.0%，表明供試品在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 芪苓益腎顆粒HPLC 指紋圖譜研究

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備15 批芪苓益腎顆粒供試品溶液（S1 ～S15），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄各色譜圖。

2.4.1 參照峰的選定 在15 批芪苓益腎顆粒供試品溶液色譜圖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷保留時(shí)間適中、峰面積大且穩(wěn)定、分離度高，故以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰[13]。

2.4.2 相對保留時(shí)間和相對峰面積 計(jì)算15 批芪苓益腎顆粒指紋圖譜中各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，各共有峰保留時(shí)間的RSD均小于0.22%，表明15 批樣品共有峰的出峰時(shí)間相對穩(wěn)定；各共有峰峰面積RSD相差較大，說明芪苓益腎顆粒各成分批次間存在差異。

2.4.3 芪苓益腎顆粒HPLC 指紋圖譜相似度評價(jià)

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）”對15 批芪苓益腎顆粒供試品色譜圖進(jìn)行分析。以S11 為參照圖譜（采用中位數(shù)法、時(shí)間寬度為0.1 min），進(jìn)行多點(diǎn)校正和峰匹配，15 批芪苓益腎顆粒HPLC 色譜圖及對照圖譜疊加圖，見圖1。共標(biāo)定了22 個(gè)共有峰，以對照圖譜為參照進(jìn)行相似度計(jì)算，15 批供試品的相似度均大于0.93，分別為0.975、0.939、0.938、0.939、0.984、0.986、0.972、0.99、0.983、0.988、0.985、0.986、0.987、0.982、0.981。表明所建立的芪苓益腎顆粒指紋圖譜質(zhì)量穩(wěn)定，可以反映其指紋特征。

圖1 15 批芪苓益腎顆粒HPLC 指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）Fig 1 HPLC fingerprint and control fingerprint （R）of 15 batches of Qiling Yishen granules

2.4.4 芪苓益腎顆粒共有峰化學(xué)成分指認(rèn)及歸屬 取芪苓益腎顆粒供試品溶液、陰性樣品溶液、混合對照品液進(jìn)樣分析，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果見圖2。經(jīng)與化學(xué)對照品色譜（S6）、當(dāng)歸陰性色譜（S1）、茯苓陰性色譜（S2）、枸杞子陰性色譜（S3）、黃芪陰性色譜（S4）及供試品色譜（S5）比較共指認(rèn)了18 個(gè)色譜峰，分別為峰6、峰11（阿魏酸）、峰13、峰16（洋川芎內(nèi)酯Ⅰ）及峰21（藁本內(nèi)酯）歸屬于當(dāng)歸，峰1、峰3、峰9 及峰12 歸屬于茯苓，峰5 歸屬于枸杞子，峰2、峰10（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、峰14 ～15、峰17（芒柄花苷）、峰18（毛蕊異黃酮）、峰19、峰20（芒柄花素）歸屬于黃芪。

圖2 芪苓益腎顆粒共有峰化學(xué)成分指認(rèn)及歸屬HPLC 圖Fig 2 HPLC of chemical composition identification and attribution of common peaks of Qiling Yishen granules

2.4.5 聚類分析（CA） 采用z-score 標(biāo)準(zhǔn)化法將15 批芪苓益腎顆粒供試品22 個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，將處理后數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 21 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行聚類分析[16-17]，測量區(qū)間為平方歐氏距離，聚類結(jié)果見圖3。當(dāng)平方歐式距離為9時(shí)，可將15 批芪苓益腎顆粒樣品分為兩類，其中S1、S2、S3、S4、S5、S6 聚合為一類，其余樣品聚為一類。聚類結(jié)果表明，不同批次樣品存在差異，與藥材的不同產(chǎn)地來源具有一定相關(guān)性，例如，聚合為一類的S1 ～S5 中的黃芪產(chǎn)地均來自山西，聚合為一類的S9、S13、S14 中當(dāng)歸的產(chǎn)地均來自甘肅渭源，聚合為一類的S7、S11、S12 中的枸杞子產(chǎn)地均來自寧夏，藥材來源產(chǎn)地不同對樣品質(zhì)量差異的控制產(chǎn)生一定影響。

圖3 15 批芪苓益腎顆粒聚類分析圖Fig 3 Cluster analysis of 15 batches of Qiling Yishen granules

2.4.6 主成分分析（PCA） 采用SPSS 21 和SIMCA 14.1 軟件對15 批樣品共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化和處理，進(jìn)行主成分分析[18]。以特征值＞1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，共提取出5 個(gè)主成分，分別是峰10（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、峰17（芒柄花苷）、峰18（毛蕊異黃酮）、峰1、峰20（芒柄花素），得到主成分的累積方差貢獻(xiàn)率92.6%，能概括樣品數(shù)據(jù)的絕大部分信息，故選取5 個(gè)主成分進(jìn)行評價(jià)，在5 個(gè)主成分中特征值較大的是主成分1，其累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)74.285%。同時(shí)，圖4 主成分分析結(jié)果可知PCA 將15 批芪苓益腎顆粒分為兩類，S1 ～S6 聚合為一類，S7 ～S15 聚合為一類，與聚類分析結(jié)果一致。

圖4 主成分分析得分圖Fig 4 Principal component analysis score

2.4.7 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）

采用SIMCA 14.1 軟件，將15 批芪苓益腎顆粒樣品的22 個(gè)共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)以監(jiān)督模式化學(xué)識別方法OPLS-DA 進(jìn)行建模分析，得分矩陣圖、載荷散點(diǎn)圖和變量重要投影值圖[15，19]，見圖5。結(jié)果顯示，在置信區(qū)間（95%）內(nèi)，15 批樣品存在一定差異性。根據(jù)分布可將15 批樣品分為兩類，樣品S1 ～S6 為一類，S7 ～S15 為一類。OPLS-DA 載荷散點(diǎn)圖，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)共有峰自變量，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，對樣品的區(qū)分越強(qiáng)。結(jié)合VIP 圖可以為進(jìn)一步確定對上述樣品分類貢獻(xiàn)較大的成分，以VIP 值＞1.0 為有意義變量，共提取出5 個(gè)特征峰，依次為峰10（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、峰17（芒柄花苷）、峰18（毛蕊異黃酮）、峰1、峰20（芒柄花素），說明這5 種成分可能是15 批芪苓益腎顆粒物質(zhì)基準(zhǔn)分類的差異性標(biāo)志物。

圖5 15 批芪苓益腎顆粒OPLS-DA 分析結(jié)果Fig 5 OPLS-DA analysis of 15 batches of Qiling Yishen granules

2.5 7 種指標(biāo)成分含量測定

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液和供試品溶液（S11）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，在毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、藁本內(nèi)酯對照品相應(yīng)位置上，供試品溶液均有相對應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，且色譜峰分離度與峰形均較好，結(jié)果見圖2。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合對照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見表2。

表2 各化學(xué)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab 2 Regression equation，correlation coefficient and linearity

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果7 種成分峰面積的RSD均在0.21%～0.72%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液（S11）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果7 種成分峰面積RSD均在0.52%～1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（S11）適量，室溫下存放 0、6、12、24、48 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果7 種成分峰面積的RSD均在0.98%～2.2%，表明供試品溶液48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的樣品（S11）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液9 份。精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對照品儲(chǔ)備液適量，配制與樣品含量相同的混合對照品溶液，在上述供試品溶液中精密加入相當(dāng)于樣品體積50%、100%、150%的混合對照品溶液各3 份，混合均勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、藁本內(nèi)酯低、中、高濃度平均回收率均在97.99% ～102.33%，RSD均＜2.0%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.7 樣品含量測定 取15 批芪苓益腎顆粒供試品液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果見表3。15 批芪苓益腎顆粒樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、藁本內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為1.09 ～1.68、0.27 ～0.63、0.06 ～0.45、0.51～0.99、0.31～0.68、0.29～0.59、0.25～0.96 mg·g－1，結(jié)果表明批次間成分含量存在一定差異，例如黃芪產(chǎn)地為甘肅的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量較高；當(dāng)歸產(chǎn)地為湖北的洋川芎內(nèi)酯Ⅰ含量較低。其中15 批樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最為突出，最高達(dá)到1.68 mg·g－1。

表3 芪苓益腎顆粒中7 種成分的含量Tab 3 7 components in the Qiling Yishen granules

3 討論

3.1 提取方法的考察

制備完成15 批芪苓益腎顆粒樣品細(xì)粉后，本試驗(yàn)分別考察了水、甲醇、80%甲醇及50%甲醇作溶劑制備供試品溶液，根據(jù)色譜峰的數(shù)量、峰形及化學(xué)成分溶出全面性等綜合考慮，本文選擇以50%甲醇為溶劑制備供試品溶液。

3.2 色譜方法考察

本研究前期考察了不同高效液相色譜儀（安捷倫1260 型、島津LC-20AD）；不同廠家（Agilengt、YMC、Phenomenex、GL Sciences）色譜柱；不同流動(dòng)相[甲醇-水、乙腈-水、乙腈-（0.1%磷酸-水）、乙腈-（0.05%磷酸-水）]；不同流速（0.8、1 mL·min－1）；不同柱溫（30、35 ℃）；不同檢測方式（分段波長法、波長全掃法）及不同檢測波長（230、254、260、315 nm 等）等對色譜圖的影響，最終確定以島津LC-20AD高效液相色譜儀、GL Sciences ODS-3（5 μm，4.6 mm×250 mm，UP）色譜柱、（0.05%磷酸-水）（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相梯度洗脫、柱溫35℃、流速1 mL·min－1，檢測波長254 nm 為色譜方法。

3.3 含量測定指標(biāo)成分選定

本研究經(jīng)對照品與供試品及各陰性樣品色譜圖對照，共確認(rèn)了18 個(gè)色譜峰的歸屬，其中7 種已知成分分別為黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素和當(dāng)歸中的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、藁本內(nèi)酯。在OPLS-DA試驗(yàn)中，以VIP 值＞1 為特征，選取5 個(gè)特征性成分，本試驗(yàn)選擇差異較大且已知的4 種成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素同時(shí)進(jìn)行含量測定。因上述4 種成分均歸屬于黃芪飲片，且依據(jù)本處方組方原理，結(jié)合文獻(xiàn)資料當(dāng)歸中藥理活性成分的綜合研究[20-22]，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸中阿魏酸有抗血栓、抗炎、降血脂等作用，發(fā)揮活血祛瘀功效[23]；藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ有抗炎、鎮(zhèn)痛及舒張血管等作用，可改善微循環(huán)，提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，發(fā)揮“益氣補(bǔ)血”功效[24-25]；三者藥理作用與本方益氣養(yǎng)血，健脾益腎功效相關(guān)性聯(lián)系較緊密，本研究增加VIP 值靠前且已知的峰11（阿魏酸）、峰15（洋川芎內(nèi)酯Ⅰ）、峰21（藁本內(nèi)酯）的含量測定，以期為芪苓益腎顆粒物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

3.4 結(jié)果分析

由于飲片的來源、產(chǎn)地不同，15 批芪苓益腎顆粒物質(zhì)基準(zhǔn)的含量存在一定差異，樣品圖譜中22 個(gè)共有峰的相似度均高于0.93。通過指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別法，發(fā)現(xiàn)15 批芪苓益腎顆粒物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量存在顯著差異，進(jìn)一步利用CA、PCA 及OPLC-DA 法篩選出了對15 批樣品差異產(chǎn)生貢獻(xiàn)較大的5 個(gè)特征峰，分別是峰10（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、峰17（芒柄花苷）、峰18（毛蕊異黃酮）、峰1 及峰20（芒柄花素）。

本研究建立了同時(shí)測定7 種有效成分的定量分析方法，包括4 種物質(zhì)基準(zhǔn)成分（毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素），對制訂芪苓益腎顆粒物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，全面控制該制劑物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量具有指導(dǎo)意義。