張 威，魏旭言，高艷玲，范國(guó)權(quán)，邱彩玲，孫旭紅，武新娟，張俐俐，白艷菊*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086；2.昭通學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昭通 657000）

病毒病一直以來都是危害馬鈴薯生產(chǎn)，導(dǎo)致塊莖減產(chǎn)并影響品質(zhì)的主要因素。目前，侵染馬鈴薯的病毒約有50 余種[1,2]，其中馬鈴薯A 病毒（Potato virus A，PVA）是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）成員[3]，也是常見的侵染馬鈴薯主要病毒之一。一般情況下，PVA 單獨(dú)侵染馬鈴薯嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)可達(dá)40%左右[4]，而當(dāng)PVA 與其他病毒復(fù)合侵染，可導(dǎo)致更嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[5-7]。所以PVA 的危害性已經(jīng)受到世界各國(guó)的重視，多個(gè)國(guó)家將其列為檢疫性有害生物，中國(guó)2007 年也將PVA 列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》[8]。國(guó)內(nèi)馬鈴薯PVA 的相關(guān)研究多集中在病毒檢測(cè)和分離鑒定方法上，且已初步取得成果[9-11]，但對(duì)于PVA 不同分離物在馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育過程中引起的致病性研究較少。PVA 不同分離物因其核酸或所編碼蛋白的差別，在馬鈴薯上引起的致病癥狀有所不同。明確PVA 分離物的致病力表現(xiàn)，從傳統(tǒng)生物學(xué)癥狀著手，結(jié)合分子生物學(xué)方法，深入研究其致病性，可為PVA 病毒的鑒定與防治提供理論依據(jù)。

早在1990 年，Jones[12]對(duì)PVA 侵染馬鈴薯后引起癥狀與品種的關(guān)系就有報(bào)道，將PVA 接種到12 個(gè)馬鈴薯品種上，各品種敏感度不同，出現(xiàn)不被侵染、無癥狀感染、輕癥狀和重癥狀表現(xiàn)，而不同株系的PVA 在同一品種上的致病癥狀也有差異。本研究選擇PVA 3 個(gè)遺傳背景不同的分離物，分別接種在指示植物‘黃花煙’和較敏感馬鈴薯品種‘克新13號(hào)’上，觀察其致病性差異，比較馬鈴薯植株體內(nèi)病毒含量、葉片及塊莖癥狀的表現(xiàn)，以明確3 個(gè)分離物對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育的影響，對(duì)PVA 的鑒定及防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬鈴薯原原種‘克新13 號(hào)’和指示植物‘黃花煙’（Nicotiana rustica），由原黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所提供。

PVA 3 個(gè)遺傳背景不同的分離物2017-171、KB117 和2017-176，由原黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所測(cè)序并保存。

1.2 試驗(yàn)試劑

M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶試劑購(gòu)自Promega 公司；RNA 酶抑制劑、dNTP、Taq DNA 聚合酶、DNA Marker 均購(gòu)自于Takara 公司；Trizol 提取液購(gòu)自Invitrogen 公司；75%乙醇、異丙醇、氯仿、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O 等試劑為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物種植

在智能溫室中，按照珍珠巖∶爐灰∶草炭= 1∶1∶3的比例配制基質(zhì)，混勻后121℃濕熱滅菌30 min，冷卻后裝在口徑為25 cm 的花盆中。澆透水后將‘黃花煙’的種子均勻撒播，覆土1.0 cm 左右，待苗長(zhǎng)至2～3 cm 時(shí)分苗、移栽[13]。馬鈴薯塊莖芽眼朝上栽到盆中再覆土。

1.3.2 摩擦接種

待植株4～6 葉期，選擇在陰天或晚上，采用摩擦方式接種。在植株中上部?jī)善瑢?duì)稱葉上均勻噴灑適量碳化硅細(xì)粉，然后用棉簽沾PVA 病毒汁液摩擦接種[毒源∶接種緩沖液（含32 mmol/L Na2SO3和 10 mmol/L 磷酸鈉緩沖液，pH 7.5）=1 g∶3.3 mL]，30～60 min后清水沖洗掉殘余病毒汁液[14]。

對(duì)照（Mock）植株用接種緩沖液摩擦接種葉片，方法同上。每個(gè)處理5 次重復(fù)。接種后避光過夜。取新生的系統(tǒng)葉片進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)，確認(rèn)是否已成功接種PVA，并系統(tǒng)侵染。

1.3.3 總 RNA 提取及 cDNA 合成

試驗(yàn)采用Trizol 法提取植物總RNA，操作步驟參考Trizol 使用說明書。提取后的RNA 采用紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA 的OD260/OD280比值，當(dāng)比值在1.8～2.0 說明RNA 的純度較好，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。先將其保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

取1 μg總RNA，使用Takara公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，參照說明書進(jìn)行cDNA 合成，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 TaqMan 熒光定量PCR 探針和引物的選擇與合成

參考 Bright 等[15]PVA 的檢測(cè)方法。PVA 的特異性探針和引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。探針PVA 102-probe 序列為：5′ -Texas-CACTACCAATGCTCAAAGGTAGAGTGTCG-BHQ-3′； 上 游 引 物 PVA102-F： 5′-TGTCGATTTAGGTACTGCTGGGAC-3′； 下 游 引物PVA102-R：5′- TGCTTTGGTTTGTAAGATAGCAAGTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為132 bp。

1.3.5 TaqMan 熒光定量 PCR 擴(kuò)增

反應(yīng)體系為，模板cDNA 2 μL，上、下游引物各 0.5 μL（10 μmol/L），探針 0.5 μL，10 ×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶 0.20 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.25 μL，補(bǔ)水至25 μL。用水作為陰性對(duì)照，取濃度為 2.72 × 106copies/μL 的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品3 次重復(fù)。反應(yīng)程序：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。將樣品放入LightCycler?480 熒光定量?jī)x進(jìn)行TaqMan RT-qPCR 擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVA 不同分離物對(duì)指示植物‘黃花煙’的致病性差異

當(dāng)接種‘黃花煙’第7 d 時(shí)，分別取新生葉進(jìn)行PVA 的qRT-PCR 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，表明PVA 3 個(gè)分離物可以成功侵染‘黃花煙’。隨著時(shí)間的推移，其系統(tǒng)發(fā)病癥狀逐漸表現(xiàn)出來，圖1 為接種15 d 后的癥狀表現(xiàn)。

不同分離物在‘黃花煙’上的癥狀表現(xiàn)各有不同（圖1）。與對(duì)照相比，分離物2017-171 侵染‘黃花煙’后表現(xiàn)出葉片皺縮、泡斑和葉緣變形等癥狀；分離物KB117 侵染后，除了葉緣微皺縮外，還伴有明脈癥狀；分離物2017-176 侵染后葉片癥狀比較輕，僅表現(xiàn)微皺縮和點(diǎn)狀輕花葉現(xiàn)象。通過3個(gè)分離物侵染‘黃花煙’后葉片的癥狀差異，可以初步推斷他們的致病性具有一定差異。

圖1 PVA 不同分離物接種‘黃花煙’的癥狀Figure 1 Symptoms of 'Rustica Tobacco' inoculated with different PVA isolates

2.2 PVA不同分離物對(duì)馬鈴薯品種‘克新13號(hào)’的致病性差異

2.2.1 PVA 不同分離物在‘克新13 號(hào)’植株體內(nèi)病毒含量差異

分別在接種后的第2、5、10、15、20 和25 d取新生葉片，進(jìn)行PVA的qRT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，3個(gè)分離物均可以成功侵染‘克新13號(hào)’。

每個(gè)分離物在6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)病毒在植株體內(nèi)變化趨勢(shì)相似，即病毒進(jìn)入植株體內(nèi)，隨著時(shí)間的推移病毒含量逐漸增加，達(dá)到發(fā)病高峰期，隨后病毒含量開始降低。但3 個(gè)分離物在侵入植株體內(nèi)的初始時(shí)間、發(fā)病速度、發(fā)病高峰期的病毒含量方面具有一定的差異（表1）。

表1 不同PVA 分離物植株體內(nèi)病毒含量的變化（copies/μL）Table 1 Changes of virus contents in plants inoculated with different PVA isolates

分離物2017-171 接種后的第2 d qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，表明該分離物可以在接種后第2 d成功侵染‘克新13號(hào)’，其病毒在體內(nèi)含量為1.67×101copies/μL，隨著時(shí)間的推移，植株體內(nèi)病毒含量逐漸升高，第20 d 時(shí)達(dá)到最高值3.90 × 107copies/μL，隨后病毒含量又呈降低趨勢(shì)；分離物KB117接種后的第2 d開始侵染‘克新13號(hào)’，在第2～5 d 病毒含量累積緩慢，隨后病毒含量大幅度升高，第15 d 時(shí)達(dá)到發(fā)病高峰期，植株體內(nèi)病毒含量達(dá)最高值1.77 × 106copies/μL，隨后呈降低趨勢(shì)；分離物2017-176 接種后的第2 d 未能侵染‘克新13 號(hào)’，在第5 d 時(shí)才呈現(xiàn)病毒含量有所升高趨勢(shì)，隨后病毒含量大幅度升高，第15 d 時(shí)達(dá)到發(fā)病高峰期，植株體內(nèi)病毒含量達(dá)最高值1.29×107copies/μL，隨后病毒含量呈降低趨勢(shì)，表明此分離物侵染植株相對(duì)較慢。

由以上分析可知，分離物2017-171 和KB117均在接種后第2 d 開始侵入植株體內(nèi)，而2017-176 侵染速度相對(duì)較慢；2017-171 在接種后第20 d 病毒含量達(dá)到高峰，而2017-176 和KB117 在第5～10 d 病毒含量大幅度升高，都在15 d 時(shí)植株體內(nèi)病毒含量達(dá)到高峰，但KB117 的高峰含量低于2017-171 及2017-176。

2.2.2 PVA 不同分離物侵染‘克新13 號(hào)’植株癥狀差異

分別在接種后達(dá)到發(fā)病高峰期時(shí)觀察植株發(fā)病癥狀。與對(duì)照相比，分離物2017-171 接種‘克新13 號(hào)’后呈現(xiàn)輕花葉、葉緣微皺縮等癥狀；分離物KB117 接種‘克新13 號(hào)’后會(huì)出現(xiàn)葉緣變尖、波浪狀皺縮等癥狀；分離物2017-176 接種后，癥狀不明顯，僅個(gè)別葉片呈現(xiàn)輕微葉緣皺縮等癥狀（圖2）。不同分離物接種‘克新13 號(hào)’的植株癥狀表現(xiàn)存在差異，說明3 個(gè)分離物致病力有一定差別，但對(duì)植株整體長(zhǎng)勢(shì)影響不大。

圖2 不同PVA 分離物接種‘克新13 號(hào)’植株癥狀Figure 2 Symptoms of 'Kexin 13' inoculated with different PVA isolates

2.2.3 PVA 不同分離物侵染‘克新13 號(hào)’塊莖癥狀差異

從各分離物接種后的單株塊莖個(gè)數(shù)和塊莖癥狀可以看出（圖3），與對(duì)照相比，整體趨勢(shì)為，單株塊莖數(shù)減少、塊莖變小、芽眼變深，個(gè)別塊莖出現(xiàn)變形等癥狀。其中典型的塊莖癥狀與對(duì)照相比較，分離物2017-171 接種后塊莖出現(xiàn)裂口、芽眼變深癥狀；分離物KB117 接種后塊莖出現(xiàn)畸形癥狀、芽眼變深癥狀；分離物2017-176接種后塊莖僅出現(xiàn)芽眼變深癥狀。

圖3 不同PVA 分離物接種‘克新13 號(hào)’塊莖癥狀Figure 3 Symptoms of tubers of 'Kexin 13' inoculated with different PVA isolates

3 討 論

PVA 的寄主范圍相對(duì)較窄，主要以侵染茄科等植物為主，如馬鈴薯、番茄、洋酸漿、假酸漿、煙草等[16]。其侵染癥狀于1914年首次被報(bào)道[17]，并于1932 年正式命名[18]。PVA 主要通過種薯傳播和摩擦接觸傳播，還可以通過蚜蟲以非持久性方式傳播。隨著馬鈴薯種植面積的不斷擴(kuò)大以及各地種薯調(diào)運(yùn)而在世界范圍內(nèi)傳播。在中國(guó)，于1975年首次在黑龍江省克山縣發(fā)現(xiàn)此病毒[19]，而后幾乎遍布于馬鈴薯的各主要產(chǎn)區(qū)[20]。

PVA 侵染馬鈴薯時(shí)，其癥狀類型，與馬鈴薯品種、病毒株系、環(huán)境條件等具有一定相關(guān)性[21-23]，抗性較強(qiáng)品種，一般不表現(xiàn)癥狀，而致病性相對(duì)較強(qiáng)株系可以導(dǎo)致馬鈴薯敏感品種產(chǎn)生花葉、斑駁、皺縮等較嚴(yán)重癥狀。

范國(guó)權(quán)等[24]將馬鈴薯9 種病毒接種在黑龍江省10 個(gè)馬鈴薯主栽品種上，當(dāng)PVA 和PVY 復(fù)合侵染品種‘克新13 號(hào)’時(shí)，植株癥狀較其他品種明顯，且產(chǎn)量影響顯著。魏旭言[25]將具有較強(qiáng)致病性的PVA 分離物接種在10 個(gè)馬鈴薯主栽品種上，有5 個(gè)品種接種成功，其中‘克新13 號(hào)’和‘麗薯6 號(hào)’接種后植株及塊莖致病癥狀較明顯，測(cè)定發(fā)病高峰期PVA 病毒含量，結(jié)果為‘克新13 號(hào)’表現(xiàn)最高，說明PVA 對(duì)此品種危害性最強(qiáng)。

不同PVA 分離物在同一馬鈴薯品種上引起的致病癥狀也不相同。Valkonen 等[26]將PVA 接種到馬鈴薯品種‘King Edward’上，根據(jù)侵染癥狀不同將PVA 分離物分成了3 組，分別為植株上部葉片典型性壞死、葉片斑駁和無感染癥狀3 種類型，之后Rajam?ki 等[22]研究又增加了一組，該株系可引起‘King Edward’全株葉片發(fā)黃、植株矮化。同時(shí)Rajam?ki 等[22]將來源于不同國(guó)家的18 個(gè)PVA分離物CP 序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)其序列差異顯著，存在明顯多樣性。

本研究將3 種PVA 分離物分別接種在指示植物‘黃花煙’和馬鈴薯品種‘克新13 號(hào)’上，通過qRT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性，其中分離物2017-171 癥狀最明顯，導(dǎo)致‘黃花煙’葉片皺縮、泡斑和葉緣變形等癥狀，馬鈴薯植株葉片出現(xiàn)葉緣皺縮并伴有輕花葉癥狀，塊莖出現(xiàn)嚴(yán)重裂口、芽眼變深癥狀；KB117 次之，可使‘黃花煙’葉緣微皺縮并伴有明脈癥狀，馬鈴薯植株葉緣變尖、波浪狀皺縮，塊莖發(fā)生畸形且芽眼變深；2017-176 癥狀相對(duì)不明顯，‘黃花煙’僅葉片微皺縮、點(diǎn)狀輕花葉，馬鈴薯植株僅個(gè)別葉片呈現(xiàn)輕微葉緣皺縮，塊莖未出現(xiàn)畸形只存在芽眼變深癥狀。同時(shí)進(jìn)行qRT-PCR 表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)2017-171 在馬鈴薯體內(nèi)病毒含量最高，其次為2017-176 和 KB117。綜上分析看出，3 種 PVA 分離物均可以成功侵染指示植物‘黃花煙’和馬鈴薯植株，且分離物2017-171 致病力最強(qiáng)，不僅在植株體內(nèi)含量最高，還能導(dǎo)致馬鈴薯塊莖畸形并產(chǎn)生裂口現(xiàn)象。PVA 不同株系的致病性分析為其有效防治提供了有價(jià)值的理論依據(jù)。