王 林,王 媚,王 維

(1西安市第一醫(yī)院檢驗科,西安 710002;2西北有色醫(yī)院檢驗科;3西安市兒童醫(yī)院檢驗科;*通訊作者,E-mail:doctordian.dian@163.com)

細菌感染是威脅兒童健康的主要病因之一,而病原菌診斷的“金標準”仍依賴于傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)。細菌種類多、培養(yǎng)條件要求不一且耗時較長,此已成為限制微生物檢驗診斷學(xué)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1,2]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)在臨床微生物檢驗的應(yīng)用大大縮短了鑒定時間,快速、敏感、高效的特點使其廣泛應(yīng)用于臨床微生物鑒定,顯著降低了樣本檢測的時間成本和經(jīng)濟成本[3]。此技術(shù)不但可以直接鑒定單個純化菌落,而且直接進行無菌體液樣本(腦脊液、血液、膽汁、胸腹水)細菌鑒定,成為近年來研究熱點[4-7]。由于直接鑒定的不穩(wěn)定型導(dǎo)致此項技術(shù)在臨床仍未大規(guī)模開展,但近年來商品化的試劑盒加速了標本質(zhì)譜直接鑒定的發(fā)展。本研究利用Microflex LT型全自動快速生物質(zhì)譜監(jiān)測系統(tǒng)及MALDI Sepsityper試劑盒直接鑒定血培養(yǎng)報警陽性標本及尿常規(guī)提示細菌感染陽性尿標本,比較直接鑒定與傳統(tǒng)單個菌落鑒定結(jié)果符合情況,探究此快速鑒定方法的臨床價值,為患兒病原菌的及時診斷提供一個有效可行的實驗室檢測手段。

1 材料與方法

1.1 標本來源

1.1.1 血培養(yǎng)陽性報警標本 收集西安市兒童醫(yī)院檢驗科微生物室2019年10月至2020年6月血培養(yǎng)報警陽性標本382份(報警時間<48 h),剔除同一人同一天報警的重復(fù)標本。364份標本為單一菌感染,18份標本為兩種及兩種以上菌混合感染,其中分離出革蘭陽性菌89株,革蘭陰性菌271株,念珠菌4株。

1.1.2 尿液標本 收集西安市兒童醫(yī)院檢驗科微生物室2019年10月至2020年6月尿液標本265份。所有尿標本要求同一天送檢尿常規(guī)結(jié)果白細胞及白細胞酯酶陽性,提示有尿路感染的標本進行質(zhì)譜直接鑒定。

1.2 儀器試劑

1.3 檢測方法

1.3.1 血培養(yǎng)報警陽性標本 取1 ml陽性血培養(yǎng)標本置于1.5 ml EP管,根據(jù)試劑說明書,加入細胞裂解液渦旋震蕩離心,吸取上清加入清洗液中混勻,再次離心,吸上清應(yīng)用甲酸提取法得到細菌蛋白樣品,取1 μl靶板點樣進行質(zhì)譜鑒定。

1.3.2 提示尿路感染尿液標本 采用差速離心法富集細菌。取尿液標本1 ml置于EP管中,2 000g離心30 s,取上清,16 000g離心5 min棄上清向沉渣中加入0.9%氯化鈉溶液500 μl震蕩混勻后12 000g離心5 min,棄上清,加1 ml去離子水洗滌沉淀,再次離心棄去上清液。取濃集的細菌標本1 μl靶板點樣,溫自然干燥后加1 μl 70%甲酸破壞細胞壁,室溫干燥后再加1 μl 70%甲酸2次破壁,自然干燥后加1 μl基質(zhì)液晾干進行質(zhì)譜鑒定。收集尿路感染常見細菌配制稀釋不同濃度菌懸液,采用上述方法質(zhì)譜直接鑒定,分析其鑒定濃度檢測低限。

1.3.3 鑒定結(jié)果判斷 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀首先采集的每個樣本指紋圖譜,利用軟件BioTyper和FlexAnalysis比對分析,得到分類結(jié)果報告分值。結(jié)果得分判定標準:0.000-1.699,不可靠的鑒定(紅色);1.700-1.999,可能的屬水平鑒定(黃色);2.00-2.299,確定的屬水平鑒定或可能的種水平鑒定(綠色);2.300-3.000,高置信度的種水平鑒定(綠色)。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示,組間比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兒童常見單一菌血流感染質(zhì)譜直接鑒定和培養(yǎng)后菌落鑒定結(jié)果比較

單一菌血流感染,共分離出革蘭陽性菌219株,革蘭陰性菌133株,真菌12株。MALDI-TOF-MS直接鑒定與培養(yǎng)后菌落鑒定結(jié)果進行比較,革蘭陽性菌兩者鑒定符合率為84.3%(177/210),革蘭陰性菌鑒定符合率為88.4%(114/129),真菌鑒定符合率為44.4%(4/9)。MALDI-TOF-MS直接鑒定革蘭陰性菌鑒定率高于革蘭陽性菌,分別與菌落鑒定率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。真菌直接鑒定與菌落鑒定比較,鑒定率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),具體各類菌鑒定菌株數(shù)及鑒定率見表1。

表1 質(zhì)譜血流感染直接鑒定與培養(yǎng)后菌落鑒定結(jié)果比較 株(%)

2.2 單一菌血流感染質(zhì)譜直接鑒定和培養(yǎng)后菌落鑒定分值及曲線比較

MALDI-TOF-MS直接鑒定血培養(yǎng)報警陽性瓶,本研究發(fā)現(xiàn)鑒定結(jié)果一致時,直接鑒定分值低于菌落鑒定(見圖1),質(zhì)譜直接鑒定大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌的評分依次為1.882,1.967,1.653,而培養(yǎng)后菌落鑒定評分較高,分別為2.298,2.289,1.98。觀察細菌指紋圖譜發(fā)現(xiàn)在峰值基本一致情況下,即蛋白含量相近條件時,菌落鑒定較直接鑒定細菌特征峰數(shù)量多,干擾雜峰少,匹配結(jié)果較好。

紅色為質(zhì)譜直接鑒定曲線,藍色為質(zhì)譜菌落鑒定曲線

2.3 兒童常見單一菌尿路感染質(zhì)譜直接鑒定和培養(yǎng)后菌落鑒定結(jié)果比較

收集檢測并統(tǒng)計分析菌落計數(shù)≥105cfu/ml的尿培養(yǎng)標本264份,覆蓋兒童尿路感染常見細菌,包括革蘭陰性菌、陽性菌及真菌。大腸埃希菌質(zhì)譜直接鑒定符合率最高(92.2%),真菌直接鑒定率較低,白色念珠菌共11株,僅3株直接鑒定到種屬,多數(shù)結(jié)果為不可靠鑒定?？傮w尿路感染標本細菌直接鑒定符合率為83.3%(221/265),各種細菌直接鑒定具體結(jié)果見表2。

表2 兒童常見單一菌尿路感染質(zhì)譜直接鑒定與培養(yǎng)后菌落鑒定結(jié)果比較 株(%)

2.4 兒童尿路感染常見菌不同檢測濃度質(zhì)譜鑒定評分情況

對兒童尿路感染常見的革蘭陰性菌及陽性菌進行倍比稀釋,模擬尿路感染不同細菌濃度情況,采用差速離心法離心后進行質(zhì)譜鑒定。大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌及糞腸球菌不同濃度菌液行質(zhì)譜鑒定得出鑒定結(jié)果評分見表3。尿路感染中此四種常見菌直接質(zhì)譜鑒定最低檢測限度分別為1.5×104,1.5×105,1.5×105,1.5×106,1.5×106cfu/ml。

表3 兒童常見單一菌尿路感染質(zhì)譜直接鑒定細菌濃度及對應(yīng)評分

3 討論

兒童免疫力低,細菌感染后病情發(fā)展迅速,早期且準確的病原學(xué)檢測結(jié)果對患兒的診治尤為重要,可顯著降低用藥不當所致的病死率和住院費用,快速捕捉病原菌已成為國內(nèi)外微生物臨床應(yīng)用的研究熱點。MALDI-TOF-MS是近年發(fā)展起來的一種新型細菌鑒定技術(shù),可以快速準確地進行菌種鑒定,對培養(yǎng)后菌落的鑒定在臨床已應(yīng)用成熟。該菌落鑒定技術(shù)具有高度穩(wěn)定性及準確性,極大縮短了菌株的傳統(tǒng)鑒定時間,其成本也遠低于傳統(tǒng)生化鑒定[8,9]?，F(xiàn)階段MALDI-TOF-MS技術(shù)對于標本的直接鑒定仍然為實驗室檢測的難點。不同方法處理血培養(yǎng)陽性標本后質(zhì)譜直接鑒定的研究一直不斷,但不同前處理方法可直接影響其鑒定效果及結(jié)果判定[10-12]。

本研究選取臨床常見的兩類無菌體液標本,血培養(yǎng)陽性報警標本采用質(zhì)譜儀配套前處理試劑盒提蛋白后進行直接質(zhì)譜鑒定;尿路感染患兒尿液標本,采用差速離心法,離心取菌液沉淀直接質(zhì)譜鑒定。血培養(yǎng)標本直接質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示,革蘭陽性菌、陰性菌、真菌的鑒定符合率分別為84.3%,88.4%,44.4%,革蘭陽性菌及陰性菌質(zhì)譜直接鑒定與菌落鑒定結(jié)果比較無顯著差異(P>0.05),真菌直接鑒定結(jié)果不理想,與菌落質(zhì)譜鑒定結(jié)果存在較大差異,此與近年來國內(nèi)外研究一致[13]。此結(jié)果提示對于臨床血培養(yǎng)陽性報警標本,若涂片提示非真菌,即可直接進行質(zhì)譜鑒定確定菌種,以具體菌名的方式向臨床發(fā)出一級預(yù)警報告,從而取代傳統(tǒng)的僅有涂片結(jié)果的一級報告模式,為臨床選擇抗菌藥物提供快速、準確的病原學(xué)證據(jù)。直接鑒定與菌落鑒定的細菌指紋圖譜及結(jié)果評分對比發(fā)現(xiàn),菌落鑒定圖譜的特征峰數(shù)量多,干擾雜峰少,匹配結(jié)果較好,結(jié)果分值較高,為2.00-2.299確定的屬水平鑒定或可能的種水平鑒定(綠色)。此外,該研究發(fā)現(xiàn)對于報陽時間較長、生長較緩慢的細菌,直接鑒定結(jié)果不理想,這與慢生長菌濃度低有一定關(guān)系。尿液標本質(zhì)譜直接鑒定過程中甲酸破壁步驟進行了兩次,發(fā)現(xiàn)該實驗兩遍甲酸處理相對一次鑒定結(jié)果更好,對于常見尿路感染菌大腸埃希菌及糞腸球菌鑒定符合率達90%以上。真菌鑒定結(jié)果符合率僅27.3%,低于同類研究結(jié)果,因為其他實驗者自建的真菌鑒定評分截點為1.50,低于常規(guī)鑒定評分標準[14]。兒童尿路感染常見菌(大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌及糞腸球菌)質(zhì)譜直接鑒定最低檢測限度分別為1.5×104,1.5×105,1.5×105,1.5×106,1.5×106cfu/ml。眾所周知,對于單純泌尿系感染的患兒,其尿液細菌濃度判斷閾值通常為105cfu/ml,結(jié)合本研究結(jié)果提示微生物檢驗人員對于臨床明確診斷的泌尿系感染患兒尿培養(yǎng)標本可進行質(zhì)譜直接鑒定,縮短報告時間并指導(dǎo)臨床及時用藥,同時為探索尿培養(yǎng)標本進行直接藥敏試驗提供了新思路。

該研究發(fā)現(xiàn)對于尿液標本的直接鑒定,需注意以下幾點:菌量多時峰圖信號好,檢測結(jié)果可靠,分值高;尿常規(guī)顯示蛋白尿時,蛋白等雜質(zhì)干擾掩蓋檢測信號,鑒定會受影響,與其他研究一致[15];兩種混合生長的細菌鑒定結(jié)果不理性。有研究報道,對有兩種混合生長細菌的尿液標本MALDI-TOF-MS技術(shù)鑒定結(jié)果較差,尤其兩種菌存在優(yōu)劣勢生長時,往往僅能鑒定出優(yōu)勢生長的細菌[16]。此時,可根據(jù)離心后涂片鏡檢結(jié)果不同微生物采用不同的預(yù)處理方法,保證結(jié)果準確性。

綜上所述,本研究采用不用的前處理方法,利用MALDI-TOF-MS快速直接對血培養(yǎng)報警陽性瓶及尿路感染尿液標本進行鑒定,對兒童常見感染菌結(jié)果與傳統(tǒng)菌落鑒定符合率較高。本方法實用性強,可在急重癥感染患兒中進行臨床推廣,以快速檢測病原菌,可作為實驗室傳統(tǒng)鑒定方法的有效補充,及時為臨床選擇抗菌藥物提供病原學(xué)證據(jù)。隨著研究的不斷深入,標本前處理方法的不斷成熟,相信MALDI-TOF-MS細菌直接鑒定及直接藥敏試驗的應(yīng)用,會為臨床診治提供更好的實驗室支持和幫助。