張 馳,盧 山

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023) (2.南京師范大學(xué)江蘇省分子醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

2020年,美國男性新增癌癥病例中,前列腺癌(prostate cancer,PCa)以21%的發(fā)病率躍居發(fā)病率首位,死亡率高達(dá)10%,僅次于肺癌和支氣管癌[1]. 雖然前列腺癌高發(fā)病率主要集中在中南美洲、西歐和北歐以及撒哈拉以南非洲地區(qū)[2],但近年來我國前列腺癌發(fā)病率也呈明顯上升趨勢,這和國內(nèi)高蛋白、高脂肪飲食結(jié)構(gòu)傾向、家族病史影響以及平均壽命延長等密切相關(guān)[3]. 尋找和解析影響前列腺癌發(fā)生發(fā)展的新分子靶標(biāo)和分子機(jī)制迫在眉睫.

USP13是泛素特異性蛋白酶(ubiquitin specific protease,USP)超家族中的一員,其依賴Cys345的催化活性逆轉(zhuǎn)泛素化過程,水解多聚泛素鏈羧基端的肽鍵或酯鍵將泛素鏈從底物上分離[4]. USP13從N端到C端依次為ND(N-terminal domain)、ZnF(zinc finger domain)、C box(catalytic domain)、UBA1/2(ubiquitin associated domain)和H box(catalytic domain)結(jié)構(gòu)域[5-6]. ZnF結(jié)構(gòu)域能與游離泛素鏈的C末端結(jié)合,激活酶本身的去泛素化活性[7]. 兩個(gè)串聯(lián)的UBA1/2結(jié)構(gòu)域是泛素特異性受體. 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,USP13在不同腫瘤中發(fā)揮抑癌或促癌的不同作用[8-11]. USP13在前列腺癌中的作用及調(diào)控機(jī)理尚未見文獻(xiàn)報(bào)道. 本研究首先在前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU145中轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-USP13-HA質(zhì)粒,利用CCK-8法、克隆形成、劃痕及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)分別檢測USP13對細(xì)胞增殖、克隆和遷移能力的影響;然后,在上述兩種細(xì)胞中過表達(dá)或敲低USP13,采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡(western blotting)技術(shù)分別檢測USP13對STAT1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的調(diào)控;同時(shí),在DU145細(xì)胞中,過表達(dá)或敲低USP13進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn),檢測STAT1泛素化水平的變化. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP13能夠通過影響STAT1泛素化水平調(diào)節(jié)穩(wěn)定STAT1,可為深入研究USP13在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),還可以為開發(fā)前列腺癌治療藥物提供新思路.

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞

CaCl2法制備的大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞和真核表達(dá)載體pcDNA3.0-HA由本實(shí)驗(yàn)室保藏;人前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU145購自上海復(fù)祥生物科技有限公司.

1.1.2 主要試劑

HindⅢ-HF(星選酶)、XhoⅠ(星選酶)購自NEB(北京)公司;DNA Marker購自上海捷瑞生物工程有限公司;PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 、T4 DNA連接酶購自Takara公司;2×Taq Master Mix、FastPure?Gel DNA ExtractionMini Kit、HiScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司;去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;RPMI 1640粉末、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司;0.25%胰蛋白酶購自德國Capricorn Scientific公司;Lipofectamine?2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;USP13兔一抗、STAT1兔一抗購自Proteintech公司;β-Actin兔一抗購自ABclonal公司;SMURF2鼠一抗、ProteinA/G瓊脂糖珠購自Santa Cruz公司;Ubiquitin鼠一抗購自CST公司;pEGFP-N1-USP13真核表達(dá)質(zhì)粒、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自南京巴傲德生物科技有限公司;siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;青霉素-鏈霉素溶液(100×)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、兔IgG、小鼠IgG、MG132、RIPA裂解液(強(qiáng))、Western及IP細(xì)胞裂解液、cocktail(磷酸酶抑制劑混合物)、蛋白標(biāo)準(zhǔn)(5 mg/mL BSA)均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;福林酚購自北京索萊寶科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

參考GeneBank數(shù)據(jù)庫中人USP13基因mRNA序列(NM_003940.3),應(yīng)用SnapGene v5.2.3軟件設(shè)計(jì)PCR引物,上游引物為5′-CC AAGCTT ATGCAGCGCCGGGGC-3′;下游引物為5′-CC CTCGAG GCTTGGTATCCTGCGGTAAAAGTAC-3′. 按PrimeSTAR?HS DNA Polymerase說明書,以pEGFP-N1-USP13質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為50 μL,反應(yīng)條件為:98 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,72 ℃ 160 s,共35個(gè)循環(huán). PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后,用FastPure?Gel DNA ExtractionMini Kit回收,然后用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ分別對USP13基因和pcDNA3.0-HA質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,將雙酶切后的USP13基因和pcDNA3.0-HA質(zhì)粒按10∶1混合,加入T4 DNA連接酶,16 ℃酶連過夜. 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃,200 r/min搖菌1 h,將轉(zhuǎn)化后菌液涂布于含氨芐抗性的固體LB平板上,37 ℃培養(yǎng)過夜. 第二天挑取4個(gè)單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng),第三天提取質(zhì)粒并用HindⅢ和XhoⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行單、雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離,利用凝膠成像系統(tǒng)拍照,根據(jù)DNA條帶大小判斷目的基因是否成功構(gòu)建到載體上. 最后將重組質(zhì)粒送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司測序,將測序結(jié)果與NM_003940.3進(jìn)行序列比對.

1.2.2 質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞

取約3.5×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染. (1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí),將A液(100 μL RPMI-1640+2 μg pcDNA3.0-USP13-HA)與B液(100 μL RPMI-1640+3 μL Lipofectamine?2000)分別于1.5 mL EP管中室溫靜置5 min,將A液加入到B液中混勻,室溫靜置10 min;(2)siRNA轉(zhuǎn)染時(shí),將C液(100 μL RPMI-1640+100 pmol siUSP13)與D液(100 μL RPMI-1640+5 μL Lipofectamine?2000)分別于1.5 mL EP管中室溫靜置5 min,將C液加入到D液中混勻,室溫靜置10 min. 將上述混懸液分別加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞中,每孔添加無血清、無雙抗1640培養(yǎng)基至2 mL,在轉(zhuǎn)染4～6 h后棄去舊培養(yǎng)基,更換為含5% FBS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h待用.

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,取約2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后加入10 μL/孔CCK-8溶液;以第一次加入CCK-8溶液的時(shí)間點(diǎn)計(jì)作0 h,后續(xù)按不同時(shí)間點(diǎn)(24 h、48 h、72 h)再加入CCK-8溶液,同時(shí)用酶標(biāo)儀測定和記錄A549nm吸光值.

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,取約2×103個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中,每2～3 d更換一次培養(yǎng)基;待細(xì)胞種板7～10 d后進(jìn)行結(jié)晶紫染色:4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min,1×PBS漂洗3次,每孔加入1 mL 0.1%結(jié)晶紫染液室溫靜置20 min,1×PBS漂洗3次;染色結(jié)束后用高清攝像機(jī)拍照.

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,取約2×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔板中,待細(xì)胞貼壁后使用同一支滅菌的200 μL黃槍頭進(jìn)行劃痕,劃痕結(jié)束后用無菌1×PBS洗去漂浮細(xì)胞,置于顯微鏡下拍照(50×),此時(shí)記做0 h;拍照后棄去PBS,加入1 mL含1%血清、不含抗生素的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);待第一次劃痕24 h、48 h后分別置于顯微鏡下拍照(50×).

1.2.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,取約4×104個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室中,上室中加入200 μL細(xì)胞懸液,下室中加入500 μL含20% FBS的1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h后進(jìn)行結(jié)晶紫染色,染色結(jié)束后將小室置于載玻片上,置于顯微鏡下拍照(50×).

1.2.7 DC法蛋白定量

將蛋白標(biāo)準(zhǔn)(5 mg/mL BSA)用ddH2O稀釋至以下濃度:5 mg/mL,2.5 mg/mL,1.25 mg/mL,0.625 mg/mL,0.313 mg/mL,0.156 mg/mL,0.078 mg/mL,0 mg/mL;向96孔板中分別加入5 μL不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)以及待測蛋白樣品,設(shè)3個(gè)重復(fù);按照樣品孔數(shù)現(xiàn)配現(xiàn)用試劑C(試劑C=試劑A+試劑S,其中V試劑A∶V試劑S=50∶1),每孔加入25 μL試劑C,然后加入200 μL 1×福林酚溶液混勻,室溫避光靜置20 min;酶標(biāo)儀755 nm測定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測蛋白樣品濃度. 其中,試劑A為:Na2CO320%+NaOH 5%;試劑S為:CuSO40.25%+酒石酸鈉0.5%+SDS 2.5%.

1.2.8 Trizol法提取細(xì)胞總RNA

待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,每孔加入500 μL Trizol試劑,室溫靜置5 min,將混懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,按Trizol∶氯仿=5∶1的體積比加入氯仿,渦旋15 s后室溫靜置5 min;4 ℃,12 000 r/min離心15 min,將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中,按Trizol∶異丙醇=2∶1的體積比加入異丙醇混勻,室溫靜置10 min;4 ℃,12 000 r/min離心10 min,棄上清,加入1 mL 75% RNAse Free乙醇清洗RNA;4 ℃,7 500 r/min離心5 min,棄上清,室溫靜置控干EP管,加入20 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA.

1.2.9 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測mRNA表達(dá)

待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,利用HiScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Ki將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,具體步驟詳見試劑盒內(nèi)說明書;參考GeneBank中人USP13(NM_003940.3)和人STAT1(NM_007315.4)基因序列,應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物;按2×Taq Master Mix說明書,以cDNA為模板進(jìn)行PCR,反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 5 min,共30個(gè)循環(huán);用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物條帶.

1.2.10 蛋白質(zhì)免疫印跡(western blotting)

待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,1×PBS漂洗細(xì)胞3次,每孔加入120 μL蛋白裂解液(RIPA裂解液∶苯甲基磺酰氟∶cocktail=9∶1∶0.1),冰上裂解30 min,提取細(xì)胞總蛋白;用DC法對蛋白樣品進(jìn)行定量,加入5×蛋白上樣緩沖液(5×loading buffer)將蛋白樣品配成20 μg/20 μL,95 ℃煮樣5 min;取20 μL樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),260 mA恒流濕轉(zhuǎn)100 min,取出聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h,1×PBST(磷酸鹽緩沖液+吐溫)洗膜3次,一抗4 ℃孵育過夜;1×PBST洗膜3次,二抗室溫孵育 1 h,1×PBST洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影,用天能全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)拍照.

1.2.11 蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-IP)

待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,1×PBS漂洗細(xì)胞3次,按Western及IP細(xì)胞裂解液∶苯甲基磺酰氟∶cocktail=9∶1∶0.1 配置IP裂解液;每孔加入100 μL IP裂解液,將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,插于冰上,置于搖床上40～50 r/min裂解細(xì)胞30 min;4 ℃,12 000 r/min離心20 min,取上清進(jìn)行DC法蛋白定量,然后分為3組:Input組、IgG組和抗體組;向Input組加入5×loading buffer煮樣配置成20 μg/20 μL;分別向IgG組和抗體組加入1 μg IgG抗體和1 μg目的抗體,4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床孵育過夜;分別向IgG組和抗體組加入25 μL Protein A/G瓊脂糖珠,4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床孵育4 h;4 ℃,3 000 r/min離心5 min,棄上清,加入1×PBS,4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床漂洗5次,最后一次離心棄干凈上清;最后加入25 μL 2×loading buffer,100 ℃煮樣5 min,取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳.

1.2.12 統(tǒng)計(jì)分析

使用Image Pro Plus 6.0和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的結(jié)果統(tǒng)計(jì)均以Mean±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示,使用t檢驗(yàn)(t test)分析數(shù)據(jù)以確定不同組之間的顯著差異;*表示P<0.05,**表示P<0.01.

圖1 pcDNA3.0-USP13-HA真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 Construction of eukaryotic expression plasmid pcDNA3.0-USP13-HA

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建pcDNA3.0-USP13-HA真核表達(dá)質(zhì)粒

空載體質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的凝膠電泳鑒定和酶切結(jié)果如圖1(a)所示,泳道1和2分別為空載體質(zhì)粒pcDNA3.0-HA和重組質(zhì)粒pcDNA3.0-USP13-HA的HindⅢ單酶切產(chǎn)物,兩條帶長度分別為5 448 bp和 7 985 bp;泳道3為重組質(zhì)粒pcDNA3.0-USP13-HA的HindⅢ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物,產(chǎn)物中USP13條帶大小為2 595 bp,由此可見目的基因已構(gòu)建到載體上. 如圖1(b)所示,經(jīng)測序分析,證實(shí)重組質(zhì)粒pcDNA3.0-USP13-HA構(gòu)建成功.

2.2 USP13抑制前列腺癌細(xì)胞增殖

為了檢測USP13對前列腺癌細(xì)胞增殖的影響,本研究通過CCK-8法檢測過表達(dá)USP13的前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU145在0～72 h期間的細(xì)胞增殖變化. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,過表達(dá)USP13組細(xì)胞生長曲線與對照組有明顯差異,說明過表達(dá)USP13能夠顯著抑制前列腺癌細(xì)胞增殖能力.

圖2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖Fig.2 Cell proliferation by CCK-8 assay

2.3 USP13抑制前列腺癌細(xì)胞克隆形成能力

為了探究USP13對前列腺癌細(xì)胞克隆形成能力的影響,本研究在PC-3細(xì)胞中過表達(dá)USP13,進(jìn)行克隆形成的觀察. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,與對照組相比,過表達(dá)USP13組的克隆數(shù)顯著降低,且形成的克隆較小,說明過表達(dá)USP13會抑制前列腺癌細(xì)胞的克隆形成能力.

圖3 克隆形成實(shí)驗(yàn)Fig.3 Colony formation assay

2.4 USP13抑制前列腺癌細(xì)胞遷移

為了探究USP13對前列腺癌細(xì)胞遷移能力的影響,本研究進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn). 結(jié)果如圖4(a)所示,與對照組相比,無論在PC-3細(xì)胞還是在DU145細(xì)胞中,過表達(dá)USP13均顯著降低細(xì)胞遷移能力. 對這兩種細(xì)胞進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖4(b)所示,再次證實(shí)過表達(dá)USP13抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移能力.

2.5 USP13正調(diào)控STAT1蛋白水平

為了探究前列腺癌細(xì)胞中USP13的下游信號途徑,本研究利用PT-PCR檢測了USP13過表達(dá)對STAT1轉(zhuǎn)錄水平的影響,相關(guān)引物設(shè)計(jì)如表1所示. 當(dāng)PC-3和DU145細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-USP13-HA質(zhì)粒時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(a)所示.STAT1 mRNA水平未發(fā)生變化,說明過表達(dá)USP13不影響STAT1轉(zhuǎn)錄水平. 利用western blotting檢測過表達(dá)或敲減USP13條件下STAT1蛋白表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(b)所示. 當(dāng)PC-3和DU145細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染兩種USP13重組質(zhì)粒(pcDNA3.0-USP13-HA和pEGFP-N1-USP13)時(shí),STAT1蛋白水平均顯著上升;反之,當(dāng)轉(zhuǎn)染siUSP13時(shí),STAT1蛋白水平則明顯下降;說明在前列腺癌細(xì)胞中USP13正調(diào)控STAT1蛋白水平,由此推測USP13可能通過去泛素化作用影響STAT1泛素化水平,進(jìn)而使胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)STAT1蛋白水平增加.

2.6 USP13降低STAT1泛素化水平

為了確認(rèn)USP13對STAT1蛋白進(jìn)行泛素化蛋白酶體降解的影響,本文在DU145細(xì)胞中加入蛋白酶體抑制劑MG132條件下,轉(zhuǎn)染USP13重組質(zhì)粒或siUSP13,進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6(a)所示,與MG132單獨(dú)處理組相比,USP13過表達(dá)顯著下調(diào)STAT1泛素化水平;與此相反,如圖6(b)所示,敲低USP13時(shí),STAT1泛素化水平上升;說明前列腺癌細(xì)胞中USP13通過發(fā)揮去泛素化酶作用,降低STAT1泛素化水平,從而使胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)STAT1蛋白水平增加.

圖4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)Fig.4 Cell migration assay

表1 RT-PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 Design of RT-PCR primers

圖5 USP13正調(diào)控STAT1蛋白水平Fig.5 USP13 regulated STAT1 protein positively

圖6 USP13降低STAT1泛素化水平Fig.6 USP13 reduced STAT1 ubiquitination

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了USP13基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒,在前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU145中轉(zhuǎn)染USP13重組質(zhì)粒,觀察到過表達(dá)USP13顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、克隆和遷移能力. USP13盡管在黑色素瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌和卵巢癌中起到促癌作用,但在乳腺、膀胱等腫瘤中和本文研究結(jié)果相一致,發(fā)揮抑癌作用[12].

有文獻(xiàn)報(bào)道,USP13能夠去泛素化調(diào)控STING蛋白(與宿主防御病毒有關(guān)),水解K27連接的多聚泛素鏈,阻礙STING招募TBK1到信號復(fù)合物上,削弱細(xì)胞對病毒的免疫反應(yīng)[13]. 在肺成纖維細(xì)胞中,USP13能夠通過去泛素化Smad 4延長其蛋白穩(wěn)定性,經(jīng)TGF-β1刺激后,胞漿中的USP13和Smad 4共同轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,上調(diào)ECM(extracellular matrix)相關(guān)基因的表達(dá)以維持細(xì)胞外基質(zhì)分泌[14]. 但在乳腺癌細(xì)胞中,過表達(dá)USP13顯著增加內(nèi)源性PTEN蛋白表達(dá),且USP13通過去泛素化作用穩(wěn)定PTEN,從而抑制AKT磷酸化介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、糖酵解和腫瘤生長[8]. 在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)中,USP13也是通過調(diào)控PTEN/AKT信號通路發(fā)揮腫瘤抑制因子的功能,主要體現(xiàn)在過表達(dá)USP13后誘導(dǎo)PTEN上調(diào),并抑制p-AKT激活,在體外抑制OSCC細(xì)胞增殖[9]. 而且,在肺腺癌細(xì)胞中USP13通過去泛素化作用穩(wěn)定STAT1蛋白水平,正調(diào)控I型和II型IFN信號途徑,提高細(xì)胞的抗病毒活性[15]. STAT1屬于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員,目前已發(fā)現(xiàn)的STAT家族還包含2、3、4、5a、5b和6等. 激活的STAT1和STAT2可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種抗病毒蛋白(如Mx1、OAS、IRF-7)抑制丙型肝炎病毒復(fù)制,激活的STAT3促進(jìn)包含肝癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生[16]. 但大多數(shù)研究表明,激活的STAT1是作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用的[17-19]. 有文獻(xiàn)報(bào)道,BRCC36利用USP13形成一種復(fù)合物來拮抗SMURF1介導(dǎo)的STAT1泛素化降解,從而維持纖維肉瘤細(xì)胞中穩(wěn)態(tài)STAT1蛋白水平[20]. 本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)或敲低USP13對STAT1轉(zhuǎn)錄水平無影響,但對STAT1蛋白水平呈現(xiàn)顯著的正調(diào)控作用,提示USP13在前列腺癌細(xì)胞中可通過上調(diào)STAT1進(jìn)而發(fā)揮抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、克隆和遷移的作用.

通過泛素化Co-IP實(shí)驗(yàn),本文證實(shí)USP13在前列腺癌細(xì)胞DU145中顯著影響STAT1蛋白泛素化水平,說明USP13是通過對STAT1去泛素化,抑制STAT1蛋白泛素-蛋白酶體降解而上調(diào)STAT1蛋白. 還有文獻(xiàn)報(bào)道,USP13中充當(dāng)泛素特異性受體并發(fā)揮催化作用的是UBA1/2域而不是ZnF域,具有較弱的去泛素化功能,僅能水解K63連接的多聚泛素鏈[21]. 因此,USP13在前列腺癌中是否存在其他作用也值得深入探討. 另一個(gè)重要的去泛素化酶USP5與USP13擁有相似的去泛素化結(jié)構(gòu)域,前列腺癌中USP13是否發(fā)揮特異性的STAT1去泛素化作用也值得進(jìn)一步研究. 此外,由于鋅指蛋白Slug可通過抑制E-cadherin表達(dá)促進(jìn)EMT發(fā)生[22],在肺癌細(xì)胞中,STAT1入核并結(jié)合到EMT標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子Slug的啟動子上抑制Slug轉(zhuǎn)錄,從而抑制肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT[23]. 據(jù)此可以推測,在前列腺癌中,USP13在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮去泛素化酶活性,降低STAT1泛素化水平使胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)STAT1蛋白水平增加,STAT1蛋白能夠形成二聚體入核,并結(jié)合到EMT標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子Slug的啟動子上抑制Slug表達(dá),從而抑制癌細(xì)胞發(fā)生EMT,最終表現(xiàn)為USP13抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、克隆和遷移,此推測尚有待下一步研究證實(shí).

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)USP13能夠抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、克隆和遷移;過表達(dá)USP13不影響STAT1 mRNA水平而上調(diào)STAT1蛋白水平,反之敲低USP13則下調(diào)STAT1蛋白水平;同時(shí),過表達(dá)USP13降低STAT1泛素化水平,敲低USP13卻提高STAT1泛素化水平. 本研究提示USP13在前列腺癌中可以通過調(diào)節(jié)STATI蛋白水平影響前列腺癌生長,可為進(jìn)一步探索USP13在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用以及開發(fā)前列腺癌治療藥物提供新的思路.