蘇云金桿菌G033A對化學農(nóng)藥防治草地貪夜蛾的減量效應

胡 飛，徐婷婷，胡本進，畢思佳，佟 強，徐麗娜*，張 杰

（1. 安徽省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質量安全研究所，合肥 230031；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda是一種源于美洲熱帶、亞熱帶地區(qū)的重大遷飛性害蟲[1]。2019年入侵我國并迅速蔓延至全國26個省/市/自治區(qū)，成為嚴重威脅我國玉米生產(chǎn)的重大害蟲[2]?；瘜W藥劑因具有殺蟲速度快、使用方法簡便等特點，被普遍應用于我國草地貪夜蛾應急防控。尤其是甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（emamectin benzoate，簡稱甲維鹽）和氯蟲苯甲酰胺（chlorantraniliprole）因對草地貪夜蛾具有較高殺蟲活性[3-5]，其單劑和復配劑成為全國各地防治草地貪夜蛾的主打藥劑。

然而，草地貪夜蛾在入侵我國前已經(jīng)歷了漫長的化學防治過程，抗性相關基因檢測發(fā)現(xiàn)，入侵我國的群體對傳統(tǒng)有機磷、有機氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有較高的抗性基因變異頻率，目前雖尚未檢測到對新型酰胺類農(nóng)藥的抗性基因突變位點，但田間種群對氯蟲苯甲酰胺的敏感性也有所下降[6,7]。而波多黎各草地貪夜蛾田間種群已對氯蟲苯甲酰胺產(chǎn)生160倍的高水平抗性，對甲維鹽亦產(chǎn)生低水平抗性[8]。目前，我國對草地貪夜蛾執(zhí)行分區(qū)治理策略，在其周年繁殖區(qū)不斷有蟲源遷入、繁殖，為減少蟲源外遷，玉米的生長周期內往往需多次用藥；遷飛過渡區(qū)和重點防范區(qū)為壓低遷入蟲口基數(shù)、降低危害，應用化學防治也是不可避免的防治手段。而草地貪夜蛾作為一種遷飛性昆蟲，抗性種群的抗性等位基因會持續(xù)存在[9]，大量長期使用某種化學藥劑，使其處于巨大的選擇壓力之下，勢必導致抗性的產(chǎn)生。盡快制訂并實施科學合理的綜合治理和抗性治理策略，延緩抗藥性的產(chǎn)生，是草地貪夜蛾可持續(xù)防控的當務之急[10]。

微生物藥劑與化學藥劑混配使用是近年來減少化學藥劑使用量，緩解抗藥性產(chǎn)生的重要手段。其中，蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是應用范圍最廣、使用量最大、防治最成功的微生物殺蟲劑，它與化學藥劑混用，不僅可以有效防控對氯蟲苯甲酰胺和阿維菌素產(chǎn)生抗性的小菜蛾，而且可以減少化學藥劑的使用量[11]。中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所研制的蘇云金桿菌 G033A對鱗翅目、鞘翅目葉甲科害蟲均具有較高毒力，已由武漢科諾生物科技股份有限公司登記生產(chǎn)。2020年11月獲批擴作登記用于草地貪夜蛾防治，在安徽宣城、河南新鄉(xiāng)、廣西南寧等地進行了春玉米、夏玉米和秋玉米草地貪夜蛾防治田間應用，整體防治效果都達到80%以上[12]。然而與化學藥劑相比，速效性差、用藥量大是蘇云金桿菌不可忽視的缺陷。為了減少化學藥劑使用量、延緩抗藥性的產(chǎn)生，同時進一步提高生物農(nóng)藥利用率，本研究通過室內生測和田間試驗測定了減量 G033A和低劑量化學藥劑混配對草地貪夜蛾的防治效果，以期為生物農(nóng)藥的推廣和應用技術提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

蘇云金桿菌G033A（簡稱G033A）可濕性粉劑（商品名：禁衛(wèi)軍?），由武漢科諾生物科技股份有限公司提供，有效成分含量32000 IU/mg，防治草地貪夜蛾的推薦用藥量150～300 g/667 m2，本次試驗中選用推薦最低劑量的50%作為聯(lián)合試驗中G033A的使用量。5%甲維鹽水分散粒劑（WG），河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司提供；200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑（SC），由美國富美實公司提供；15%甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺懸浮劑（SC），安徽省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質量安全研究所自研。

1.2 供試蟲源

用于室內生物測定的草地貪夜蛾系 2019年采自安徽省黃山市春玉米田，在室內以人工飼料長期飼養(yǎng)的實驗室種群，飼養(yǎng)過程中未接觸任何殺蟲劑。飼養(yǎng)條件為（27±1）℃，光周期14L:10D，相對濕度60%±10%。選擇蟲體一致，健康的3齡初幼蟲進行測試。

1.3 G033A聯(lián)用化學藥劑室內生測

根據(jù)各化學藥劑在草地貪夜蛾或其它鱗翅目害蟲上的推薦使用量，分別設置0.2 g/L、0.3 g/L、0.3 g/L為甲維鹽、氯蟲苯甲酰胺和甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺的參考試驗濃度，并以此為基準設置化學藥劑減量25%、50%和75%共12個藥劑單獨處理。在配制好的化學藥劑溶液中，按照濃度1.5 g/L加入G033A，充分混勻后配制成化學藥劑和G033A混劑共12個處理；并以相同濃度G033A單獨使用為對照（表1）。

表1 室內生物活性測定中蘇云金桿菌G033A與化學藥劑聯(lián)用配方表Table 1 Compound formula of Bacillus thuringiensis G033A and pesticides in bioassay

采用浸葉法進行生物測定，選取展開的幼嫩玉米葉片，剪成1.5 cm×1.5 cm大小，在配制好的不同處理藥液中浸漬10 s，待其自然晾干后放入墊有濕潤濾紙的12孔培養(yǎng)板中，每孔放入4片葉片。然后將饑餓處理6 h的供試幼蟲接入培養(yǎng)板中，每處理12頭，重復6次。

1.4 G033A聯(lián)用化學藥劑對草地貪夜蛾的田間防治試驗

試驗在安徽省農(nóng)業(yè)科學院崗集試驗基地（117o22′ E，30. 96′ N）進行，試驗田塊地勢平坦，土層深厚，中上等肥力，土壤肥力較均等，有機質含量一般，玉米于2020年7月3日播種，每667 m2定植約3500株，株距0.35 m，行距0.5 m，田間肥水管理等條件一致，符合當?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐，面積約4000 m2。選擇草地貪夜蛾發(fā)生嚴重時開展試驗。

試驗共設14個處理（表2列舉13個），每處理4次重復，小區(qū)采用隨機區(qū)組排列，每小區(qū)面積約30 m2，玉米定株120株左右，小區(qū)間設1 m寬保護行，藥劑用量見表2。于2020年8月6日莖葉噴霧施藥1次。田間草地貪夜蛾發(fā)生蟲態(tài)大多為卵～低齡幼蟲期，試驗前未施用任何農(nóng)藥，玉米百株受害率為60%～70%。采用背負式電動噴霧器對準葉心重點噴施，用水量為 50 L/667 m2。

表2 蘇云金桿菌G033A與化學農(nóng)藥聯(lián)用配方表Table 2 Compound furmula of Bacillus thuringiensis G033A and chemical pesticides

1.5 調查方法

室內生物測定，接蟲后每24 h觀察一次幼蟲存活狀態(tài)，連續(xù)觀察3 d，以軟毛筆輕觸蟲體不動判定為死亡。以清水為對照，記錄死亡幼蟲數(shù)量和存活幼蟲數(shù)量，并據(jù)此計算幼蟲校正死亡率。

田間藥效試驗，分別于藥后 5 d、10 d、15 d 各調查一次，每個處理隨機取5點，每點20株玉米，施藥前調查玉米植株上草地貪夜蛾數(shù)量。蟲口減退率和防治效果如下公式，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進行差異顯著性分析。

蟲口減退率（%）＝（施藥前活蟲數(shù)—施藥后活蟲數(shù)）/施藥前活蟲數(shù)×100；防治效果（%）＝（處理區(qū)蟲口減退率—空白對照區(qū)蟲口減退率）/（100—空白對照區(qū)蟲口減退率）×100。

2 結果與分析

2.1 G033A與減量化學藥劑聯(lián)合應用對草地貪夜蛾幼蟲存活的影響

處理后24 h，甲維鹽參考劑量（0.2 g/L）及減量25%、50%和75%單獨使用，草地貪夜蛾3齡幼蟲校正死亡率分別為99.07%、87.04%、85.19%和80.56%；各劑量與G033A聯(lián)合使用，幼蟲校正死亡率分別為100.00%、99.07%、91.67%和87.96%，結果表明：甲維鹽減量與G033A聯(lián)合使用的幼蟲校正死亡率顯著高于其減量單獨使用（P＜0.05）。處理后48 h，甲維鹽參考劑量（0.2 g/L）及減量25%、50%和75%單獨使用，草地貪夜蛾幼蟲的校正死亡率分別為100.00%、94.44%、97.22%和86.11%；各劑量與G033A聯(lián)合使用，幼蟲校正死亡率均為100.00%，甲維鹽減量與G033A聯(lián)合使用的幼蟲校正死亡率均顯著高于其減量單獨使用（P＜0.05）。處理后72 h，甲維鹽各劑量單獨使用及與G033A聯(lián)合使用，幼蟲校正死亡率均為100.00%，處理間差異不顯著（圖1）。

圖1 G033A與不同劑量5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽水分散粒劑聯(lián)合應用對草地貪夜蛾3齡幼蟲的致死率Fig. 1 Effects of G033A combined with different dose of 5% emamectin benzoate WDG on mortality of Spodoptera frugiperda 3rd larvae

處理后24 h，氯蟲苯甲酰胺參考劑量（0.3 g/L）及減量25%、50%和75%單獨使用，草地貪夜蛾幼蟲的校正死亡率分別為20.37%、11.11%、6.48%和1.85%；各劑量與G033A聯(lián)合使用，幼蟲校正死亡率分別為58.33%、25.93%、23.15%和8.33%，氯蟲苯甲酰胺與G033A聯(lián)合使用的幼蟲校正死亡率均顯著高于其單獨使用（P＜0.05）。處理后48 h，氯蟲苯甲酰胺推薦劑量（0.3 g/L）及減量25%、50%和75%單獨使用，草地貪夜蛾幼蟲的校正死亡率分別為70.37%、63.88%、39.81%和30.55%；各劑量與G033A聯(lián)合使用，幼蟲校正死亡率分別為92.59%、76.85%、75.93%和72.22%，氯蟲苯甲酰胺與G033A聯(lián)合使用的幼蟲校正死亡率均顯著高于其單獨使用（P＜0.05）。處理后72 h，氯蟲苯甲酰胺各劑量與G033A聯(lián)合使用，幼蟲校正死亡率均為 100.00%；而其單獨使用時，只有參考劑量處理幼蟲校正死亡率為 100%，其他各減量處理幼蟲校正死亡率均顯著低于相應聯(lián)合用藥（圖2）。

圖2 G033A與不同劑量200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑聯(lián)合應用對草地貪夜蛾3齡幼蟲的致死率Fig. 2 Effects of G033A combined with different doses of 200 g/L chlorantraniliprole SC on mortality of Spodoptera frugiperda 3rd larvae

處理后24 h，甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺參考劑量（0.3 g/L）及減量25%、50%和75%單獨使用，草地貪夜蛾幼蟲的校正死亡率分別為68.52%、66.67%、60.19%和27.78%；各劑量與G033A聯(lián)合使用，幼蟲校正死亡率分別為83.33%、77.78%、63.89%和41.67%，甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺各濃度與G033A聯(lián)合使用的幼蟲校正死亡率均顯著高于其單獨使用。處理后48 h，甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺參考劑量及減量25%、50%和75%單獨使用，幼蟲校正死亡率分別為87.96%、87.96%、73.15%和61.11%；各劑量與G033A聯(lián)合使用，幼蟲校正死亡率分別為100.00%、98.15%、83.33%和71.30%，甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺各濃度與G033A聯(lián)合使用的幼蟲校正死亡率均顯著高于其單獨使用。處理后72 h，甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺與G033A聯(lián)合使用的各處理，幼蟲校正死亡率均為 100.00%，而其單獨使用時，只有參考劑量和減量 25%處理幼蟲校正死亡率為100%，減量50%和75%使用，幼蟲校正死亡率顯著低于與G033A聯(lián)合用藥處理（圖3）。

圖3 G033A與不同劑量15%甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺懸浮劑混配對草地貪夜蛾3齡幼蟲的致死率Fig. 3 Effects of G033A combined with different doses of 15% emamectin benzoate chlorantraniliprole SC on mortality of Spodoptera frugiperda 3rd larvae

濃度為1.5 g/L的G033A單獨處理24、48和72 h后，幼蟲校正死亡率分別為0.00%、38.89%和72.22%，其與本試驗中的三種化學藥劑聯(lián)合使用相同時間后，幼蟲校正死亡率均顯著高于其單獨使用。

2.2 G033A與減量化學藥劑聯(lián)合應用對草地貪夜蛾的田間防治效果

G033A防治草地貪夜蛾最低推薦劑量（150 g/667 m2）單獨施用5 d、10 d和15 d，對草地貪夜蛾的田間防效分別為 35.97%、59.21%和 52.57%。甲維鹽、氯蟲苯甲酰胺和甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺參考劑量（5、15、20 g/667 m2）單獨施用5 d、10 d和15 d，對草地貪夜蛾的田間防效分別為82.18%、71.03%和44.43%；81.02%、83.83%和77.89%；91.16%、87.61%和83.44%。甲維鹽與G033A聯(lián)合使用可以提高甲維鹽的持效性，甲維鹽減量25%、50%和G033A聯(lián)合施用15 d后，對草地貪夜蛾的防效分別為66.77%和70.64%，顯著高于藥劑參考劑量單獨施用的防效，甲維鹽減量75%和G033A聯(lián)合使用后，對草地貪夜蛾的防效仍高于甲維鹽參考劑量單獨施用，只是差異不顯著。氯蟲苯甲酰胺及甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺與G033A聯(lián)合使用，其速效性和持效性均可改善，二種藥劑分別減量25%、50%和G033A聯(lián)合使用5 d和15 d后，對草地貪夜蛾的防效均高于其參考劑量單獨施用，只是差異不顯著（表3）。

表3 G033A與低劑量化學殺蟲劑混配對草地貪夜蛾的防治效果Table 3 Effect of G033A mixed with low dose chemical insecticides on Spodoptera frugiperda

3 討論

蘇云金桿菌因殺蟲效果佳、特異性強、無殘留、對非靶標生物安全等特點成為目前推廣最為廣泛的生物殺蟲劑，蘇云金桿菌 G033A作為我國獲批的第一個轉基因抗蟲工程菌對草地貪夜蛾、黃曲條跳甲等鱗翅目和鞘翅目昆蟲均展現(xiàn)出較高毒力[13]。而且，近年來病原微生物與化學殺蟲劑混配使用成為減少藥劑使用量，緩解抗藥性產(chǎn)生的重要手段，現(xiàn)有研究表明，蘇云金桿菌與茚蟲威、阿維菌素等多種殺蟲劑復配具有增效作用，而且其與其它生物殺蟲劑或化學殺蟲劑混配使用已在實際生產(chǎn)中不斷推廣，表現(xiàn)出防效增加、持效期延長、抗藥性延緩等特點[14-21]。本次試驗通過室內生測和田間試驗全面測定了G033A分別與5%甲維鹽、200g/L氯蟲苯甲酰胺、和15%甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺減量75%、50%和25%及常規(guī)用量聯(lián)合使用對草地貪夜蛾的防治效果，證明不僅草地貪夜蛾的死亡率明顯上升，而且顯著提高了低劑量化學農(nóng)藥的殺蟲速率。田間畝施用G033A（75 g）＋5%甲維鹽（5 g）、G033A（75 g）＋200 g/L氯蟲苯甲酰胺（11.25 g）、G033A（75 g）＋15%甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺（15 g）、G033A（75 g）＋15%甲維鹽·氯蟲苯甲酰胺（10 g）均對草地貪夜蛾具有較好的防治效果?？梢?，G033A與特定化學藥劑聯(lián)用具有協(xié)同增效作用。常以共毒系數(shù)評價混配化學農(nóng)藥的增效作用，然而對于微生物與化學殺蟲劑的混合應用，它們之間可能并不是直接加和，共毒系數(shù)不能如實反映協(xié)同效果[22]。應參考農(nóng)藥共毒系數(shù)評價方法，結合 G033A殺蟲特點，以至少減量50%農(nóng)藥與G033A混用后保持害蟲致死率和明顯縮短LT50為協(xié)同增效指標，測定共毒指數(shù)（CTLT50），以評估協(xié)同增效作用[23]。以此為基礎，進一步開展 G033A與不同藥劑的聯(lián)合應用試驗，明確增效作用，篩選最佳增效配比，以為菌藥復配制劑的開發(fā)提供支持。

G033A克服了蘇云金桿菌殺蟲譜窄的缺陷，然而見效慢、使用量大、對高齡幼蟲活性低等缺點仍然存在。本研究進行的室內試驗以3齡幼蟲為對象，田間防治時蟲源亦多為低齡幼蟲，而實際生產(chǎn)中草地貪夜蛾常以各種齡期幼蟲混合發(fā)生，而且高齡幼蟲因具有暴食性，破壞力更為巨大，針對高齡幼蟲的防治效果有待進一步研究；另外選取的化學藥劑種類有限，后續(xù)還需開展多種藥劑與 G033A聯(lián)合使用，進一步研究 G033A對化學農(nóng)藥防治草地貪夜蛾的減量效應。玉米全生育期伴有多種鱗翅目害蟲混發(fā)，如棉鈴蟲、玉米螟、粘蟲、甜菜夜蛾等，針對G033A與化學農(nóng)藥聯(lián)合使用防治玉米主要害蟲技術還需開展深入研究。