廣雙瘤蚜繭蜂對棉蚜脂質(zhì)合成通路的影響

薛 匯，高雪珂，常國鳳，崔金杰*，陳利珍

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安陽 455000）

棉蚜Aphis gossypiiGlover是一種廣泛分布于世界各國的常見害蟲[1]。棉蚜是刺吸式口器，大量棉蚜若蟲和成蟲集中在棉葉背面和幼莖上吸食寄主植物汁液，造成葉片卷縮畸形，植株矮小，甚至幼苗枯死[2]。此外，棉蚜分泌的蜜露會造成棉花葉片的煤污病，影響光合作用，棉蚜還能傳播多種植物病毒，降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]，嚴(yán)重危害棉花的生產(chǎn)[4]。蚜繭蜂是蚜蟲的寄生性天敵昆蟲的主要類群，可有效控制棉蚜的發(fā)生[5]，其中，廣雙瘤蚜繭蜂是棉花蚜繭蜂的優(yōu)勢種群[6]。

寄生蜂和寄主之間有著復(fù)雜的制約關(guān)系，寄生蜂能夠通過化學(xué)物質(zhì)或者氣味準(zhǔn)確定位寄主位置[7]。寄生形式分為內(nèi)寄生和外寄生兩種，寄生蜂幼蟲取食寄主體表或取食寄主體內(nèi)組織，通常情況下，寄生蜂幼蟲前期主要取食寄主血淋巴，后期直接取食寄主脂肪體[8,9]。幼蟲隨著寄主的生長發(fā)育，并最終導(dǎo)致寄主死亡[10]。動物以脂肪的形式儲存能量的能力是生存和繁殖所必需的[11-13]，絕大多數(shù)的寄生蜂缺乏脂質(zhì)合成的能力[14]。

寄生蜂為滿足自身對脂質(zhì)的需求，對寄主的生理生化進(jìn)行調(diào)節(jié)，如生殖、代謝、生物合成等，會造成寄主體內(nèi)脂質(zhì)大量積累，包括全身脂質(zhì)含量的增加[15]，脂肪體三?；视痛x的增強(qiáng)[8,16]以及血淋巴中游離脂肪酸水平的升高等[8,9]。1974年發(fā)現(xiàn)寄生蜂調(diào)節(jié)寄主脂肪酸組成[17]，2004年報(bào)道寄生蜂體內(nèi)的脂肪酸構(gòu)成高度相似于蚜蟲體內(nèi)的脂肪酸[18]，Visser和 Ellers[19]推斷，寄生蜂缺乏與脂肪酸合成相關(guān)的酶系，通過調(diào)節(jié)寄主脂肪酸合成來完成自身的生物合成代謝。寄生蜂還可以通過調(diào)節(jié)寄主體內(nèi)激素滴度來調(diào)節(jié)寄主的攝食習(xí)慣和生長[7,20]，目前已發(fā)現(xiàn)寄生物能夠引起宿主內(nèi)、外寄生蜂體內(nèi)氨基酸、蛋白質(zhì)、丙酮酸和碳水化合物數(shù)量的變化[21-25]。同時通過破壞蚜蟲的免疫系統(tǒng)和改變蚜蟲的營養(yǎng)流向來達(dá)到改造的目的，使幼蟲更好地發(fā)育[7,26]。

目前廣雙瘤蚜繭蜂對棉蚜脂質(zhì)合成調(diào)控的報(bào)道較少，本試驗(yàn)采用熒光定量PCR技術(shù)，檢測了被寄生3 d棉蚜和未被寄生棉蚜脂肪酸合成通路、甘油酯合成通路、糖酵解以及氨基酸代謝通路中的關(guān)鍵基因，明確被寄生棉蚜脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)變化，對更好地了解廣雙瘤蚜繭蜂影響棉蚜脂質(zhì)合成機(jī)制及棉蚜的生物防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試植株

試驗(yàn)所用的棉花品種為中棉所49，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花種質(zhì)資源中期庫提供，棉花種植于人工氣候室（26±1）℃，光周期14L:10D，RH（75±5）%。

1.2 供試?yán)ハx

所用棉蚜為實(shí)驗(yàn)室繼代飼養(yǎng)的孤雌繁殖的單個種群棉蚜，飼養(yǎng)條件為（26±1）℃，RH（65±5）%，光周期14L:10D。廣雙瘤蚜繭蜂采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗(yàn)農(nóng)場（安陽縣），并于（26±1）℃，RH（65±5）%，光周期14L:10D人工智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)。

1.3 寄生棉蚜的獲取

將2齡若蚜接入含有棉花葉片的培養(yǎng)皿中，然后接入寄生蜂，觀察寄生蜂的寄生行為，寄生蜂寄生棉蚜后立即將被寄生棉蚜轉(zhuǎn)入新鮮棉花葉片上飼養(yǎng)3 d，光照培養(yǎng)箱飼養(yǎng)條件為 （26±1）℃，RH（65±5）%，光周期14L:10D。被寄生3 d的棉蚜進(jìn)行解剖，取出寄生蜂幼蟲，收集被寄生的棉蚜樣品，同時未被寄生的棉蚜也進(jìn)行相同的解剖操作。試驗(yàn)組和對照組各設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)20頭棉蚜。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成

使用 TRIZOL試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）從被寄生的棉蚜和未被寄生的蚜蟲中提取總RNA，操作方法參照廠商說明。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并使用Nano-Drop 2000（Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）檢測RNA的濃度及純度。cDNA的合成利用500 ng上述RNA通過PrimeScriptfi RT Reagent Kit（Takara，Dalian，China）參照試劑盒的步驟進(jìn)行合成。

1.5 實(shí)時熒光定量技術(shù)的基因表達(dá)量驗(yàn)證

實(shí)時熒光定量檢測使用Mastercycler ep realplex（Eppendorf，Hamburg，Germany）進(jìn)行，基因特異性引物利用BEACON DESIGNER 7.6（PREMIER Biosoft International，CA，USA）設(shè)計(jì)并通過上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1，內(nèi)參基因選用二甲基腺苷轉(zhuǎn)移酶dimethyladenosine transferase（GenBank：KM507111）和肽酰-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶peptidyl-prolyl cis-trans isomerase（GenBank：KF018924）[27]，取兩種內(nèi)參基因表達(dá)量的平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢測基因表達(dá)量的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，3 min；95 ℃，5 s和60 ℃，30 s，共40個循環(huán)。

表1 棉蚜脂質(zhì)合成相關(guān)基因及引物序列Table 1 Gene and primer sequence related to lipid synthesis of Aphis gossypii

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對實(shí)時熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法[28]進(jìn)行分析，利用GraphPad Prism 7制作圖表，并利用IBM SPSS Statistics 20采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05被認(rèn)為是差異顯著的?！?”：P＜0.05；“**”：P＜0.01；n.s.：無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 被寄生和未被寄生棉蚜糖酵解基因轉(zhuǎn)錄水平差異比較

在糖酵解途徑中，被寄生棉蚜的1,6-二磷酸果糖醛縮酶基因表達(dá)量上調(diào)了1.7倍，磷酸甘油酸激酶基因表達(dá)量上調(diào)了1.6倍。但蔗糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸的關(guān)鍵限速酶丙酮酸激酶表達(dá)量降低了0.3倍（圖1）。

圖1 棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生后糖酵解通路基因的表達(dá)變化Fig. 1 Changes of glycolysis pathway gene expression of cotton aphid after parasitized by Binodoxys communis

2.2 被寄生和未被寄生棉蚜脂肪酸合成基因轉(zhuǎn)錄水平差異比較

圖2揭示了被寄生棉蚜和未被寄生棉蚜脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)情況。棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生3 d后，除了脂肪酸合成酶1和硬脂酰輔酶A去飽和酶1表達(dá)量沒有顯著差異外，其他基因都顯著上調(diào)。其中乙酰輔酶A羧化酶基因表達(dá)量上調(diào)了6.5倍，三磷酸腺苷（ATP） 檸檬酸裂解酶基因表達(dá)量上調(diào)了2.3倍，脂肪酸合成基因2、3表達(dá)量分別上調(diào)了6.1和3.3倍，硬脂酰輔酶A去飽和酶2表達(dá)量上調(diào)了7.8倍。

圖2 棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生后脂肪酸合成通路基因的表達(dá)變化Fig. 2 Changes of fatty acid synthesis pathway gene expression of cotton aphid after parasitized by Binodoxys communis

2.3 被寄生和未被寄生棉蚜甘油酯合成基因轉(zhuǎn)錄水平差異比較

在三酰甘油合成途徑中，棉蚜被寄生3 d后，被寄生棉蚜體內(nèi)1-酰基-sn-甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量上調(diào)2.8倍、二酰甘油O-?；D(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量上調(diào)3.4倍、甘油三磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量上調(diào)1.7倍、脂滴表面蛋白基因表達(dá)量上調(diào)2.6倍、三酰基甘油脂酶1和2基因表達(dá)量分別上調(diào)1.6和2.5倍（圖3）。

圖3 棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生后甘油酯合成通路基因的表達(dá)變化Fig. 3 Changes of glyceride synthesis pathway gene expression of cotton aphid after parasitized by Binodoxys communis

2.4 被寄生和未被寄生棉蚜氨基酸代謝基因轉(zhuǎn)錄水平差異比較

氨基酸是棉蚜生長發(fā)育所需的氮源[29]，我們對氨基酸轉(zhuǎn)化為檸檬酸，然后到乙酰輔酶A通路中的關(guān)鍵基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示被寄生棉蚜中氨基酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A通路中檸檬酸合酶基因表達(dá)量上調(diào)7.1倍，異檸檬酸脫氫酶基因表達(dá)量上調(diào)9.5倍，線粒體異檸檬酸脫氫酶β亞基基因表達(dá)量上調(diào)5.7倍，線粒體異檸檬酸脫氫酶γ亞基基因表達(dá)量上調(diào)4.1倍，線粒體蘋果酸脫氫酶基因表達(dá)量上調(diào)2.8倍。雖然胞質(zhì)異檸檬酸脫氫酶基因、異檸檬酸脫氫酶α亞基基因、細(xì)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因表達(dá)量在統(tǒng)計(jì)意義上變化不具顯著性，但其表達(dá)量分別上調(diào)了5.5倍、1.6倍和2.2倍（圖4）。

圖4 棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生后氨基酸代謝通路基因的表達(dá)變化Fig. 4 Changes of amino acid metabolism pathway gene expression of cotton aphid after parasitized by Binodoxys communis

3 討論

寄生蜂通常能夠引起宿主體內(nèi)脂質(zhì)含量的變化[16,30]，增加血淋巴中游離的脂肪酸含量，增強(qiáng)脂肪體中三酰甘油的代謝能力[16]。如黑頭柔繭蜂通過對宿主脂肪體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)精細(xì)調(diào)控來滿足自身的營養(yǎng)適應(yīng)性[31]，棉蚜被棉蚜繭蜂寄生后，棉蚜體內(nèi)游離的脂肪酸顯著性增加[32]，粘蟲被粘蟲姬小蜂寄生后，體內(nèi)脂肪含量明顯高于未被寄生的粘蟲[16]。寄生蜂引起寄主體內(nèi)脂肪代謝通路的變化多有報(bào)道，但在廣雙瘤蚜繭蜂對棉蚜脂質(zhì)通路上的調(diào)控作用研究較少，本試驗(yàn)采用熒光定量PCR技術(shù)，明確了被廣雙瘤蚜繭蜂寄生3 d的棉蚜脂質(zhì)合成通路相關(guān)基因的表達(dá)變化，揭示了廣雙瘤蚜繭蜂對棉蚜脂質(zhì)合成通路的調(diào)控。

研究表明，棉蚜繭蜂寄生棉蚜后，被寄生的棉蚜幾乎所有的與甘油酯合成相關(guān)基因的表達(dá)量都明顯升高，其中限速酶二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量上調(diào)了3.2倍，脂滴表面結(jié)合蛋白基因表達(dá)量上調(diào)了5.0倍[27]，同時被棉蚜繭蜂寄生的棉蚜體內(nèi)的甘油酯和甘油磷酯的含量也會增加[33]。與此研究結(jié)果一致，本研究中，棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生3 d后，與甘油三酸酯合成相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)量多數(shù)上調(diào)，限速酶二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶上調(diào)了3.4倍，脂滴表面結(jié)合蛋白基因表達(dá)量上調(diào)了2.6倍。其中，脂滴能夠儲存膽固醇和脂酰甘油，是膜形成和維持的重要物質(zhì)，而且能主動參與脂肪和能量代謝[7]。脂滴表面蛋白基因可以調(diào)節(jié)脂解，促進(jìn)或者抑制脂解[34]。結(jié)果表明廣雙瘤蚜繭蜂能夠激活棉蚜甘油酯合成通路，促進(jìn)被寄生棉蚜中甘油酯的合成。

蔗糖是棉蚜生長發(fā)育所需的碳源，蔗糖在昆蟲體內(nèi)的代謝途徑已比較明確，主要是通過糖酵解過程將蔗糖分解成葡萄糖和果糖參與到脂質(zhì)合成中來。蔗糖被分解成葡萄糖和果糖，然后轉(zhuǎn)換成果糖-1,6-二磷酸，果糖-1,6-二磷酸被分解成磷酸二羥丙酮（DHAP）和甘油醛-3-磷酸（GAP），DHAP和GAP有兩種代謝途徑，一種途徑中DHAP和GAP被轉(zhuǎn)化成三酰甘油，另一種途徑就是DHAP和GAP被代謝為丙酮酸，丙酮酸能夠轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A是合成脂肪酸的前提[35]。Gao等[36]在2020年的研究中指出，被棉蚜繭蜂寄生后的棉蚜糖酵解通路中關(guān)鍵基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶表達(dá)量顯著上調(diào)。本研究中，被廣雙瘤蚜繭蜂寄生3 d后的棉蚜體內(nèi)1,6-二磷酸果糖醛縮酶基因表達(dá)量上調(diào)了1.7倍，磷酸甘油酸激酶基因表達(dá)量上調(diào)了1.6倍。但丙酮酸激酶表達(dá)量降低了，雖然沒達(dá)到顯著水平，丙酮酸激酶是蔗糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸的關(guān)鍵限速酶，丙酮酸能夠轉(zhuǎn)化為合成脂肪酸的原料——乙酰輔酶A。我們推測雖然糖酵解途徑產(chǎn)生丙酮酸的能力減弱了，合成脂肪酸的C骨架可能來自游離的氨基酸。同時我們對氨基酸轉(zhuǎn)化為檸檬酸然后到乙酰輔酶A途徑中的相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示被寄生棉蚜中氨基酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A通路中的基因表達(dá)量顯著上調(diào)，也暗示在被寄生棉蚜中氨基酸可能被用于作為合成脂肪酸的原料。

脂肪酸是能量的主要來源，也是細(xì)胞膜的重要組成部分[37]。Gao等[32]通過檢測被棉蚜繭蜂寄生后棉蚜的脂肪酸合成通路基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A羧化酶基因表達(dá)量上調(diào)了5.0倍，脂肪酸合成基因1和3分別上調(diào)6.9倍和4.1倍。本研究中，棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生3 d后，幾乎所有與脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)量都顯著上調(diào)。寄生蜂由于缺乏與脂肪酸合成相關(guān)的酶系統(tǒng)，調(diào)控寄主脂肪酸合成通路來完成自身生長發(fā)育的需要[38]。

長期以來，寄生蜂和寄主的互作關(guān)系一直是研究的熱點(diǎn)。棉蚜是重要的農(nóng)業(yè)害蟲，不僅為害棉花，對一些園藝作物的為害也日益加重，而蚜繭蜂作為棉蚜主要寄生蜂種類，具有較好的生防價(jià)值。本研究就廣雙瘤蚜繭蜂寄生棉蚜后，對棉蚜脂質(zhì)合成通路中的脂肪酸合成途徑、氨基酸代謝途徑、甘油酸三酯合成途徑以及糖酵解途徑的影響做了初步研究，明確了被寄生棉蚜脂質(zhì)合成通路相關(guān)基因的表達(dá)變化，對于揭示廣雙瘤蚜繭蜂與棉蚜之間的互作以及寄生蜂與寄主昆蟲的協(xié)同進(jìn)化有重要意義，同時對開發(fā)新型棉蚜防控技術(shù)具有重要的理論實(shí)踐價(jià)值。