北蒼術根區(qū)土壤中AM真菌多樣性及其與土壤養(yǎng)分相關性分析

李銘杰，周志杰，邢禮軍，尹 鑫，武鳳霞，劉建斌，鄒國元*，張毅功，張淑彬*

（1. 河北農業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，保定 071001；2. 北京市農林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所， 北京 100097；3. 河北承德市農林科學院藥用植物研究所，承德 067000）

蒼術為菊科蒼術屬多年生草本藥用植物，以干燥的根莖入藥，是我國中醫(yī)藥大宗藥材之一[1]，有茅蒼術Atractylodes lancea(Thunb.) DC.和北蒼術Atractylodes Chinensis（DC.）Koidz兩種，北蒼術主要分布于河北、內蒙古、黑龍江、山西、陜西、寧夏等省。近年來，野生北蒼術被過度采挖導致資源日益枯竭[2]，為滿足市場需求，人工栽培規(guī)模逐年增多，但由于種植不規(guī)范，造成其產量、藥用成分含量不能達到理想效果，且病蟲害問題頻發(fā)。

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）真菌是陸地土壤中一類重要土壤有益真菌[3]，廣泛存在各類生態(tài)系統(tǒng)中，如高原、平原、農田、沙漠、濕地、重金屬污染區(qū)、鹽堿地等。但不同生態(tài)系統(tǒng)中AM真菌優(yōu)勢群落組合存在差異，這些組合差異是宿主植物和生境環(huán)境共同作用的結果，也是其幫助植物適應不同生態(tài)系統(tǒng)的前提[4]，如改善植物營養(yǎng)狀況[5]，增強宿主植物的抗旱性、抗鹽漬性、抗病性[6-8]等。同時 AM真菌具有生態(tài)專性共生特性，不同植物對AM真菌有不同程度的菌根依賴性[9]，而且隨真菌-植物組合而變化[10]。因此，研究宿主植物根區(qū)土壤AM真菌群落多樣性和結構組成，對理解植物根區(qū)土壤微生態(tài)環(huán)境、結構與生態(tài)功能具有重要意義。

AM真菌豐富的寄主和生境多樣性充分證明它們對不同生境類型的適應性[11]。國內學者基于AM真菌孢子形態(tài)鑒定和高通量測序，研究藥用植物根區(qū)AM真菌物種多樣性，發(fā)現藥用植物AM真菌種質資源豐富。姜攀等[12]調查顯示漳州地區(qū)20種常見藥用植物根區(qū)有49種AM真菌資源，其中球囊霉屬Glomusspp.是該地區(qū)的優(yōu)勢菌屬。蘇洋等[13]根據孢子的主要形態(tài)特征研究發(fā)現紫背天葵Begonia fimbristipulaHance根區(qū)土壤中AM真菌有26種，其中球囊霉屬和無梗囊霉屬Acaulosporaspp.為優(yōu)勢菌群。黃文麗[14]從全國20個采樣點丹參Salvia miltiorrhizaBge土壤樣品中檢測到2屬27種AM真菌，球囊霉屬16種，無梗囊屬11種，這兩屬是丹參根系土壤中AM真菌優(yōu)勢種群。曹敏等[15]采用高通量測序技術分析發(fā)現重慶地區(qū)茅蒼術根際土壤AM有球囊菌門3綱4目8科9屬，其中球囊霉屬相對豐度最高，達到67%?？梢娫诓煌幱弥参锔H土壤中AM真菌物種資源不僅豐富，而且其優(yōu)勢AM真菌物種也存在差異。

本研究采用高通量測序技術，分析了河北承德道地產區(qū)藥材北蒼術野生與栽培土壤AM真菌多樣性和豐度，了解該地區(qū)北蒼術根區(qū)土壤AM真菌群落結構，旨在揭示野生與栽培北蒼術根區(qū)AM真菌多樣性及優(yōu)勢菌群差異，有助于篩選優(yōu)勢土著AM真菌，為AM真菌在北蒼術仿野生人工栽培的應用提供了重要的科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年 7月，在河北省北蒼術道地產區(qū)承德寬城人工栽培基地（40°35′52.4″ N，118°30′54.2″ E）選取栽培一年、兩年、三年的北蒼術，在野生北蒼術分布密集的承德隆化（40°58′26.5″ N，118°02′37.3″ E）分別采集栽培和野生北蒼術根區(qū)土壤和根系樣品，樣品編號為栽培一年 N1、栽培兩年 N2、栽培三年 N3、野生北蒼術N4。在選取的采樣區(qū)內隨機設置3個采樣點，每個采樣點隨機選取3株北蒼術，去掉地表雜草、大塊砂石等雜物，用酒精消毒過的干凈鐵鍬沿著北蒼術植物周圍往下挖，盡量將整株植物根系挖出，連根帶土放入塑料袋中并抖落根系粘附的土壤，將3株北蒼術根區(qū)土全部混合均勻后取出約1 kg放入封口袋中，將3株植物根系放入另一封口袋中，帶回實驗室處理。土壤混勻后，取一部分土樣于-20 ℃冰箱保存，用于測定AM真菌多樣性，剩余土壤置于室溫通風處風干，用于測定土壤理化性質。同時挑出并收集新鮮的北蒼術須根系，用清水沖洗干凈，剪成1～2 cm根段，放入FAA固定液（甲醛:冰醋酸:50%乙醇=13:5:20）中固定，用于測定與觀察AM真菌侵染狀況。

1.2 土壤養(yǎng)分狀況分析

參考《土壤農化分析》[16]測定土壤的養(yǎng)分，其中土壤pH值用雷磁PHS-3C型pH計測定，堿解氮采用堿解-擴散法測定，速效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定，速效鉀采用乙酸銨-火焰光度計法測定，有機質采用重鉻酸鉀法測定，微量元素采用微波消煮-ICP-MS（電感耦合等離子體質譜）法測定。

1.3 北蒼術根系中AM真菌侵染測定與觀察

取出固定后的北蒼術須根系，清水沖洗干凈，控干水分，采用墨水醋染色法[17]對根系樣品進行染色并測定AM真菌侵染率。從染色后的北蒼術根段中，隨機挑選30個根段，制片并鏡檢。根據根段中菌根侵染強度分級標準和叢枝豐度分級標準對每條根段進行分級[18,19]，把每條根段的分級輸入“MYCOCALC”軟件，計算菌根侵染參數侵染頻度F、侵染強度M和叢枝豐度A。侵染頻度F（%）＝（侵染根段數/鏡檢總根段數）×100；侵染強度 M(%)＝（0.95×n5＋0.7×n4＋0.30×n3＋0.05×n2＋0.01×n1）/鏡檢總根段數×100，其中0.95、0.7、0.3、0.05和0.01分別代表各級所占的權重，n5、n4、n3、n2、n1分別代表各級根段數之和；叢枝豐度A（%）＝（0.1×mA1＋0.5×mA2＋1×mA3）×M。其中0.1、0.5和1分別代表各級所占的權重，mA1、mA2和mA3分別是A1、A2和A3各級根段對應的侵染根段菌根侵染強度，如mA3＝（0.95n5A3＋0.7n4A3＋0.3n3A3＋0.05n2A3＋0.01n1A3）/侵染根段數×100/m，m＝M×鏡檢總根段數/侵染根段數，mA2和mA1同上，A3、A2和A1分別代表各級根段數之和。

1.4 土壤總DNA提取及PCR擴增

采用土壤DNA提取試劑盒（FastDNA? Spin Kit for Soil）提取總DNA。運用巢式PCR擴增方法，選取AM真菌特異性引物AML1和AML2[20]為第一對引物，以及AMV4.5NF和AMDGR[21]為第二對引物擴增18S rDNA 基因部分片段。PCR 擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收PCR產物，利用Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.5 數據統(tǒng)計與分析

使用FLASH、Fastp軟件對原始序列進行數據去雜和質量過濾。數據處理和分析采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-sanger云平臺提供的數據處理軟件完成?；赨search（7.0）軟件平臺對得到高質量序列，按照97%相似度對操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）進行聚類，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU序列進行分類學分析，使用BLAST比對maarjam/AM分類學數據庫?；?OTU 聚類和注釋的結果，在美吉云平臺中分析并繪制稀釋性曲線、Venn圖和群落組成分析圖，進行Alpha（α）多樣性指數的計算以及采用典范對應分析（CCA）進行土壤理化性質與AM真菌群落結構的相關性分析。其他數據分析和作圖利用SPSS 22.0和Microsoft Excel 2016軟件完成。

2 結果與分析

2.1 北蒼術根區(qū)土壤養(yǎng)分狀況

從河北承德北蒼術的根區(qū)土壤有效磷水平可見，栽培3年北蒼術土壤有效磷含量最高，野生及栽培一年土壤中磷含量最低。野生北蒼術根區(qū)土壤有效鉀含量最高。野生北蒼術的土壤有機質含量最高，且顯著高于栽培北蒼術根區(qū)土壤。北蒼術根區(qū)土壤堿解氮含量野生與不同栽培年間無差異（表1）。

表1 栽培與野生北蒼術根區(qū)土壤大量元素含量Table 1 The content of macroelements in root-zone soil from cultivated and wild A. chinensis

由表2可知，野生北蒼術根區(qū)土壤鐵、銅含量與不同栽培時間的北蒼術間無顯著差異，錳含量顯著高于栽培二、三年北蒼術，但低于栽培一年北蒼術，鋅含量顯著低于各個栽培時間的北蒼術，硼含量均高于栽培北蒼術，但與栽培三年的北蒼術無顯著差異。

表2 栽培與野生北蒼術根區(qū)土壤微量元素含量Table 2 The content of trace elements in root-zone soil from cultivated and wild A. chinensis

2.2 北蒼術根系AM真菌侵染狀況

由表3可知，北蒼術根系均可觀測到AM真菌的侵染，侵染頻度為100%，但野生和栽培北蒼術根系中AM真菌形成菌根侵染強度（M%）和叢枝豐度（A%）之間存在顯著差異。野生北蒼術根系菌根侵染強度和叢枝豐度顯著高于人工栽培北蒼術，分別是栽培三年北蒼術的7倍和22.6倍。

表3 栽培與野生北蒼術根系菌根侵染狀況Table 3 Infection of AM fungi in the root of cultivated and wild A. chinensis

2.3 北蒼術根區(qū)土壤AM真菌群落OTU序列統(tǒng)計分析

由表4可知，各采樣點北蒼術土壤獲得有效序列數均在10萬條以上，以栽培三年北蒼術（N3）根區(qū)土壤測得的有效序列數最多為73386條。各采樣點土壤樣品的有效序列百分比均在97%以上，平均序列長度在214～217 bp。

表4 栽培與野生北蒼術根區(qū)土壤樣品測序數據結果Table 4 Results of sequencing data of the soil samples from cultivated and wild A. chinensis

Shannon指數稀釋曲線可以直接反映所抽取的優(yōu)化測序深度合理性，并直接反映樣品中物種的多樣性信息。由圖1可知，各供試樣品的稀釋曲線已趨于平滑，表明樣品測序數據量足夠大，測得的數據合理，可以充分反映采集土壤中絕大多數AM真菌群落的真實情況。采樣點土樣的Shannon指數野生北蒼術大于栽培，各供試樣點AM真菌群落多樣性由高到低依次為樣品 N4、N3、N2、N1。

圖1 栽培與野生北蒼術根區(qū)土壤OTU水平下AM真菌群落Shannon指數稀釋曲線Fig. 1 Shannon index of AM fungi community in root-zone soil from cultivated and wild A. chinensis on OTU level

2.4 北蒼術根區(qū)土壤中AM真菌群落多樣性

由表5可知，各個供試樣點土壤中AM真菌群落覆蓋率均為1，說明本次檢測結果能代表樣本中AM真菌的多樣性。多樣性指標包括Shannon指數、豐度指數Sobs、均勻度指數Simpsoneven，能夠反映樣品中物種的豐度。野生北蒼術根區(qū)土壤 AM真菌多樣性（Shannon）顯著高于栽培北蒼術；豐度指數（Sobs）野生北蒼術與栽培二、三年北蒼術之間差異不顯著，且隨著栽培年限的增加，Sobs指數隨之增加；各供試樣點均勻度指數（Simpsoneven）無顯著差異。

表5 栽培與野生北蒼術根區(qū)土壤AM真菌群落多樣性指數Table 5 Diversity of AM fungi community in root-zone soil from cultivated and wild A. chinensis

2.5 北蒼術根區(qū)土壤AM真菌群落維恩（Venn）圖分析

Venn圖可以直觀地體現野生和栽培北蒼術根區(qū)土壤中AM真菌群落OTU組成的差異及共有物種的情況。在N1、N2、N3、N4樣品中，分別有62、122、110 和 500條OTU，而且每種樣品中都有其獨有的OTU。栽培一年的北蒼術根區(qū)土壤中特異性AM真菌群落OTU占總OTU序列數的2.4%（15）、二年生特異性AM真菌群落OTU占2.7%，三年生特異性AM真菌群落OTU占5.7%，野生北蒼術中特異性AM真菌群落OTU占69.9%。栽培一年與野生北蒼術根區(qū)土壤中AM真菌群落共有的OTU數量為11（2.0%），二年生與野生北蒼術共有的OTU數量為44（7.6%），三年生與野生北蒼術共有的OTU數量為33（5.7%），N1、N2、N3和N4共有的為2（0.32%），說明不同樣品中含有相同物種的比率較?。▓D2）。

圖2 北蒼術根區(qū)土壤AM真菌群落OTU維恩圖Fig. 2 Venns of AM fungi community in root-zone soil from cultivated and wild A. chinensis on OTU level

2.6 北蒼術根區(qū)土壤AM真菌群落結構組成

群落結構組成結果表明，樣本中檢測到的 OTU分屬于球囊菌門 Glomeromycota球囊菌綱Glomeromycete的5目6科8屬。在科、屬分類水平上AM真菌群落組成及相對豐度如圖3所示，其中野生北蒼術（N4）根區(qū)土壤中AM真菌物種球囊霉科Glomeraceae球囊霉屬Glomusspp.（77.20%）為優(yōu)勢菌群；栽培北蒼術根圍土壤中AM真菌物種巨孢囊霉科Gigasporaceae巨孢囊霉屬Gigasporaspp.（34.48%～47.20%）、球囊霉科球囊霉屬（30.05%～53.70%）為優(yōu)勢菌群?？梢娨吧鄙n術根區(qū)土壤中AM真菌群落組成與栽培北蒼術根圍土壤有明顯差異。

圖3 北蒼術根區(qū)土壤中AM真菌科（A）和屬（B）分類水平上群落組成相對豐度Fig. 3 Percent of AM fungi community abundance in root-zone soil from cultivated and wild A. chinensis on family (A) and genus (B) level

2.7 土壤養(yǎng)分與AM真菌多樣性相關分析

典范對應分析（canonical correspondence analysis，CCA）土壤養(yǎng)分pH、有機質（C）、堿解氮（N）、有效鉀（K）、有效磷（P）與AM真菌之間的相關性可知，土壤養(yǎng)分因子中有機質和有效磷對承德北蒼術根圍土壤中AM真菌群落多樣性影響較大。有機質、有效磷、pH、有效鉀與AM真菌多樣性指數（Shannon）和均勻度指數（Simpsoneven）呈正相關，而堿解氮與之呈負相關；有機質、pH和有效鉀與豐度指數（Sobs）呈正相關，而有效磷和堿解氮呈負相關。

通過CCA分析土壤微量元素與 AM真菌群落多樣性間的相關性可知，微量元素錳、硼對北蒼術AM真菌群落多樣性影響較大，且微量元素硼與AM真菌多樣性指數（Shannon）、均勻度指數（Simpsoneven）和豐度指數（Sobs）均呈正相關，而鐵、銅、錳、鋅與之呈負相關。另外，由圖4可知，橫坐標軸從左至右表示微生物群落的Shannon指數和Sobs 指數逐漸增加，表明野生北蒼術的AM真菌群落多樣性、豐度均大于栽培北蒼術（樣品N4＞N3＞N2＞N1）。

圖4 土壤大量元素（A）、微量元素（B）與AM真菌多樣性指數的相關性分析Fig. 4 Correlation analysis between the diversity index of AM fungi and soil macroelements (A) and trace elements (B) on OTU level

3 討論

3.1 野生與栽培北蒼術AM真菌菌根侵染差異

陸地上絕大多數植物都能與AM真菌形成菌根共生體，藥用植物就是其中一大類[22]。菌根侵染率尤其侵染強度的高低在一定程度上決定著其功能強弱[23]，進而影響植物對AM真菌的依賴性。吳志剛等首次報道了蒼術對AM真菌的依賴性能達到245%[24]，并且接種AM真菌G. mosseae顯著促進了蒼術的營養(yǎng)生長，提高了蒼術產量。本研究結果表明，北蒼術道地產區(qū)河北承德栽培與野生北蒼術根系均有AM真菌侵染，但野生北蒼術菌根侵染強度和叢枝豐度顯著高于栽培北蒼術。野生藥材是人們一直青睞的藥品，而且價格遠遠高于栽培藥材。現已有大量的研究證明，接種AM真菌可以有效提高藥用植物活性成分含量[25,26]，提高其藥效。因此，本研究中野生北蒼術的高侵染強度能說明在北蒼術藥材原生境中AM真菌對藥材藥效的形成起著很重要的作用。

3.2 野生與栽培北蒼術根區(qū)土壤中AM真菌群落組成

本研究采用高通量測序技術，檢測并分析河北承德北蒼術根區(qū)土壤AM真菌群落多樣性和豐度。結果顯示，野生北蒼術根區(qū)土壤中 AM真菌群落多樣性最大，其獨有的 AM真菌物種種類也隨之豐富，在屬水平上 AM 真菌群落結構逐漸呈現單一化，其中球囊霉屬的豐度最大（77.20%），為優(yōu)勢種屬；栽培北蒼術隨著生長年限的增加，球囊霉屬在AM真菌群落中的豐度也逐漸增大，說明AM真菌球囊霉屬與該北蒼術產區(qū)具有極強的親和性，是栽培產區(qū)自然選擇的土著優(yōu)勢菌群。AM真菌多孢囊霉屬和無梗囊霉屬僅出現在栽培一年北蒼術和栽培二年北蒼術根區(qū)土壤中，栽培三年和野生北蒼術的根區(qū)土壤中則沒有該屬，表明隨著栽培年限的延長，盾巨孢囊霉屬、多孢囊霉屬和無梗囊霉屬慢慢淘汰至消失在該類生境中，AM真菌球囊霉屬成為優(yōu)勢種屬。表明AM真菌對環(huán)境的適應以及植物對AM真菌的適應都具有一定選擇性，因此篩選道地產區(qū)野生北蒼術生長環(huán)境中土著專性優(yōu)勢AM真菌對于人工栽培北蒼術具有重要意義。

3.3 土壤養(yǎng)分因子與北蒼術根區(qū)土壤中AM真菌物種多樣性的關系

道地產區(qū)藥材是指在特定的自然環(huán)境和藥材品種長時間互作下產生的優(yōu)質中藥材，本研究中北蒼術為河北承德道地藥材。研究發(fā)現，土壤中礦質元素組成、含量、存在形態(tài)不僅會引起道地藥材形態(tài)和品質改變，還會影響中藥材的產量[27]。AM真菌存在于植物根系及土壤中，其生存環(huán)境與土壤密切相關，土壤理化性質等非生物因素對AM真菌群落結構組成具有重要影響[28]。已有研究表明土壤有機質、磷、鉀等含量都會對AM真菌的群落多樣性、結構組成和功能產生直接影響[29]，同樣AM真菌的多樣性和豐度也受到宿主植物的直接影響[30,31]。

本研究中野生北蒼術根區(qū)AM真菌的多樣性指數、豐度指數、均勻度指數均高于人工栽培北蒼術，而且土壤pH、有機質、有效鉀與AM真菌多樣性和均勻度指數呈正相關，而堿解氮與之呈負相關；其中土壤有機質對AM真菌多樣性和豐度影響最大，是主要影響因子。已有研究表明，土壤有機質在礦化和腐殖化過程中，釋放出的能量可以提高AM真菌對植物的侵染能力，有機質含量的增加可以促進AM真菌分枝[32]，提高AM真菌的生物活性，但這種促進作用是有一定范圍限制的[33]，即在一定的含量區(qū)間內，土壤中有機質含量越豐富，AM真菌的多樣性越豐富。本研究中野生北蒼術根區(qū)土壤中有機質含量顯著高于栽培北蒼術，因此野生北蒼術根區(qū)土壤群落AM真菌的多樣性更豐富，同時AM真菌侵染狀況顯著優(yōu)于栽培北蒼術根系。

土壤中微量元素不僅影響道地藥材根系營養(yǎng)及生理代謝活動，還影響道地藥材次生代謝產物的合成和積累，一些道地藥材只有生長在富含某些特征微量元素的土壤中，其質量和療效才能達到道地藥材的標準[34]，本研究中野生北蒼術根區(qū)土壤硼含量顯著高于栽培北蒼術，且微量元素硼與AM真菌多樣性指數、均勻度指數、豐富度指數均呈正相關，而鐵、銅、錳、鋅與之呈負相關，說明微量元素硼可能是河北承德道地藥材北蒼術促進AM真菌群落建立的關鍵微量元素。

綜上所述，本研究發(fā)現野生與栽培北蒼術菌根侵染強度存在顯著差異，而且野生根區(qū)土壤中AM真菌物種較栽培更為豐富，且球囊霉屬是野生北蒼術根區(qū)土壤中優(yōu)勢菌群。野生和栽培北蒼術根區(qū)土壤養(yǎng)分的差異可能是導致AM真菌群落多樣性差異的原因之一，而且土壤有機質含量是導致該差異的主要因子，硼是促進道地產區(qū)AM真菌群落多樣性和豐度的微量元素。這對于篩選北蒼術優(yōu)勢土著AM真菌，深入研究土壤因子- AM真菌-中藥材品質間的關系，探索AM真菌在北蒼術仿野生人工栽培的應用，提高其道地功效，提供了重要的科學依據。