蘇 游，劉新月，劉巧梅

(廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院婦科,廣西 南寧530201)

卵巢癌是臨床上一種較為常見的婦科腫瘤疾病，相關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，全球卵巢癌發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤第三位，且每年病死人數(shù)高達(dá)十多萬，病死率持續(xù)上升[1]。超過90%的患者確診時(shí)已處于卵巢癌Ⅲ-Ⅳ期，此時(shí)臨床治療多以手術(shù)切除和放化療為主。紫杉醇作為一線化療藥物在卵巢癌治療中應(yīng)用廣泛，然而大部分患者病情復(fù)發(fā)會(huì)對(duì)紫杉醇產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致療效不佳，嚴(yán)重危險(xiǎn)患者生存[2-3]。因此，逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥，深入探討卵巢癌的調(diào)控機(jī)制，對(duì)靶向治療具有重要意義。自噬基因Beclin1屬于肌動(dòng)蛋白類Bcl-2相關(guān)蛋白，位于人染色體17q21[4-5]。Beclin1基因在自噬活性及相關(guān)信號(hào)通路中，參與調(diào)控了多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，其過表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、凋亡，抑制腫瘤的增殖、侵襲和遷移[5]。有研究[6-7]證實(shí)，Beclin1可與相關(guān)分子形成不同螯合物，包括Beclin1-UVRAG-PI3K、Beclin1-UVRAG-Rubicon-PI3K、Beclin1-Atg14-PI3K，說明Beclin1基因介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬與EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路密切相關(guān)。因此，本文將探究自噬基因Beclin1過表達(dá)在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響，并分析其與紫杉醇耐藥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV3/TXA購自中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞于含10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)完全培養(yǎng)，并在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自Gibco公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取SKOV3/TXA(5×105)接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長覆蓋孔底板面積的80%時(shí)，根據(jù)說明書操作步驟，通過Lipofectamine 2000(美國，Invivogen)將pcDNA3.1-Beclin1及pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至SKOV3/TXA細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h 后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至RPMI 1640 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。構(gòu)建Beclin1基因表達(dá)載體pcDNA3.1/Beclin1。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Beclin1和pcDNA3.1后的細(xì)胞分別作為Beclin1-SKOV3/TXA組和pcDNA3.1-SKOV3/TXA組。同時(shí)，未轉(zhuǎn)染的SKOV3/TXA細(xì)胞作為空白對(duì)照組。

1.3 MTT檢測(cè)Beclin1過表達(dá)對(duì)SKOV3/TXA細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)所用MTT試劑盒、0.25% 胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)等試劑均購自北京碧云天生物有限公司。收集各組對(duì)數(shù)生長期SKOV3/TXA細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×105個(gè)/ml，接種于96孔板中(每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)復(fù)孔)，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h。然后，應(yīng)用MTT細(xì)胞增殖試劑盒測(cè)定1～3 d的增殖情況，具體步驟如下：每個(gè)孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h后停止培養(yǎng)，取上清液溶于150 μl二甲基亞砜(震蕩5～10 min)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定(490 nm處)光密度(OD)值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及自噬情況 培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，用70%乙醇固定。待細(xì)胞在PBS中懸浮30 min后，室溫下再加入 RNase A處理30 min。然后，將加碘化丙錠(PI)加入細(xì)胞液中，終濃度為20 mg/L。避光染色30 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。同時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法，采用Monodansylcadaverine (MDC)標(biāo)記自噬囊泡：細(xì)胞接種于6孔板中，加入0.05 mmol/L MDC(Sigma,St.Louis,MO)；然后，37 ℃溫育1 h，加入4%多聚甲醛進(jìn)行固定(15 min)；PBS 洗3次，采用熒光顯微鏡觀察 MDC 標(biāo)記的自噬囊泡。MDC標(biāo)記染色后，再經(jīng)胰酶消化制備單細(xì)胞懸液，再用4% 多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.5 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Beclin1 mRNA水平 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行RT-PCR測(cè)定，利用Trizol(Trizol試劑盒購買于北京碧云天生物技術(shù)研究所)提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度后，采用cDNA Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行RT-PCR(設(shè)備Light Cycler@480，Roche公司)測(cè)定Beclin1 mRNA水平，引物由大連寶生物工程有限公司提供，序列見表1。反應(yīng)條件如下：94 ℃變性2 min，94 ℃ 20 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s；循環(huán)45次。采用2-ΔΔCT計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.6 免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)各組細(xì)胞Beclin1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞用PBS沖洗，加入含蛋白酶和堿性磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液。4 ℃孵育30 min，收集細(xì)胞裂解液，10000 r/min離心10 min取上清。采用BCA試劑盒(北京碧云天公司)測(cè)定上清液蛋白含量后定量處理后，加入5×上樣染料沸水浴10 min。取15 μl樣品上樣進(jìn)行10%SDS-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-聚丙烯酰胺試劑盒，北京碧云天公司)跑膠分離蛋白，電濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。再分別加入TBST稀釋的Beclin1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH抗體(美國Abcam公司)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3～5次后，加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育，TBST洗膜ECL化學(xué)發(fā)光顯影，獲得條帶分析蛋白含量。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Beclin1過表達(dá)后紫杉醇對(duì)SKOV3/TXA細(xì)胞凋亡的影響 SKOV3/TXA細(xì)胞根據(jù)1.2分組后培養(yǎng)24 h。加入不同質(zhì)量濃度的紫杉醇(0、500、1000、1500、2000及2500 ng/ml)預(yù)處理；于6孔板中培養(yǎng)72 h后 采用胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌。然后，參照1.4步驟采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 各組SKOV3/TXA細(xì)胞Beclin1表達(dá)量比較 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，pcDNA3.1-Beclin1SKOV3/TXA細(xì)胞中Beclin1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組(均P<0.05，圖1A)，說明pcDNA3.1-Beclin1轉(zhuǎn)染成功，Beclin1過表達(dá)。同時(shí)，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Beclin1-SKOV3/TXA組Beclin1蛋白表達(dá)量也顯著高于pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，圖1B)。

注：與SKOV3/TXA組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1-SKOV3/TXA組比較，#P<0.05

2.2 Beclin1過表達(dá)對(duì)SKOV3/TXA細(xì)胞增殖及凋亡影響 培養(yǎng)24、48、72 h后，各組細(xì)胞OD值隨時(shí)間延長也明顯上升。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Beclin后，Beclin1-SKOV3/TXA組細(xì)胞增殖能力較pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組均顯著降低(均P<0.05)；且凋亡率也明顯升高(均P<0.05)，見表2(圖2)。

表2 Beclin1過表達(dá)對(duì)SKOV3/TXA細(xì)胞增殖及凋亡影響

注：與SKOV3/TXA組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1-SKOV3/TXA組比較，#P<0.05

2.3 Beclin1過表達(dá)對(duì)SKOV3/TXA細(xì)胞增殖及凋亡影響 流式檢測(cè)結(jié)果(圖3)，Beclin1-SKOV3/TXA組MDC 標(biāo)記的自噬囊泡平均熒光強(qiáng)度為(2.36±0.67)，pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組MDC 標(biāo)記的自噬囊泡平均熒光強(qiáng)度分別為(0.95±0.15)和(1.01±0.23)，提示Beclin1過表達(dá)可誘導(dǎo)SKOV3/TXA細(xì)胞自噬增加。

2.4 Beclin1過表達(dá)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響 Western blot測(cè)定各蛋白結(jié)果(圖4)，Beclin1-SKOV3/TXA組細(xì)胞p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT蛋白水平相對(duì)比值顯著低于pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組(均P<0.05)，其結(jié)果表明磷酸化水平降低。

注：與SKOV3/TXA組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1-SKOV3/TXA組比較，#P<0.05

注：與SKOV3/TXA組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1-SKOV3/TXA組比較，#P<0.05

2.5 Beclin1過表達(dá)對(duì)SKOV3/TXA細(xì)胞紫杉醇耐藥的影響 不同濃度紫杉醇作用下，Beclin1-SKOV3/TXA組細(xì)胞凋亡率均高于pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組，其中紫杉醇濃度為2000～2500 ng/ml，凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖5)。

注：與SKOV3/TXA組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1-SKOV3/TXA組比較，#P<0.05

3 討 論

卵巢癌是婦科癌癥中常見的腫瘤惡性程度最高的疾病，早期病情隱匿，無特殊臨床癥狀，大數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，處于癌晚期，5年生存率不超過30%。紫杉醇作為腫瘤化療的一線藥物，在卵巢癌臨床治療中應(yīng)用較為廣泛，然而長期使用易產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象[2-3,8]。因此，探究卵巢癌紫杉醇耐藥機(jī)制，提高紫杉醇化療療效具有重要意義。

自噬基因Beclin1作為肌動(dòng)蛋白類Bcl-2相關(guān)蛋白，可與Bcl-XL結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞凋亡及自噬過程。鄧琦程等[5]報(bào)道，隨著卵巢癌分期的增加，腫瘤組織中Beclin1表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移與自噬活性的降低明顯相關(guān)。因此，本研究通過在SKOV3/TXA中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Beclin1構(gòu)建Beclin1過表達(dá)模型。RT-PCR和Weatern-blot結(jié)果顯示，Beclin1-SKOV3/TXA組細(xì)胞中Beclin1 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯升高，證實(shí)轉(zhuǎn)染成功，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，Beclin1過表達(dá)后，SKOV3/TXA細(xì)胞株的增殖過程受到抑制，這是因?yàn)锽eclin1刺激了自噬的發(fā)生，與Liang等[9]的報(bào)道一致。段振玲等[6]研究指出，Beclin1缺失與自噬囊泡的形成密切相關(guān)，Beclin1過表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞器產(chǎn)生大量的自噬囊泡，激活自噬溶酶體發(fā)揮自噬作用。本文采用MDC標(biāo)記染色發(fā)現(xiàn)，Beclin1-SKOV3/TXA組細(xì)胞MDC 標(biāo)記的自噬囊泡平均熒光強(qiáng)度顯著高于pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組，證實(shí)Beclin1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了自噬囊泡的形成，自噬溶酶體激活后增加細(xì)胞的自噬，細(xì)胞凋亡也隨之增加。

文獻(xiàn)報(bào)道[10-13]， PI3K/AKT信號(hào)通路在乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、卵巢癌等腫瘤疾病中發(fā)揮了重要作用。磷脂酰肌醇-3激酶 (Phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K) 磷酸化后可激活其下游的AKT，AKT活化后可促進(jìn)凋亡、自噬過程的啟動(dòng)。劉川等[7]提出，卵巢癌的自噬過程除了Beclin1直接啟動(dòng)自噬外，還與PI3K/AKt信號(hào)通路有關(guān)。為了進(jìn)一步了解Beclin1對(duì)SKOV3/TXA自噬及凋亡影響的可能機(jī)制，本文采用免疫印跡Western blot檢測(cè)了各組p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Beclin1過表達(dá)可顯著下調(diào)p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT的磷酸化,這提示Beclin1在卵巢癌中除了直接啟動(dòng)自噬過程外，還有可能通過間接環(huán)節(jié)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路而發(fā)揮自噬和促凋亡作用，具體中間環(huán)節(jié)還需后續(xù)開展整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從分子水平、基因水平進(jìn)一步驗(yàn)證。

誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡是紫杉醇等化療藥物發(fā)揮殺傷作用的重要機(jī)制之一。有研究團(tuán)在體外實(shí)驗(yàn)中干擾相關(guān)基因的表達(dá)，在一定程度上可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性[14-16]。因次，本文還考察了Beclin1過表達(dá)對(duì)SKOV3/TXA細(xì)胞紫杉醇耐藥的影響。采用0、500、1000、1500、2000、2500 ng/ml的紫杉醇預(yù)處理各組SKOV3/TXA細(xì)胞后，Beclin1-SKOV3/TXA組細(xì)胞凋亡率最高；且隨著紫杉醇濃度的升高，凋亡率也逐漸增加。凋亡率可以反映細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性和耐藥性，細(xì)胞凋亡率越高則表明敏感性越好，耐藥性越低。當(dāng)紫杉醇濃度為2000、2500 ng/ml時(shí)，Beclin1-SKOV3/TXA組凋亡率顯著高于其他兩組，提示Beclin1過表達(dá)可提高SKOV3/TXA細(xì)胞株對(duì)一定濃度紫杉醇的敏感性，發(fā)揮促凋亡作用。

綜上所述，自噬基因 Beclin1 過表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬過程，從而逆轉(zhuǎn)SKOV3/TXA細(xì)胞的紫杉醇耐藥性，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，誘導(dǎo)下游凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)發(fā)揮凋亡作用，這為臨床治療提供了新方向。