環(huán)氧丙烷對仿刺參抗氧化酶和免疫酶活性的影響

王麗梅，李多慧，羅耀明，鹿志創(chuàng)，何平

（1.遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧省海洋生物資源和生態(tài)學重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.大連市現(xiàn)代農業(yè)生產發(fā)展服務中心，遼寧 大連 116085）

環(huán)氧丙烷（Propylene epoxide）（又稱1,2-環(huán)氧丙烷,甲基環(huán)氧乙烷,氧化丙烯）為無色醚味液體，低沸點、易燃，是非常重要的有機化合物原料，被廣泛應用于各個領域。環(huán)氧丙烷具有急性毒性，長期接觸低質量濃度環(huán)氧丙烷的職業(yè)人群具有細胞遺傳學毒性，可損傷人的DNA[1,2]，損害動物和人周圍神經[3]。近20 年來,環(huán)氧丙烷需求強勁增長，認我國和印度為首的亞太地區(qū)是環(huán)氧丙烷產能和消費增長最快的地區(qū)[4]。2018 年我國環(huán)氧丙烷產能達到3.39×106t/年，供應量達到2.74×106t[5]。隨著有機化工產業(yè)的迅速發(fā)展，越來越多的有機物通過生產和使用進入到環(huán)境的各個領域，而海洋是其進入環(huán)境后的重要歸宿。海洋中有機物污染主要來源于海上船載化學品的泄漏、沿海石油化工企業(yè)的廢水排放以及化學品船有毒液體物質（NLS）污水的直接排放[6]。有機化工產業(yè)的發(fā)展增加了有機物環(huán)境污染及其引發(fā)的生態(tài)風險[7]。

仿刺參（Apostichopus japonicus）是我國水產品中單一經濟總量較大的海水養(yǎng)殖種類。仿刺參對生長環(huán)境要求較高，對環(huán)境污染較為敏感，遇到強烈刺激或環(huán)境異常時，常產生化皮、“排臟現(xiàn)象”；仿刺參容易飼養(yǎng)，基礎生物學研究較深入，常被用于環(huán)境毒理學的相關研究[8-14]。仿刺參屬非特異性免疫，而行使免疫功能的細胞主要存在于體腔細胞中[15]。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）是機體產生的一種內源性生物酶，可以有效清除氧自由（ROS）和超氧陰離子，阻止ROS 對細胞膜、生物酶以及DNA 的破壞[16,17]，在維持生物機體內的ROS產生與消除的動態(tài)平衡中起重要的作用[18]。過氧化氫酶（Catalase，CAT）也具有清除ROS 的功能，對增強吞噬細胞防御能力和機體免疫功能有重要作用[19]。CAT 活性的變化能夠反應出生物在有機物脅迫下的免疫力[20]。酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）是溶酶體的一種標志酶，主要參與細胞內蛋白質的消化和吸收[22-22]。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）參與生物體營養(yǎng)物質如脂質、糖類、鈣和無機磷酸鹽的吸收[23]，在堿性環(huán)境中（最佳pH 約為10）可以催化各種醇和磷酸苯酚的水解[24]。ACP 和ALP是參與生物體生長代謝、保持內環(huán)境穩(wěn)定及維持機體健康所必需的酶，對生物體的免疫作用具有重要意義。有關有機污染物對水生生物毒理學的研究較多[25-30]，但環(huán)氧丙烷對海洋生物急性毒性及毒理學的報道較少[9,31]。本研究通過探討環(huán)氧丙烷對仿刺參體內的抗氧化酶和免疫酶活性的影響，可為研究環(huán)氧丙烷對海洋生物的毒性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用仿刺參幼參取自大連金州區(qū)杏樹屯某育苗場，在實驗室暫養(yǎng)1 周后用于正式試驗。暫養(yǎng)期間，每日按照仿刺參體質量的5%投喂配合餌料，死亡率為0。禁食24 h 后，選取大小均勻、健康刺參[體質量（5.23±0.96）g]，水溫控制在13.9℃～15.9℃，溶解氧>6 mg/L，鹽度30～31 進行試驗。

試驗使用的主要儀器與試劑有：多功能酶標儀（瑞士Tecan）、CTl5RE 型臺式微量高速離心機（日本Hitachi）、Me104e 電子天平（瑞士Mettler toledo）、IMS-100 全自動雪花制冰機（常熟市雪科電器有限公司）。環(huán)氧丙烷為化學純，購自中國國藥有限公司。SOD、CAT、ACP 和ALP 活性及總蛋白含量等由南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.2 方法

先配制成0.04 g/mL 環(huán)氧丙烷母液，根據(jù)急性毒性的預試驗結果，調配出所需試驗質量濃度：100.00 mg/L、200.00 mg/L、300.00 mg/L、400.00 mg/L、500.00 mg/L 和600.00 mg/L，每個梯度設3 個平行樣。每個10 L 玻璃缸中放入20 頭幼參，隨時觀察其生活情況，統(tǒng)計24 h、48 h、72 h、96 h 幼參死亡率。

參照《水生生物檢測手冊》靜水式毒性法[32]進行試驗。死亡率為每組3 個平行結果的平均值，按照周永欣的《水生物毒性試驗方法》[33]進行校正。參照熊治延[34]方法計算劑量-反應相關關系、半致死質量濃度、95%置信區(qū)間和安全質量濃度等。

仿刺參亞致死效應的試驗方法參照高士博等[11]、羅耀明等[8]，用急性毒性試驗得到的96 h 半致死質量濃度來設計亞致死效應試驗，3 個環(huán)氧丙烷質量濃度按等比級數(shù)（1/5、1/25、1/125 的96 h-LC50）分別設定為0.83 mg/L（低質量濃度）、4.15 mg/L（中質量濃度）和20.77 mg/L（高質量濃度），以自然海水為對照組，每組設3 個平行。每個10 L 玻璃缸中放入30 頭幼參，試驗期間不充氣、不投餌，每24 h 換水1 次。試驗開始后24 h、48 h、72 h 及96 h，每次從每缸隨機取5 頭仿刺參作為一個樣本，用0.9%的生理鹽水沖洗后，用滅菌濾紙吸干體表水分，在滅菌冰培養(yǎng)皿中迅速解剖，收集仿刺參體腔液裝進離心管中，放入超低溫冰箱（-80℃）中冷凍保存待用。

總蛋白含量、SOD、CAT、ACP、ALP 活性的測定參照各測試盒說明書進行。

SOD、CAT、ACP、ALP 酶活性定義單位分別為U/mg、U/mg、U/g 和金氏單位/g，即酶活水平/總蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan 法做多重比較，顯著性水平為P<0.05，極顯著性水平為P<0.01。

2 結果與分析

2.1 環(huán)氧丙烷對超氧化物歧化酶活性的影響

中、高質量濃度環(huán)氧丙烷暴露24 h 時，誘導了仿刺參體腔液中SOD 活性，其中高質量濃度的誘導活性顯著增高（P<0.05〉；暴露48 h 時，各質量濃度環(huán)氧丙烷對SOD 活性均有誘導作用，但均無顯著影響（P>0.05）；暴露72 h 時，各質量濃度對SOD 活性均有抑制作用，中質量濃度有顯著抑制作用（P<0.05），高質量濃度有極顯著抑制作用（P<0.01）；暴露96 h 時，低、中質量濃度環(huán)氧丙烷對仿刺參體腔液中SOD 活性的誘導及抑制均不顯著（P>0.05），只有高質量濃度抑制作用顯著（P<0.05）（圖1）。

圖1 環(huán)氧丙烷對仿刺參體腔液中SOD 活性的影響Fig.1 Effect of propylene oxide on SOD activity in the coelomic fluid of sea cucumber A.japonicus

2.2 環(huán)氧丙烷對過氧化氫酶活性的影響

環(huán)氧丙烷對CAT 活性的影響見圖2。由圖2 可知，暴露24 h 時，不同質量濃度環(huán)氧丙烷對仿刺參體腔液中CAT 活性均呈不同程度誘導作用，只有高質量濃度有極顯著的誘導作用（P<0.01），其他質量濃度誘導不顯著（P>0.05）；暴露48 h 時，反應最強烈，不同質量濃度環(huán)氧丙烷對其活性均有極顯著抑制作用（P<0.01）；暴露72 h 時，不同質量濃度環(huán)氧丙烷對CAT 活性均有誘導，只有低質量濃度有極顯著誘導作用（P<0.01）；暴露96 h 時，不同質量濃度環(huán)氧丙烷對CAT 活性影響呈現(xiàn)分化現(xiàn)象，低、高質量濃度具有抑制作用，中質量濃度有誘導作用，但影響均不顯著（P>0.05）。

圖2 環(huán)氧丙烷對刺參體腔液中CAT 活性的影響Fig.2 Effect of propylene oxide on CAT activity in the coelomic fluid of sea cucumber A.japonicus

2.3 環(huán)氧丙烷對刺參酸性磷酸酶活性的影響

在暴露24 h 時，環(huán)氧丙烷對仿刺參體腔液中的ACP 活性有一定的誘導作用和抑制作用，但作用均不顯著（P>0.05）；在暴露48 h 時，不同質量濃度環(huán)氧丙烷對ACP 活性有誘導作用，但不顯著（P>0.05）；在暴露72 h 時，中、高質量濃度組的環(huán)氧丙烷對ACP 活性分別有極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）抑制作用；在96 h 時低、高質量濃度環(huán)氧丙烷對ACP 活性有抑制作用，其中高質量濃度組環(huán)氧丙烷對其有極顯著（P<0.01）抑制作用，中質量濃度有不顯著的誘導作用（P>0.05）（圖3）。

圖3 環(huán)氧丙烷對刺參體腔液中ACP 活性的影響Fig.3 Effect of propylene oxide on ACP activity in the coelomic fluid of sea cucumber A.japonicus

2.4 環(huán)氧丙烷對刺參堿性磷酸酶的影響

在暴露24 h 時，不同質量濃度環(huán)氧丙烷對刺參體腔液中堿性磷酸酶（ALP）活性有一定的誘導和抑制作用，但作用均不顯著（P>0.05）；在48 h 時，各質量濃度環(huán)氧丙烷對仿刺參體腔液中ALP 活性均有誘導作用，高質量濃度組有極顯著誘導作用（P<0.01）；暴露72 h 時，低質量濃度環(huán)氧丙烷對ALP活性有極顯著誘導作用（P<0.01），中質量濃度對其有顯著抑制作用（P<0.05）；暴露96 h 時，不同質量濃度環(huán)氧丙烷對ALP 活性均有抑制作用，高質量濃度環(huán)氧丙烷抑制作用顯著（P<0.05）（圖4）。

圖4 環(huán)氧丙烷對刺參體腔液中ALP 活性的影響Fig.4 Effect of propylene oxide on ALP activity in the coelomic fluid of sea cucumber A.japonicas

3 討論

3.1 環(huán)氧丙烷對刺參體腔液中抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶SOD 和CAT 活性的改變可以反映生物體在不同脅迫條件下的生理狀況[35]。受到環(huán)氧丙烷脅迫后，隨著作用時間的延長，仿刺參體腔液中不同抗氧化酶活性的變化趨勢不同，首先表現(xiàn)在短期的毒物興奮效應，可能因機體內穩(wěn)態(tài)受到干擾而引起過度補償[36,37]，即生物體的一種自我矯正[38]。短期環(huán)氧丙烷脅迫，機體產生防御能力和免疫力，在高質量濃度污染物刺激下，體內產生大量ROS，細胞迅速啟動一系抗氧化通路維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定[14]，阻止ROS 對生物體的破壞，誘導仿刺參體內SOD、CAT 的活性顯著增強，通過消除體內ROS，來調節(jié)其體內內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)；隨著作用時間延長和ROS 的質量濃度增加，機體內抗氧化酶無法及時消除過多ROS，破壞了體內內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，抑制了生物體內抗氧化酶[39]，導致抗氧化酶活性降低。48 h時在不同質量濃度污染物脅迫下CAT 活性均被破壞，受到極顯著抑制；暴露時間進一步延長則抑制作用逐漸減小至無顯著影響，抗氧化酶活性恢復，而72 h 時在中、高質量濃度環(huán)氧丙烷刺激下SOD活性在才受到顯著抑制，而這時CAT 活性得到恢復，機體的抗氧化能力增強，有效清除體內ROS，SOD 活性恢復要慢，直到96 h 時高質量濃度組還對其有顯著抑制作用，持續(xù)損傷體內的SOD 活性。這一結果與張喆等[29]研究十溴聯(lián)苯醚對菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）抗氧化酶活性影響的結果相似，與羅耀明等[8]研究異戊二烯對刺參抗氧化酶活性的影響不同，在其研究中短期內異戊二烯對仿刺參體腔液SOD 活性有誘導作用與本試驗相同，但誘導作用比本試驗大，到96 h 時中、低質量濃度組仿刺參SOD 活性還有顯著誘導作用，只有高質量濃度組有極顯著抑制作用，而本試驗后期只有顯著抑制作用；異戊二烯從脅迫開始就一直抑制刺參體內的CAT 活性，且隨著時間延長質量濃度增高抑制作用更強，表現(xiàn)為單調的劑量—效應關系?？赡苷驗楫愇於AT 活性有顯著抑制，導致其毒性比環(huán)氧丙烷更強，這與羅耀明等[9]比較幾種有機污染物對刺參幼參毒性結果一致。與本試驗結果不同的是，姜北[10]研究認為，中、低質量濃度苯系物對仿刺參SOD 活性有誘導作用，而高質量濃度有抑制作用。高士博等[11]研究發(fā)現(xiàn)，暴露12 h 苯系物誘導了刺參呼吸樹中CAT 酶活性，抑制了腸組織中CAT活性。這種短期誘導作用與本試驗相同，不同的是有的化合物對仿刺參抗氧化酶只有誘導作用，而無抑制作用。田秀慧等[40]研究表明，氨基脲對仿刺參的SOD 和CAT 活性均有誘導作用，誘導強度隨時間延長而降低；同樣，張晶[12]研究表面活性劑成分十二烷基磺酸鈉（SDS）對仿刺參幼參的毒理效應，對比幼參體肌中的SOD 和CAT 活性變化發(fā)現(xiàn)，污染暴露對幼參體壁肌中SOD 和CAT 活性的誘導效應存在時間依賴性，對內臟中SOD 活性的誘導效應存在時間依賴性，與SDS 暴露質量濃度無關。

3.2 環(huán)氧丙烷對刺參體腔液中免疫酶活性的影響

本實驗中，前期（24 h）環(huán)氧丙烷脅迫對ACP、ALP 免疫酶活性無顯著影響，仿刺參細胞膜能正常吸收脂質、糖類、鈣和無機磷酸鹽；直到暴露48 h時，高質量濃度環(huán)氧丙烷的強刺激下ALP 產生毒物興奮效應[36,37]，極顯著誘導了其活性，表明刺參在有機物脅迫下，提高了自身的非特異性的免疫功能，隨著時間延長，中、高質量濃度環(huán)氧丙烷對免疫酶活性產生了顯著抑制作用。免疫酶活性的變化促進或抑制了刺參機體的營養(yǎng)吸收，打破刺參生長代謝的平衡，阻礙了機體蛋白質的消化吸收，可能導致仿刺參營養(yǎng)不良，影響機體健康。

與抗氧化酶活性相比，環(huán)氧丙烷影響仿刺參體腔液中免疫酶活性的時間滯后、程度小，這一與羅耀明等[9]研究的結果一致。從污染物對兩種免疫酶活性影響來看，對ACP 活性無顯著誘導，只有作用時間長的顯著抑制作用；而ALP 活性變化與此不同，是先誘導后抑制，這一結果與本試驗的抗氧化酶SOD 活性變化趨勢相似，這表明外源性化合物對仿刺參機體內ALP 活性的影響與機體抗氧化還原系統(tǒng)間存在一定的聯(lián)系[40]。本試驗結果與羅耀明等[9]研究結果不同，異戊二烯對仿刺參體腔液中免疫酶活性只有顯著誘導作用，而無暴露時間延長的顯著抑制作用。田麗粉等[30]認為，低質量濃度的原油對牙鲆（Paralichthys olivaceus）幼魚的肝臟ALP活性只有誘導作用,隨著質量濃度的升高對其活性影響越大。

3.3 結論

（1）環(huán)氧丙烷對仿刺參體腔液中SOD、ACP、ALP和CAT 4 種酶活性影響不同，對CAT 活性抑制作用最大，但恢復也最快；除對ACP 活性誘導作用不顯著外，對其他3 種酶活性均是前期顯著誘導，后期活性均受到顯著抑制；對SOD、ACP、ALP 活性抑制作用持續(xù)時間長，至96 h 時高質量濃度環(huán)氧丙烷仍有顯著抑制作用。

（2）環(huán)氧丙烷對仿刺參體內免疫酶活性的影響時間滯后于抗氧化酶活性的影響，影響程度較小。