李樂，蒙國基，于玉根

深圳萬樂藥業(yè)有限公司，廣東 深圳 518029

近20年來，單克隆抗體被證明具有強大的治療潛力，在腫瘤、自身免疫性疾病等治療中發(fā)揮重要的作用，成為全球靶向治療藥物市場的主流［1］。單克隆抗體為一種復(fù)雜的四聚體糖蛋白大分子，一般呈異質(zhì)性，即包含形態(tài)、大小、疏水及電荷等相關(guān)的異構(gòu)體。抗體分子攜帶電荷的差異成為電荷異構(gòu)體（包含酸性及堿性異構(gòu)體）?？贵w在發(fā)酵期可發(fā)生不同過程的修飾，導(dǎo)致同一批發(fā)酵抗體的電荷異質(zhì)性［2-3］。這些修飾包括脫酰胺化、糖基化、不完全二硫鍵形成、N-端焦谷酰胺環(huán)化及C-端賴氨酸修飾等［4］。研究發(fā)現(xiàn)，抗體分子電荷異構(gòu)體能改變抗體與體內(nèi)靶點的結(jié)合，影響抗體藥物的組織分布及藥代動力學(xué)［5-7］。因此，為確保抗體藥物對人體的有效性及安全性，其生產(chǎn)工藝應(yīng)包含以去除或降低這些異質(zhì)性雜質(zhì)含量的純化步驟［8］。根據(jù)國際協(xié)調(diào)會議（In-ternational Conference on Harmonization，ICH）指導(dǎo)原則，對異質(zhì)性藥物應(yīng)規(guī)定異質(zhì)體的質(zhì)量，且應(yīng)對其表征及概況進行監(jiān)測，以保證批間一致性?！吨袊幍洹啡浚?015版）人用重組單克隆抗體制品總論中要求采用適宜的方法檢測供試品的異質(zhì)體，并盡可能對其進行鑒別，規(guī)定可接受標(biāo)準(zhǔn)。因此，分離電荷異構(gòu)體，獲得均一性抗體是其關(guān)鍵點，尤其在生物類似物開發(fā)過程中應(yīng)盡可能控制異構(gòu)體含量與原研藥保持一致。

在抗體純化過程中，通常使用多種層析技術(shù)進行多步純化，才能將目的蛋白與雜質(zhì)或異質(zhì)體分開。這些技術(shù)的原理是基于分子大小、性狀、電荷量、疏水性及溶解度的差異。其中基于電荷差異原理的離子交換層析被認(rèn)為是最有前景的方法。離子交換層析有鹽濃度及pH梯度兩種洗脫方式。研究表明，pH梯度離子交換層析在分離電荷異構(gòu)體方面具有更高的分辨率［9］。PABST等［10］利用弱陰離子交換劑，并通過調(diào)整不同層析緩沖液組分的比例，實現(xiàn)pH梯度洗脫，從而分離出抗體電荷異構(gòu)體。同樣，F(xiàn)ARMAN等［11］通過調(diào)節(jié)緩沖液組分的比例實現(xiàn)了分離電荷異構(gòu)體的目的。但這種方法涉及的緩沖液種類較多，工藝過程較復(fù)雜，pH控制不穩(wěn)定，很難應(yīng)用在生產(chǎn)放大。

深圳萬樂藥業(yè)有限公司（簡稱萬樂藥業(yè)）生產(chǎn)的由中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）發(fā)酵的抗人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）單克隆抗體類似藥，經(jīng)親和層析及陽離子交換層析純化后單體純度＞98%，但目的組分含量＜60%，酸性變異體含量 ＞35%，與原研藥赫賽?。康慕M分含量≥65%，酸性異構(gòu)體含量＜25%）相比，不符合相似性要求。在遵循ICH指導(dǎo)原則和《中國藥典》三部（2015版）要求下，本研究前期使用陽離子層析分離手段達到了各種電荷異構(gòu)體的比例與原研藥赫賽汀相近，在此層析工藝的基礎(chǔ)上，探索洗脫方式、預(yù)洗緩沖液pH、預(yù)洗緩沖液鹽濃度、預(yù)洗體積及填料負(fù)載抗體量等條件對酸性異構(gòu)體去除效果的影響，篩選最適工藝條件；并采用最適條件對重組抗HER2單克隆抗體中試工藝進行檢測，驗證其適用性。

1 材料與方法

1.1 單克隆抗體 重組抗HER2單克隆抗體由萬樂藥業(yè)生產(chǎn)（由CHO細(xì)胞發(fā)酵，深層過濾及親和層析純化后，用Tris調(diào)pH至5.5，酸性異構(gòu)體的pI為8.41，目的組分的pI為8.59，堿性組分的pI為8.73）；原研對照藥赫賽汀購自瑞士羅氏制藥。

1.2 主要試劑及儀器 醋酸鈉購自廣州化學(xué)試劑廠；Tris購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；NaCl購自廣東光華科技股份有限公司；預(yù)裝柱POROS XS（規(guī)格為1.2 cm×5 cm，柱體積為5.6 mL）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；預(yù)裝柱POROS XS XK16／20（裝填高度 10 cm，柱體積 20 mL）及POROS XS Easypack140／100（裝填高度 20 cm，柱體積 3.0 L）購自美國Bio-Rad公司，其中填料購自美國Thermo Fisher Scientific公司；AKTA avant25層析儀購自美國GE公司；Skid層析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；HPLC-E2695色譜儀購自美國Waters公司；TSKgel G3000SWXL凝膠色譜柱（7.8 mm × 300 mm，5 μm）購自日本東曹株式會社；BioLC ProPac WCX-10色譜柱（4 mm × 250 mm，10 μm）購自美國 Dionex公司；毛細(xì)管 Neutral-coated（I.D.× 30.2 cm，50 μm）及PA 800plus毛細(xì)管電泳儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 酸性異構(gòu)體去除條件的優(yōu)化

1.3.1 洗脫方式 取陰離子交換層析收集液作為樣品進行毛細(xì)管等電聚焦（capillary isoelectric focusing，cIEF）分析后，用 50 mmol／L 醋酸-醋酸鈉（pH 5.5）緩沖液平衡POROS XS預(yù)裝柱，填料負(fù)載抗體量60 g／L上樣，以pH 5.5的50 mmol／L醋酸-醋酸鈉及0～0.2 mol／L NaCl緩沖液線性梯度洗脫，0.5倍柱體積收集1管，共收集11管；同時以4～10管等體積混合液為A組，5～10管等體積混合液為B組，6～10管等體積混合液為C組，7～9管等體積混合液為D組。各管及各組分別進行分子排阻／離子交換高效液相色譜（SEC／CEX-HPLC）分析。與工藝優(yōu)化前（以pH 5.5的50 mmol／L醋酸-醋酸鈉及130 mmol／L NaCl緩沖液洗脫）的樣品（峰收集范圍為500～500 mAU）進行比較。

1.3.2 不同pH預(yù)洗緩沖液 取陰離子交換層析收集液作為樣品，以 50 mmol／L 醋酸-醋酸鈉（pH 5.5）緩沖液平衡POROSXS預(yù)裝柱，填料負(fù)載抗體量60g／L上樣，分別用pH為7.5、8.0及8.3的20 mmol／L Tris-HCl緩沖液清洗5倍柱體積，再用pH5.5的50mmol／L醋酸-醋酸鈉及130 mmol／L NaCl緩沖液洗脫并收集樣品，峰收集范圍為500～500 mAU，進行SEC／CEX-HPLC分析。

1.3.3 緩沖液pH與電導(dǎo)率 取1.3.1項收集的酸性異構(gòu)體作為樣品，以50 mmol／L醋酸-醋酸鈉（pH 5.5）緩沖液平衡POROS XS預(yù)裝柱，填料負(fù)載抗體量60 g／L上樣，用pH 8.0的20 mmol／L Tris-HCl及0 ～80 mmol／L NaCl緩沖液線性梯度洗脫20倍柱體積，0.5倍柱體積收集1管，進行SEC／CEX-HPLC分析。

1.3.4 預(yù)洗緩沖液pH與鹽濃度 取陰離子交換層析收集液作為樣品，以50 mmol／L醋酸-醋酸鈉（pH 5.5）緩沖液平衡POROS XS預(yù)裝柱，填料負(fù)載抗體量60 g／L上樣，分別用pH 8.0的20 mmol／L Tris-HCl和 35 mmol／L NaCl及 20 mmol／L Tris-HCl和15 mmol／L NaCl緩沖液清洗5倍柱體積，用50 mmol／L醋酸-醋酸鈉（pH 5.5）緩沖液平衡pH至5.5，再用pH 5.5的50 mmol／L醋酸-醋酸鈉及130 mmol／L NaCl緩沖液洗脫并收集樣品，峰收集范圍為500～500 mAU，進行SEC／CEX-HPLC分析。

1.3.5 預(yù)洗緩沖液體積 取陰離子交換層析收集液作為樣品，以 50 mmol／L 醋酸-醋酸鈉（pH 5.5）緩沖液平衡POROS XS XK16／20預(yù)裝柱，填料負(fù)載抗體量60 g／L上樣，分別用pH 8.0的20 mmol／L Tris-HCl及 15 mmol／L NaCl清洗 3、4及 5倍柱體積，用 50 mmol／L 醋酸-醋酸鈉（pH 5.5）緩沖液平衡pH至5.5，再用pH 5.5的50 mmol／L醋酸-醋酸鈉及130 mmol／LNaCl緩沖液洗脫并收集樣品，峰收集范圍為500～500 mAU，進行SEC／CEX-HPLC分析。

1.3.6 上樣密度 取親和層析中間和后段樣品，以50 mmol／L 醋酸-醋酸鈉（pH 5.5）緩沖液平衡POROS XS XK16／20預(yù)裝柱，分別以填料負(fù)載抗體量30、40、50及60 g／L上樣，用pH 8.0的20 mmol／L Tris-HCl及15 mmol／L NaCl清洗5倍柱體積，再用pH 5.5的 50 mmol／L 醋酸-醋酸鈉及 130 mmol／L NaCl緩沖液洗脫并收集樣品，峰收集范圍為500～500 mAU，進行SEC／CEX-HPLC分析。

1.4 中試工藝放大驗證 采用200 L細(xì)胞培養(yǎng)罐連續(xù)培養(yǎng)4批表達重組抗HER2單克隆抗體的CHO細(xì)胞（批號：0901D、1002D、1103D和1104D），收獲細(xì)胞液，經(jīng)深層過濾、親和層析、低pH滅活病毒、中和澄清及陰離子交換層析純化，采用優(yōu)化的陽離子交換層析工藝條件在POROS XS Easypack 140／100預(yù)裝柱上進行中試放大試驗，參數(shù)見表1。

表1 中試放大試驗參數(shù)Tab.1 Parameters in pilot production process

2 結(jié)果

2.1 酸性異構(gòu)體去除條件

2.1.1 洗脫方式 結(jié)果顯示，隨著洗脫液鹽濃度逐漸升高，酸性異構(gòu)體含量從83.1%逐漸降至2.6%，第8管目的組分含量最高（71.8%），見表2。與工藝優(yōu)化前比較，A～D組目的組分含量均升高，酸性異構(gòu)體含量均降低，回收率均降低，見表3。利用鹽濃度線性洗脫的方式分離出目的組分含量比較高。

表2 各管樣品線性洗脫各組分含量（%）Tab.2 Contents of various components in linear elution（%）

表3 各組樣品的組分含量及回收率（%）Tab.3 Contents and recoveries of components in samples of various groups（%）

2.1.2 不同pH預(yù)洗緩沖液 經(jīng)cIEF分析，重組抗HER2單克隆抗體目的組分pI為8.55，酸性異構(gòu)體pI在7.81～8.42之間，見圖1。經(jīng)pH 8.0的20 mmol／L Tris-HCl緩沖液預(yù)洗后，目的組分由工藝優(yōu)化前53.6%升至58.0%，酸性異構(gòu)體由35.0%降至33%，回收率由95.2%降至86.9%；經(jīng)pH 8.3的20 mmol／L Tris-HCl緩沖液預(yù)洗后，目的組分由工藝優(yōu)化前53.6%升至62.1%，酸性異構(gòu)體由35.0%降至28.4%，回收率由95.2%降至45.4%；pH為7.5條件下酸性異構(gòu)體含量幾乎不變。見表4。最適的預(yù)洗緩沖液pH為8.0。

圖1 重組抗HER2單克隆抗體電荷異構(gòu)體分布Fig.1 Distribution of charge variants in recombinant McAb against HER2

表4 不同pH緩沖液預(yù)洗后各洗脫峰的檢測結(jié)果（%）Tab.4 Test resutls of various peaks after pre-elution with buffers at various pH values（%）

2.1.3 緩沖液pH與電導(dǎo)率 結(jié)果顯示，預(yù)洗階段出峰時，緩沖液電導(dǎo)率為3.0～3.1 mS／cm，酸性異構(gòu)體含量達98.2%，隨著預(yù)洗緩沖液電導(dǎo)率的升高，預(yù)洗峰中酸性異構(gòu)體含量逐漸降低，目的組分含量逐漸增加；當(dāng)預(yù)洗緩沖液的電導(dǎo)率提高至4.4～4.8 mS／cm時，收集液中目的組分含量為20.9%，電導(dǎo)率升至4.8～5.2 mS／cm時，目的組分的含量為40.2%。見圖2和表5。選擇電導(dǎo)率5.0 mS／cm為后續(xù)優(yōu)化條件。

圖2 pH與電導(dǎo)相互作用下層析圖Fig.2 Chromatogram based on interaction of pH value with conductivity

表5 pH與電導(dǎo)相互作用下預(yù)洗收集液中各組分電荷分布（%）Tab.5 Charge distribution in various components of pre-eluate under interaction of pH value with conductivity（%）

2.1.4 預(yù)洗緩沖液的pH與鹽濃度 洗脫前，經(jīng)pH 8.0的 20 mmol／L Tris-HCl及 35 mmol／L NaCl緩沖液（電導(dǎo)率為5.0 mS／cm）清洗，幾乎所有抗體洗脫下來。經(jīng)pH8.0的20mmol／LTris-HCl及15mmol／L NaCl緩沖液（電導(dǎo)率為3.0 mS／cm）預(yù)洗的層析圖譜顯示，預(yù)洗階段分離出2個洗脫峰，2個峰中酸性異構(gòu)體含量分別為66.1%和64.0%；洗脫收集液經(jīng)SEC／CEX-HPLC分析，回收率為59.4%，目的組分含量從上樣前的56.4%升至67.2%，酸性異構(gòu)體含量從34%降至23.1%，見圖3和表6。

表6 預(yù)洗緩沖液鹽濃度為15 mmol／L NaCl（3 mS／cm）時層析各步驟電荷異構(gòu)體分布（%）Tab.6 Distribution of charge variants in chromatography using pre-elution buffer containing 15 mmol／L sodium chloride（3 mS／cm）

圖3 預(yù)洗緩沖液鹽濃度為15 mmol／L NaCl（3 mS／cm）時層析圖譜Fig.3 Chromatogram of samples using pre-elution buffer containing 15 mmol／L sodium chloride（3 mS／cm）

2.1.5 預(yù)洗體積 預(yù)洗3倍柱體積，洗脫收集液中目的組分及酸性異構(gòu)體的含量與原研對照藥相符，回收率最高。見表7。選擇3倍的柱體積預(yù)洗。

表7 不同預(yù)洗體積對酸性異構(gòu)體去除及回收率的影響（%）Tab.7 Effect of pre-elution volume on removal of acidic variants and recovery（%）

2.1.6上樣密度 結(jié)果顯示，隨著抗體密度的增加，預(yù)洗階段洗出的抗體量也隨著增大。當(dāng)填料負(fù)載抗體量為 30、40、50 g／L時，與工藝優(yōu)化前比較，洗脫收集液中目的組分含量僅提高2～3個百分點；當(dāng)填料負(fù)載抗體量達60 g／L時，洗脫收集液中目的組分含量由工藝優(yōu)化前的54.8%升至65%，酸性異構(gòu)體含量由37.4%降至27.4%。見圖4和表8。選擇的填料負(fù)載抗體量應(yīng)≥60 g／L。

圖4 不同負(fù)載抗體量層析對比圖Fig.4 Chromatogram of samples at various antibody load-ings

表8 不同負(fù)載抗體量的陽離子交換層析純化效果（%）Tab.8 Purification effect by cation exchange chromatography at various antibody loadings（%）

2.2 中試放大規(guī)模條件下的適用性 結(jié)果顯示，0901D批填料負(fù)載抗體量低于60 g／L，純化后酸性峰的含量幾乎無變化。1002D、1103D和1104D批填料負(fù)載抗體量均高于60 g／L，純化后酸性異構(gòu)體含量分別由31.2%降至24.3%、31.3%降至24%、31.3%降至24%，目的組分的含量分別由58%升至66.7%、60%升至67.3%、59.3%升至67.3%，且與原研對照藥（目的組分含量為65.8%，酸性異構(gòu)體含量為24.6%）相符。1002D、1103D和1104D批中試工藝放大的回收率分別為68.7%、72.1%、71.5%。見表9。

表9 4批抗體中試放大條件下陽離子交換層析純化效果（%）Tab.9 Purification of four batches of McAbs prepared by pilot production process by cation exchange chromatography（%）

3 討 論

在抗體生產(chǎn)中，下游純化工藝的開發(fā)是為了獲得高產(chǎn)量、穩(wěn)健、高純度的目的產(chǎn)物及可縮放的工藝，因此，在實際中需考慮工藝的有效性及其放大操作的可行性、簡便性和經(jīng)濟性。本文抗體原工藝?yán)贸Ｒ?guī)的陽離子交換層析條件，無法使終產(chǎn)品中電荷異構(gòu)體含量與原研對照藥保持一致，不符合生物類似藥的開發(fā)要求。本研究在此層析基礎(chǔ)上采用線性鹽濃度梯度洗脫，隨著洗脫液的鹽濃度逐漸升高，酸性異構(gòu)體含量逐步減少，堿性異構(gòu)體含量逐步升高，表明帶正電荷較少的酸性異構(gòu)體先被洗脫，而帶正電荷最多的堿性異構(gòu)體最后被洗脫，而通過不同的分組收集方式可確定出最適的收集范圍。盡管切峰收集的方式可去除部分酸性異構(gòu)體，但鹽濃度線性洗脫的方式分辨率不足，難以將酸性異構(gòu)體單獨分離出來。同時，酸性異構(gòu)體的去除伴隨著回收率的降低。當(dāng)預(yù)洗緩沖液pH越高，越接近目的組分的等電點，酸性異構(gòu)體的去除效果越好。本試驗綜合采用pH與鹽濃度相互作用進行預(yù)洗，pH 8.0的 20 mmol／L Tris-HCl及 15 mmol／L NaCl緩沖液（電導(dǎo)為3.0 mS／cm），3倍柱體積的預(yù)洗條件更適合去除該抗體的酸性異構(gòu)體。中試放大驗證試驗證實了該工藝條件的可行性和有效性。

本研究確定的工藝條件為填料負(fù)載抗體量應(yīng)≥60 g／L；在上樣／淋洗之后添加pH 8.0的20 mmol／L Tris-HCl及15 mmol／L NaCl，3倍柱體積進行預(yù)洗，預(yù)洗結(jié)束后用平衡緩沖液再平衡5倍柱體積，之后一步洗脫。此優(yōu)化工藝獲得的目的組分含量達65%，酸性異構(gòu)體含量低于25%，與原研對照藥相關(guān)質(zhì)量指標(biāo)相符。與原研藥生產(chǎn)廠家（羅氏制藥）專利中三步鹽濃度梯級洗脫方法相比［12］，本研究方法能獲得同等質(zhì)量的抗體，酸性異構(gòu)體的去除效果也相同，且工藝更為便捷，所需緩沖液種類也較少。

本研究優(yōu)化的陽離子交換層析工藝，簡單有效，4批中試樣品中抗體負(fù)載量≥60 g／L的3批驗證結(jié)果與預(yù)期一致，回收率均在68%以上，表明本方法適合工藝放大。