養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中大腸桿菌K88（Escherichia coli K88）生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析

藍(lán)江林 史懷 陳倩倩 劉波

藍(lán)江林 ，史懷，陳倩倩，等.養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中大腸桿菌K88（Escherichia coli K88）生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2021，52（12）：01-06.

優(yōu)秀學(xué)者論壇

藍(lán)江林，1972年生，研究員，主要從事農(nóng)業(yè)微生物的研究與應(yīng)用。主持完成國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（二級(jí)合同）、福建省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目20余項(xiàng)，作為主要完成人參加國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)、福建省科技重大專(zhuān)項(xiàng)等項(xiàng)目20余項(xiàng)。獲神農(nóng)中華農(nóng)業(yè)科技獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)1項(xiàng)（排名第2），福建省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)1項(xiàng)（排名第4），福建省專(zhuān)利獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)1項(xiàng)（排名第3），中國(guó)產(chǎn)學(xué)研合作創(chuàng)新與促進(jìn)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)（排名第3）。以第一作者發(fā)表論文20多篇，其中獲福建省自然科學(xué)優(yōu)秀學(xué)術(shù)論文二等獎(jiǎng)、三等獎(jiǎng)各1篇。現(xiàn)任福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所副所長(zhǎng)，兼任福建農(nóng)林大學(xué)校外研究生導(dǎo)師、《福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》編委。

摘 要：為明確自然條件下養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響，探究大腸桿菌（Escherichia coli ）在墊料中的生長(zhǎng)狀況，采用人工接種方法，將綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的大腸桿菌K88接種到養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中;采用平板分離培養(yǎng)方法，觀察大腸桿菌K88-GFP（Escherichia coli K88-GFP）在墊料中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明：E.coli K88-GFP在滅菌處理的新鮮墊料和使用1年的舊墊料中均能很好生長(zhǎng)，分離培養(yǎng)168 h含量分別達(dá)到4.03×108 cfu·g-1和5.37×108 cfu·g-1，在數(shù)量級(jí)上無(wú)顯著差別;而在未滅菌處理的新鮮墊料和使用1年舊墊料中均不能生長(zhǎng)。說(shuō)明在自然環(huán)境下，養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料對(duì)大腸桿菌K88的生長(zhǎng)有抑制作用。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌K88GFP;微生物發(fā)酵床;動(dòng)態(tài)模擬

中圖分類(lèi)號(hào)：S 828.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：0253-2301（2021）12-0001-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.001

Analysis on the Growth Dynamics of Escherichia coli K88 in the Padding ofMicrobial Fermentation Bed for Pig Raising

LAN Jiang-lin， SHI Huai， CHEN Qian-qian， LIU Bo

（Institute of Agricultural Biological Resources， Fujian Academy ofAgricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： In order to clarify the effect of padding on the growth of Escherichia coli in the fermentation bed for pig raising under natural conditions， the growth of Escherichia coli in padding was studied. The green fluorescent protein （GFP）-labeled Escherichia coli K88 was inoculated into the padding of microbial fermentation bed for pig raising by using the method of artificial inoculation. The growth dynamics of Escherichia coli K88-GFP in the padding were observed by using the plate isolating culture method. The results showed that Escherichia coli K88-GFP could grow well both in the fresh padding with bactericidal treatment and the old padding used for one year， and the contents of Escherichia coli K88-GFP reached 4.03×108 cfu·g-1 and 5.37×108 cfu·g-1 after 168 h of isolating culture， respectively， with no significant difference in order of magnitudes. However， Escherichia coli K88-GFP could not grow in the fresh padding without bactericidal treatment and the old padding used for one year. The results indicated that the padding of microbial fermentation bed for pig raising could inhibit the growth of Escherichia coli K88 in the natural environment.

Key words： Escherichia coli K88-GFP; Microbial fermentation bed; Dynamic simulation

微生物發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)是采用谷殼、鋸糠、椰殼粉等有機(jī)材料制成微生物發(fā)酵床墊料，吸納養(yǎng)殖過(guò)程中畜禽排泄的糞尿，經(jīng)過(guò)畜禽的踩踏，機(jī)械或人工翻扒，將畜禽排泄的糞尿與墊料充分混合，通過(guò)墊料中豐富的微生物進(jìn)行發(fā)酵，將畜禽糞尿分解消納，去污除臭，實(shí)現(xiàn)了養(yǎng)殖過(guò)程的清潔環(huán)保[1]。這一技術(shù)是養(yǎng)豬業(yè)環(huán)保發(fā)展的新模式，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)糞污源頭消納，清潔環(huán)境，還能提高生豬機(jī)體抗病能力，減少疾病的發(fā)生，用后的墊料還可以作為生物基質(zhì)等進(jìn)行資源循環(huán)利用，是當(dāng)前生豬養(yǎng)殖污染治理的主推技術(shù)之一[2-7]。在微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬體系中，墊料是承載畜禽糞便的載體，墊料中豐富的微生物是降解畜禽糞便的核心，微生物的種類(lèi)、活性與數(shù)量同時(shí)也是反映發(fā)酵舍環(huán)境健康狀況的重要判定指標(biāo)。而養(yǎng)殖過(guò)程中，最常見(jiàn)的環(huán)境污染微生物是腸道病原菌，其中，大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的數(shù)量和動(dòng)態(tài)則是反映環(huán)境衛(wèi)生狀況及群體健康動(dòng)態(tài)的重要指標(biāo)之一[8]。研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)養(yǎng)豬相比，發(fā)酵床養(yǎng)豬出現(xiàn)疾病的情況明顯減少，豬死亡率下降96%，可能的原因是微生物發(fā)酵床墊料形成的平衡穩(wěn)定的微生物組不利于有害微生物的生長(zhǎng)，有利于保持豬腸道健康，減少豬的腸道疾病[9-10]。也有研究表明，自然條件下，正常的發(fā)酵床墊料可以抑制大腸桿菌特別是攜帶毒素基因的大腸桿菌的生長(zhǎng)，且對(duì)大腸桿菌的生防效果隨發(fā)酵床使用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加

[11]。在墊料發(fā)酵級(jí)別為一級(jí)的墊料中，即墊料使用時(shí)間較短、發(fā)酵程度較低的條件下，可以分離到大腸桿菌;而在發(fā)酵程度較高的墊料中，即墊料發(fā)酵程度二級(jí)以上的環(huán)境中未分離到大腸桿菌[12-13]。說(shuō)明在自然狀態(tài)下，發(fā)酵床養(yǎng)殖環(huán)境可以顯著抑制病原性大腸桿菌的數(shù)量[14]。

在以往的研究過(guò)程中，從豬舍采集的自然條件下墊料樣品難以分離到大腸桿菌，為研究大腸桿菌在養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，采用室內(nèi)人工接種方法，模擬觀察大腸桿菌在發(fā)酵床墊料中的生長(zhǎng)狀況。試驗(yàn)選用新鮮墊料和使用1年的墊料，采用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的大腸桿菌Escherichia coli菌株K88，以區(qū)別于墊料中自然環(huán)境攜帶的大腸桿菌。人工接種GFP 標(biāo)記的E.coli-K88至滅菌和未滅菌處理的墊料中，觀察大腸桿菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，驗(yàn)證發(fā)酵床墊料對(duì)大腸桿菌的抑制作用，為發(fā)酵床養(yǎng)豬安全性研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮墊料：組成為谷殼∶鋸糠=1∶1。

舊墊料：使用1年的墊料，采自福州新店養(yǎng)豬場(chǎng)。采樣方法：發(fā)酵床面積3 m×3 m，墊料厚度80 cm，將墊料上層約40 cm的厚度翻耕均勻，隨機(jī)5點(diǎn)采集墊料樣品，每個(gè)樣品1000 g，混合均勻，冷藏待用。

試驗(yàn)菌株：大腸桿菌K88-GFP（Escherichia coli K88-GFP）發(fā)酵液，濃度3.6×109 cfu·g-1。

1.2 養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離

采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）培養(yǎng)細(xì)菌[15]。取新鮮墊料和使用1年的舊墊料樣品各200 g，分別置于500 mL無(wú)菌燒杯中，用3層無(wú)菌紗布封住杯口，于30℃恒溫箱中培養(yǎng)，每24 h取樣10 g，持續(xù)168 h，加入100 mL無(wú)菌水中，振蕩15 min，使之充分混勻，梯度稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5。每個(gè)濃度平板涂布3塊，每塊平板涂布菌懸液200 uL。靜置20 min，倒置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，計(jì)算對(duì)應(yīng)細(xì)菌的含量。

1.3 養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中大腸桿菌K88-GFP的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析

1.3.1 墊料滅菌處理 將墊料分裝成5 L的小包，121℃高壓滅菌，重復(fù)滅菌2次。滅菌后墊料采用無(wú)菌水稀釋涂板培養(yǎng)，未長(zhǎng)出任何微生物，則為滅菌完全。

1.3.2 人工接種大腸桿菌K88-GFP? 試驗(yàn)處理見(jiàn)表1，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

在超凈臺(tái)中，取各處理5 L置于體積7 L的無(wú)菌大塑料杯中，加入墊料體積比10%的大腸桿菌K88-GFP發(fā)酵液，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)墊料濕度至40%～50%，混合均勻;用3層無(wú)菌紗布封住杯口，置30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。每12 h取出，在超凈臺(tái)內(nèi)上下翻動(dòng)，保持濕度均勻。每24 h取樣10 g，持續(xù)168 h;相同處理的重復(fù)樣品混合均勻，取10 g，無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)捎靡良t美蘭+氨芐（Amp，100 μg%）抗性培養(yǎng)基涂板分離培養(yǎng)E.coli-K88-GFP。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中細(xì)菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析

由表2可知，培養(yǎng)24 h時(shí)，新鮮墊料中細(xì)菌的含量為1.12×108 cfu·g-1;隨后，呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，培養(yǎng)至120 h時(shí)，細(xì)菌的濃度達(dá)到最高值2.01×108 cfu·g-1;隨后又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，至168 h時(shí)，濃度為0.50×108 cfu·g-1。使用1年墊料中細(xì)菌的含量也呈現(xiàn)類(lèi)似的變化趨勢(shì)，培養(yǎng)24 h時(shí)細(xì)菌的含量為0.33×108 cfu·g-1;培養(yǎng)至120 h時(shí)，細(xì)菌的含量達(dá)到最高值1.41×108 cfu·g-1;隨后下降，168 h時(shí)，含量為0.29×108 cfu·g-1。整個(gè)培養(yǎng)周期中，新鮮墊料的細(xì)菌平均含量顯著高于（P<0.05）使用1年的舊墊料，說(shuō)明自然條件下，隨著墊料使用時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵程度較高的墊料對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)存在抑制作用。

2.2 養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中大腸桿菌K88-GFP的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析

2.2.1 未滅菌處理墊料中大腸桿菌K88-GFP的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析 人工接種后，采用伊紅美蘭+Amp抗性培養(yǎng)基分離到的細(xì)菌可確定為E.coli-K88-GFP。試驗(yàn)結(jié)果表明未滅菌處理的新鮮墊料和使用1年舊墊料中均未分離到E.coli-K88-GFP。說(shuō)明未滅菌處理墊料即自然狀態(tài)下的發(fā)酵床墊料對(duì)E.coli-K88-GFP的生長(zhǎng)有抑制作用，接種的

E.coli-K88-GFP未能成功存活。

2.2.2 滅菌處理墊料中大腸桿菌K88-GFP的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析 由圖1、圖2可知，滅菌新鮮墊料+E.coli-K88-GFP處理分離的E.coli-K88-GFP數(shù)量總體呈現(xiàn)為先下降后上升的趨勢(shì);24 h時(shí)含量為4.48×108 cfu·g-1，至72 h時(shí)，降至最低1.07×108 cfu·g-1;隨后，E.coli-K88-GFP的含量呈上升趨勢(shì)，至144 h時(shí)，含量達(dá)到4.34×108 cfu·g-1;培養(yǎng)到168 h，最終含量為4.03×108 cfu·g-1。而未滅菌新鮮墊料+E.coli-K88-GFP處理（CK1）未檢測(cè)到E.coli-K88-GFP。

滅菌舊墊料處理中，0～72 h時(shí)E.coli-K88-GFP含量呈不斷上升趨勢(shì)，含量從3.02×108 cfu·g-1上升至5.11×108 cfu·g-1;然后下降，96 h時(shí)含量最低2.00×108 cfu·g-1;96～168 h時(shí)含量再次呈現(xiàn)不斷升高趨勢(shì)，至168 h時(shí)，達(dá)到最高5.37×108 cfu·g-1。而未滅菌舊墊料未檢測(cè)到E.coli-K88-GFP。

滅菌新鮮墊料+E.coli-K88-GFP和滅菌舊墊料+E.coli-K88-GFP兩個(gè)處理的E.coli-K88-GFP含量總體無(wú)顯著差異（P>0.05）。

3 結(jié)論與討論

養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床墊料中含有的微生物，數(shù)量多，種類(lèi)豐富[16];其中細(xì)菌分布數(shù)量最大，在各使用時(shí)間和層次的分布量均達(dá)到107 cfu·g-1數(shù)量級(jí)以上，分布數(shù)量呈現(xiàn)隨著墊料使用時(shí)間的增加先上升后下降的趨勢(shì)[17]。王瀟娣等[18]分離到細(xì)菌主要有大腸桿菌、葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、鏈球菌、黏液性枯草芽孢桿菌、普通枯草芽孢桿菌等，通過(guò)小鼠致病性試驗(yàn)表明，黏液性枯草芽孢桿菌與普通枯草芽孢桿菌為有益菌。張慶寧等[19]分離獲得的好氧細(xì)菌，經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌屬不同的種。發(fā)酵試驗(yàn)和飼養(yǎng)試驗(yàn)表明，這些菌株在豬糞和墊料組成的發(fā)酵床生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)強(qiáng)，耐發(fā)酵高熱，能夠產(chǎn)生多種與豬糞降解相關(guān)的酶類(lèi)，除臭效果明顯;對(duì)某些病原菌具有抑制作用，對(duì)豬安全并有促進(jìn)生長(zhǎng)的功能。且隨著墊料使用時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)酵床墊料理化性質(zhì)不斷變化，全氮、全磷、全鉀、pH、電導(dǎo)率（EC）含量呈逐漸升高趨勢(shì)，總菌數(shù)呈遞減的趨勢(shì)[20]。本試驗(yàn)的結(jié)果與之吻合，通過(guò)對(duì)墊料中的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，其含量達(dá)到107 cfu·g-1數(shù)量級(jí)，而新鮮的墊料細(xì)菌含量顯著高于使用1年的舊墊料。說(shuō)明自然條件下，隨著墊料使用時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵程度不斷加深，墊料對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)存在抑制作用。

胡元慶等[14]檢測(cè)微生物發(fā)酵床養(yǎng)禽基質(zhì)墊料中病原性大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床基質(zhì)中大腸桿菌和沙門(mén)氏菌病原微生物的數(shù)量明顯低于普通飼養(yǎng)舍組，發(fā)酵床養(yǎng)殖環(huán)境中禽的腸道大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的數(shù)量也低于普通養(yǎng)殖環(huán)境中動(dòng)物體內(nèi)攜帶的病原菌數(shù)量，說(shuō)明發(fā)酵床養(yǎng)殖環(huán)境可以顯著抑制病原微生物的繁殖。鄭雪芳等[8]研究發(fā)現(xiàn)，墊料使用后期（第9個(gè)月）比使用初期（第1個(gè)月）大腸桿菌種群數(shù)量明顯減少，降低幅度在67.45%～96.53%，說(shuō)明微生物發(fā)酵床能抑制大腸桿菌特別是攜帶毒素基因大腸桿菌的生長(zhǎng)，且對(duì)大腸桿菌的生防效果隨使用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。說(shuō)明微生物發(fā)酵床墊料中豐富的微生物能形成以有益微生物為優(yōu)勢(shì)菌群的生物保護(hù)屏障，阻止有害微生物的侵入，對(duì)致病菌的定殖產(chǎn)生抑制作用[1，11，21-24];而且發(fā)酵床養(yǎng)豬豬舍與傳統(tǒng)豬舍相比，環(huán)境中和豬體表的菌落總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌數(shù)均較少;發(fā)酵床養(yǎng)豬潔凈衛(wèi)生，為豬提供較好的生活環(huán)境[25]。本研究通過(guò)在墊料中人工接種大腸桿菌K88-GFP，也驗(yàn)證了自然條件下，微生物發(fā)酵床墊料環(huán)境的生防作用;結(jié)果表明，大腸桿菌K88-GFP在滅菌處理的新鮮墊料和舊墊料中均能很好生長(zhǎng)，在未滅菌處理墊料中，微生物含量大，接種大腸桿菌K88-GFP均沒(méi)有成功存活。說(shuō)明在自然條件下，微生物發(fā)酵床墊料中豐富的微生物對(duì)大腸桿菌K88-GFP的生長(zhǎng)具有抑制作用，能夠提高對(duì)養(yǎng)豬健康環(huán)境的保障。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-10-12

作者簡(jiǎn)介：藍(lán)江林，女，1972年生，博士，研究員，主要從事農(nóng)業(yè)微生物研究。

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目——省屬公益類(lèi)科研院所基本科研專(zhuān)項(xiàng)（2019R1034-2）。