陳建福，彭敏

（1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，福建 漳州 363000；2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068）

蘆柑（Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan），又名柑果、真柑、乳柑等，為蕓香科柑橘屬植物[1]。蘆柑是福建省的一大名優(yōu)特產(chǎn)，其汁量豐富、色澤橙黃、風(fēng)味濃郁，含有豐富的維生素等天然有效成分，深受人們的喜愛(ài)[2]。然而人們對(duì)蘆柑的利用還主要停留在果肉、果皮和果核上，對(duì)于蘆柑采摘后剩下的枝葉利用較少，而實(shí)際上蘆柑葉中含有黃酮、多酚、精油等多種天然有效成分[3-4]，其中黃酮是存在于植物的葉、莖、根、花、果中的一類次生代謝物，具有抗衰老、抗病菌、降血脂和抗氧化等多種生理活性功能，已廣泛應(yīng)用于材料、醫(yī)藥、食品和化妝品等相關(guān)領(lǐng)域中[5-6]。超聲波輔助提取是利用超聲波的空化作用以促進(jìn)植物有效成分從植物顆粒中溶出的一種新型提取方法，宋怡偉等[7]采用響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助乙醇提取香椿葉中總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察了總黃酮的抑菌作用，結(jié)果表明最佳的提取工藝為液料比41∶1（mL/mg）、超聲時(shí)間36 min、乙醇濃度65%，所提取的總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯，且該方法具有能耗低、不會(huì)破壞生物活性、操作簡(jiǎn)便、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)[8]。

為進(jìn)一步提高蘆柑葉資源的利用率，本研究以蘆柑葉為原料，利用超聲波輔助法對(duì)蘆柑葉中總黃酮進(jìn)行提取，并利用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)蘆柑葉總黃酮對(duì)·OH和DPPH·的清除作用來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性，以期為蘆柑葉資源的利用與開(kāi)發(fā)提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

蘆柑葉：采摘于福建省南靖縣金山鎮(zhèn)上麻村。將采摘的蘆柑葉用清水清洗，去除泥沙并晾干，置于50℃干燥箱中烘干，粉碎后過(guò)80目篩，備用；乙醇（食品級(jí)）：河南鑫河陽(yáng)酒精有限公司。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1100型）：上海美譜達(dá)儀器有限公司；高頻數(shù)控超聲波清洗器（KQ-100TDE）：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將蘆丁用75%的乙醇溶解，配制成0.25 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。在10 mL的具塞玻璃比色管中，分別加入一定體積的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，再分別加入5%的亞硝酸鈉溶液和10%的硝酸鋁溶液各0.3 mL，搖勻，靜置6 min后，分別加入4%的氫氧化鈉溶液2 mL，定容，靜置反應(yīng)15 min，在510 nm下測(cè)定吸光度（A），以75%的乙醇做空白對(duì)照。以O(shè)D510為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.011 28X-0.016 58，R2=0.999 2。

1.2.2 蘆柑葉總黃酮的含量測(cè)定

在100 mL的圓底燒瓶中加入稱好的蘆柑葉粉m（g）和乙醇溶液，并在設(shè)定的溫度下進(jìn)行超聲輔助提取。提取結(jié)束后，過(guò)濾，定容到體積V（L），按照1.2.1方法，測(cè)定提取液的吸光度，計(jì)算提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度C（mg/L），通過(guò)下式得蘆柑葉總黃酮的提取率。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在固定液料比35∶1（mL/g）、乙醇濃度75%、超聲溫度70℃和超聲時(shí)間25 min的條件下，每個(gè)因素設(shè)5個(gè)水平：液料比25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1（mL/g）、乙醇濃度65%、70%、75%、80%、85%，超聲溫度 60、65、70、75、80 ℃和超聲時(shí)間 15、20、25、30、35 min，考察各單因素對(duì)蘆柑葉總黃酮提取率的影響，確定最佳的單因素工藝條件。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)所考察的單因素對(duì)蘆柑葉總黃酮提取率影響，在篩選出的最佳工藝條件基礎(chǔ)上，選取影響蘆柑葉總黃酮提取率的4個(gè)因素（液料比A、乙醇濃度B、超聲溫度C和超聲時(shí)間D）進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)并進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 蘆柑葉總黃酮的抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 DPPH·清除能力的測(cè)定

分別在10 mL的比色管中加入2 mL不同質(zhì)量濃度的蘆柑葉總黃酮溶液，并分別加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，混合均勻反應(yīng)30 min后，在517 nm處測(cè)得吸光度Ai；將2 mL 95%乙醇替代2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，測(cè)得吸光度Aj；測(cè)定2 mL蒸餾水和2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液混合液的吸光度A0；并以維生素C（VC）作對(duì)照，按下式計(jì)算得蘆柑葉總黃酮對(duì)DPPH·的清除率。

DPPH·清除率/%=[1-（Ai-A）j/A0]×100

1.2.5.2·OH清除率的測(cè)定

分別在10 mL的比色管中加入2 mL不同質(zhì)量濃度的蘆柑葉總黃酮溶液，分別加入濃度均為9 mmoL/L的水楊酸-乙醇溶液2 mL和FeSO4溶液1 mL，混勻后加入1 mL 0.01%的H2O2溶液，并進(jìn)行反應(yīng)60 min，結(jié)束后，定容，測(cè)定在510 nm處的吸光度Ai；以蒸餾水代替H2O2溶液測(cè)得吸光度Aj；以蒸餾水代替蘆柑葉總黃酮溶液，測(cè)得吸光度 A0，以維生素 C（VC）作對(duì)照，按下式計(jì)算得蘆柑葉總黃酮對(duì)·OH的清除率。

·OH清除率/%=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用 Microsoft Excel 2007、Origin 8.0 和 Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比的影響

液料比對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on extraction yield of total flavonoid

從圖1中可以看出，當(dāng)液料比在25∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）區(qū)間變化時(shí)，蘆柑葉總黃酮提取率隨著液料比的增加而增大，這是因?yàn)橐毫媳容^小時(shí)，溶劑無(wú)法浸潤(rùn)蘆柑葉顆粒，總黃酮溶出推動(dòng)力不足，但液料比超過(guò)35∶1（mL/g）后，溶劑過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致過(guò)濾、濃縮等后續(xù)步驟中總黃酮的損失[9]，從而使得提取率下降，因此液料比選擇為35∶1（mL/g）。

2.1.2 乙醇濃度的影響

乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoid

從圖2中可以看出，當(dāng)乙醇濃度在65%～75%區(qū)間變化時(shí)，蘆柑葉總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加而增大，這是因?yàn)橐掖紳舛刃r(shí)，溶劑極性較大，水溶性較強(qiáng)，總黃酮溶出率較低，但當(dāng)乙醇濃度超過(guò)75%時(shí)，乙醇濃度過(guò)高，大量醇溶性和脂溶性的溶出，加劇了與總黃酮的溶出競(jìng)爭(zhēng)[10]，從而使得提取率下降，因此最適乙醇濃度為75%。

2.1.3 超聲溫度的影響

超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of total flavonoid

從圖3中可以看出，當(dāng)超聲溫度在60℃～70℃區(qū)間變化時(shí)，蘆柑葉總黃酮提取率隨著超聲溫度的升高而增大，這是因?yàn)槌暅囟容^低時(shí)，溶劑中的分子熱運(yùn)動(dòng)較小，黃酮類物質(zhì)的滲透、擴(kuò)散與溶解能力較小，總黃酮提取率較低，但當(dāng)超聲溫度超過(guò)70℃時(shí)，過(guò)高的溫度會(huì)使總黃酮中部分不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化[11]，從而使得提取率下降。因此最適超聲溫度為70℃。

2.1.4 超聲時(shí)間的影響

超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction yield of total flavonoid

從圖4中可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間在15 min～25 min區(qū)間變化時(shí)，蘆柑葉總黃酮提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，這是因?yàn)槌晻r(shí)間較短時(shí)，蘆柑葉中黃酮類物質(zhì)還沒(méi)來(lái)得及完全溶出，提取率較小，但當(dāng)超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，黃酮類物質(zhì)會(huì)發(fā)生氧化而結(jié)構(gòu)受損，從而使得提取率下降[12]，因此最適超聲時(shí)間為25 min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化蘆柑葉總黃酮提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)所考察的單因素對(duì)蘆柑葉總黃酮提取率影響，設(shè)計(jì)了四因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)并利用軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析。試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

對(duì)表2的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，通過(guò)Design-Expert 8.05b軟件分析，得到以蘆柑葉總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，液料比（A）、乙醇濃度（B）、超聲溫度（C）和超聲時(shí)間（D）為自變量的多元回歸方程：Y=52.77+2.40A+1.06B-0.77C+0.86D-3.79AB+2.54AC+0.16AD-3.58BC-2.10BD+1.47CD-2.76A2-5.28B2-6.95C2-3.48D2。

由表3的二次回歸方程模型方差分析可以看出，該模型F=9.86，P＜0.000 1，表明該回歸模型具有較高的顯著性；失擬項(xiàng)F=3.78，P=0.106 0＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，表明該回歸方程的殘差均由隨機(jī)誤差引起，試驗(yàn)誤差小。方程的回歸系數(shù)R2=0.908 0，表明有超過(guò)90%的試驗(yàn)值可以利用該模型的預(yù)測(cè)值來(lái)解釋。根據(jù)F值及P值的分析得到各工藝因素對(duì)響應(yīng)值的影響顯著性差異，其中一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)AB、BC，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)蘆柑葉總黃酮提取率影響極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)AC對(duì)蘆柑葉總黃酮提取率影響顯著（P＜0.05），一次項(xiàng) B、C、D，交互項(xiàng) AD、BD、CD 對(duì)蘆柑葉總黃酮提取率均不顯著（P＞0.01），說(shuō)明響應(yīng)值與所考察的工藝條件之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。綜上分析，可以利用該二次回歸方程模型對(duì)蘆柑葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design and experimental results

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著程度如圖5所示。

從圖5中可以看出液料比和乙醇濃度的響應(yīng)面曲面的坡度最大、等高線最密，說(shuō)明液料比和乙醇濃度的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響最為顯著，而乙醇濃度和超聲溫度的響應(yīng)面曲面坡度陡峭程度次之，等高線疏密程度也次之，說(shuō)明乙醇濃度和超聲溫度對(duì)響應(yīng)值的影響顯著性程度次之，同理可得，各因素間交互作用影響響應(yīng)值（蘆柑葉總黃酮的提取率）的顯著性的順序?yàn)?AB＞BC＞AC＞BD＞CD＞AD。

2.2.3 最佳工藝驗(yàn)證

通過(guò)軟件對(duì)回歸方程模型進(jìn)行擬合分析，得到了蘆柑葉總黃酮的最佳提取工藝條件為：液料比38.44∶1（mL/g）、乙醇濃度73.75%、超聲溫度70.80℃和超聲時(shí)間26.24 min，蘆柑葉總黃酮提取率的預(yù)測(cè)值為53.51mg/g。為了試驗(yàn)過(guò)程中參數(shù)控制的便利，將最佳工藝條件修正為液料比38∶1（mL/g）、乙醇濃度74%、超聲溫度71℃和超聲時(shí)間26 min，并進(jìn)行重復(fù)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到總黃酮的平均提取率為（53.19±0.28）mg/g，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.6%，說(shuō)明該二次回歸方程模型具有一定的準(zhǔn)確性與可靠性，可用于蘆柑葉總黃酮的提取工藝的分析與預(yù)測(cè)。

2.3 蘆柑葉總黃酮的抗氧化活性

2.3.1 蘆柑葉總黃酮對(duì)·OH的清除能力

蘆柑葉總黃酮對(duì)·OH清除能力如圖6所示。

從圖6中可知，隨著蘆柑葉總黃酮和維生素C濃度的增加，·OH清除率逐漸提高，說(shuō)明蘆柑葉總黃酮和維生素C的濃度與·OH清除率之間存在量效關(guān)系。根據(jù)圖6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到蘆柑葉總黃酮和維生素C對(duì)·OH清除率的IC50分別為146.41 mg/L和93.39 mg/L，說(shuō)明蘆柑葉總黃酮具有一定的抗氧化能力，但其抗氧化性能小于維生素C，是一種潛在的天然抗氧化劑。

2.3.2 蘆柑葉總黃酮對(duì)DPPH·的清除能力

蘆柑葉總黃酮對(duì)DPPH·的清除能力如圖7所示。

圖7 總黃酮和維生素C對(duì)DPPH·的清除能力Fig.7 Scavenging activity of total flavonoids and vitamin C on DPPH·

從圖7中可以看出，隨著蘆柑葉總黃酮和維生素C濃度的增加，DPPH·清除率逐漸提高，說(shuō)明蘆柑葉總黃酮和維生素C的濃度與DPPH·清除率之間存在量效關(guān)系，根據(jù)圖7中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到蘆柑葉總黃酮和維生素C對(duì)DPPH·清除率的IC50分別為66.56 mg/L和47.83 mg/L，說(shuō)明蘆柑葉總黃酮具有一定的抗氧化能力。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Bohnken響應(yīng)面試驗(yàn)，得到最佳的蘆柑葉總黃酮提取工藝條件為：液料比38∶1（mL/g）、乙醇濃度74%、超聲溫度71℃和超聲時(shí)間26 min，并進(jìn)行重復(fù)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到總黃酮的平均提取率為（53.19±0.28）mg/g，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.6%，說(shuō)明該二次回歸方程模型具有一定的準(zhǔn)確性與可靠性，可用于蘆柑葉總黃酮的提取工藝的分析與預(yù)測(cè)。蘆柑葉總黃酮對(duì)·OH和DPPH·的清除效果表明蘆柑葉總黃酮具有一定的抗氧化活性，與·OH和DPPH·的清除率之間存在量效關(guān)系，其對(duì)·OH和DPPH·清除率的IC50分別為146.41 mg/L和66.56 mg/L，說(shuō)明蘆柑葉總黃酮是一種潛在的天然抗氧化劑。