土鱉蟲水溶性成分與脂溶性成分對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性的影響

王 晶，陳心怡，鄧玉瑩，王慧慧，謝雪晴，王春梅

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,北京 100029)

土鱉蟲[1]為鱉蠊科昆蟲地鱉(EupolyphagasinensisWalker)或冀地鱉(Steleophagaplancyi(Boleny))的雌蟲干燥體[2]，味咸性寒，有小毒，歸肝經(jīng)，具有破血逐瘀、續(xù)筋接骨之功效。土鱉蟲用于治療骨折具有悠久的歷史，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。我國2015年版藥典[1]中含有土鱉蟲的處方共有29份，其中14份處方用于治療跌打損傷，且藥效顯著。程爵棠先生編寫的《蟲蛇妙方》[3]中記載，土鱉蟲用于治療骨折的驗(yàn)方，治愈率均在70%以上，由此可見土鱉蟲治療骨折愈合臨床療效明確。土鱉蟲通過對骨生長因子的調(diào)控、改善血液循環(huán)、提高成骨細(xì)胞活性等加速骨折愈合?，F(xiàn)代研究表明，土鱉蟲中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸、脂肪酸、生物堿和脂溶性維生素等多種化學(xué)成分[4]。但是關(guān)于土鱉蟲促進(jìn)骨折愈合的有效成分尚不清楚，MC3T3-E1成骨細(xì)胞系是作為體外研究成骨細(xì)胞模型的成熟細(xì)胞模型[5]，因此，筆者采用多種提取方式獲得土鱉蟲成分，研究其對促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性成分的溶解性及對溫度的敏感性，為后續(xù)繼續(xù)深入研究土鱉蟲促骨折愈合的活性成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品

土鱉蟲購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系楊瑤君教授鑒定為鱉蠊科昆蟲地鱉Eupolyphagasinensis的雌蟲干燥體。

1.1.2 細(xì)胞

小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞 MC3T3-E1，由中國科學(xué)院過程工程研究所生化實(shí)驗(yàn)室張貴峰研究員饋贈(zèng)，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱于5%CO2、37 ℃濕化條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 試劑

噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)，美國 Sigma公司；HyClone胎牛血清和MEM培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；胰酶，美國Amresco公司；石油醚、乙酸乙酯，北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司；無水乙醇、NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4，北京化工廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

1)土鱉蟲不同溫度水提物的制備。稱取60 g土鱉蟲粉(過0.425 mm篩)與300 mL純水混合均勻后放入-80 ℃冰箱反復(fù)凍融5次。第5次解凍后分成3組，分別在25(室溫、磁力攪拌)、50和90 ℃水浴條件下過夜，在8 000 r/min離心20 min后，上清液在真空冷凍干燥機(jī)中凍干，得到不同溫度的水提物。

2)土鱉蟲脂溶性成分的制備。采用索氏提取法獲得脂溶性產(chǎn)物。參照文獻(xiàn)[6]方法，稱取土鱉蟲粉5 g(過0.425 mm篩)，全部移入濾紙筒內(nèi)，將濾紙筒放入脂肪抽提器內(nèi)，由抽提器抽提冷凝管上端加入石油醚、乙酸乙酯于水浴上加熱，使石油醚、乙酸乙酯回流提取6 h后取下接受瓶，回收石油醚、乙酸乙酯，待接受瓶內(nèi)石油醚、乙酸乙酯剩1～2 mL時(shí)在水浴上蒸干后，放入干燥器內(nèi)干燥冷卻1 h再稱質(zhì)量，產(chǎn)物即為土鱉蟲石油醚提取物和土鱉蟲乙酸乙酯提取物。

3)土鱉蟲的25 ℃水提物在不同溫度不同時(shí)間下二次水提物的制備。取適量土鱉蟲25 ℃未凍干水提物，分成5份再分別在25、37、50、75和100 ℃條件下水浴4 h，在真空冷凍干燥機(jī)中凍干，得到不同溫度二次水提物；另取土鱉蟲25 ℃未凍干水提物，在50 ℃水浴條件下再分別水浴4、6、8、10和12 h，在真空冷凍干燥機(jī)中凍干，得到不同時(shí)間的二次水提物。

1.2.2 MTT法檢測水溶性成分對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性的影響

參照文獻(xiàn)[7]方法，將實(shí)驗(yàn)設(shè)置為陰性對照組(MEM培養(yǎng)基)和加藥組，細(xì)胞以2×103個(gè)/孔在96孔板中培養(yǎng)24 h后加藥，分別將各組凍干粉溶于MEM培養(yǎng)基中，設(shè)置不同濃度，細(xì)胞加藥后24 h(48 h)后，分別加入MTT再孵育4 h后加入DMSO，檢測570 nm波長處吸光值。

1.2.3 MTT法檢測脂溶性成分對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性的影響

將實(shí)驗(yàn)設(shè)置為陰性對照組(含1/1 000 DMSO的MEM培養(yǎng)基)和加藥組(脂溶性產(chǎn)物溶于DMSO，以1/1 000比例加入MEM培養(yǎng)基)，細(xì)胞以2×103個(gè)/孔在96孔板中培養(yǎng)24 h后加藥，分別將不同量的脂溶性產(chǎn)物DMSO 溶解液溶于MEM培養(yǎng)基中對應(yīng)不同加藥濃度，細(xì)胞加藥后24 h(48 h)后，分別加入MTT再孵育4 h后加入DMSO，檢測570 nm波長處吸光值OD570。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 土鱉蟲不同提取方式產(chǎn)物得率

考察土鱉蟲不同提取條件下所得產(chǎn)物的得率(產(chǎn)物得率=產(chǎn)物質(zhì)量/生藥總質(zhì)量×100%)，結(jié)果見表1。由表1可知，水溶性成分產(chǎn)物得率明顯高于脂溶性成分產(chǎn)物得率。土鱉蟲不同溫度水提物的得率并不隨著溫度的升高而升高，其中在50 ℃條件下提取的水提物得率最高為11.40%，土鱉蟲不同溫度的二次水提物與不同時(shí)間的二次水提物得率相差不大。

表1 土鱉蟲不同提取方式產(chǎn)物得率Table 1 Product yield of different extraction methods of

2.2 土鱉蟲水提物和脂溶性成分對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性的影響

圖1為土鱉蟲水提物和脂溶性成分對成骨細(xì)胞增殖活性的影響。由圖1可知：土鱉蟲的25 ℃水提物在加藥24和48 h后，各濃度均對成骨細(xì)胞有促增殖的作用，且具有時(shí)間濃度依賴性關(guān)系；在生藥量為2 mg/mL加藥后48 h時(shí)，促增殖率達(dá)到最大值為39.8%(P<0.001);土鱉蟲的石油醚提取物在加藥后24和48 h，各濃度對成骨細(xì)胞生長均有抑制作用，但與陰性對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；土鱉蟲乙酸乙酯提取物在加藥后24和48 h，各濃度均對成骨細(xì)胞生長有抑制作用，生藥量為0.1 mg/mL時(shí)加藥后48 h，抑制率達(dá)到最大值為22.19%(P<0.001)。

與陰性對照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001圖1 土鱉蟲的水提物和脂溶性成分對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 Effects of water-soluble components and fat-soluble components of E.sinensis on theproliferation of MC3T3-E1 osteoblasts

2.3 土鱉蟲不同溫度水提物對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性的影響

土鱉蟲在不同溫度條件下提取的水提物作用于MC3T3-E1成骨細(xì)胞產(chǎn)生不同的藥效，結(jié)果見圖2。由圖2可知：25 ℃水提物在加藥后24 h，不同給藥量對成骨細(xì)胞均有促增殖效果；50和90 ℃水提物對成骨細(xì)胞生長的影響與陰性對照相比均無顯著性差異。這可能是樣品提取過程用時(shí)較長，50和90 ℃的水提物在提取過程中長時(shí)間受熱，有效成分失活。

圖2 土鱉蟲不同溫度水提物對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性的影響Fig.2 Effects of water extracts of different temperature ofE.sinensis on proliferation of MC3T3-E1 osteoblasts

2.4 土鱉蟲不同溫度二次水提物對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性的影響

為了進(jìn)一步研究土鱉蟲中促成骨細(xì)胞增殖的有效成分的最大耐熱溫度，繼續(xù)用未凍干的25 ℃水提物在不同溫度條件下再次水浴4 h，結(jié)果見圖3。

由圖3可知：土鱉蟲的25、37和50 ℃二次水提物在生藥量為0.5～2.0 mg/mL時(shí),加藥后24 h對成骨細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用，與陰性對照組相比有顯著性差異(P<0.05)；75 ℃二次水提物對成骨細(xì)胞的生長有抑制作用，但與陰性對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；100 ℃二次水提物在生藥量為0.5～2.0 mg/mL時(shí)對成骨細(xì)胞生長有抑制作用，與陰性對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。因此，有效成分在50 ℃條件下對成骨細(xì)胞生長依然有促增殖的作用，但在75及100 ℃高溫處理后，對成骨細(xì)胞生長不僅沒有促增殖的作用，反而對成骨細(xì)胞生長有顯著的抑制作用，因此推測土鱉蟲有效成分最大耐熱溫度為50 ℃。

圖3 土鱉蟲不同溫度二次水提物對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性的影響Fig.3 Effect of secondary water extracts of different temperature of E.sinensis on proliferation of MC3T3-E1 osteoblasts

2.5 土鱉蟲不同時(shí)間二次水提物對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性的影響

為了繼續(xù)探究土鱉蟲中促成骨細(xì)胞增殖的有效成分的最大耐熱時(shí)間，選取50 ℃為最大耐熱溫度，在其保溫4 h基礎(chǔ)上繼續(xù)延長加熱時(shí)間，結(jié)果見圖4。由圖4可知:土鱉蟲在4、6和8 h時(shí)的二次水提物在生藥量為1～2 mg/mL時(shí)，對成骨細(xì)胞生長有促增殖的作用(P<0.05)；10 h時(shí)的二次水提物在生藥量為1.5～2 mg/mL時(shí)對成骨細(xì)胞生長有促增殖的作用，與陰性對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)；12 h時(shí)的二次水提物在生藥量為0.01～1.5 mg/mL時(shí)對成骨細(xì)胞生長有抑制作用，與陰性對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。因此，加熱時(shí)間延長到10 h時(shí)，部分濃度對成骨細(xì)胞生長依然有促增殖作用，但加熱時(shí)間延長到12 h后，促增殖活性消失，推測50 ℃時(shí)土鱉蟲有效成分最長耐熱時(shí)間為10 h。

圖4 土鱉蟲不同時(shí)間二次水提物對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性的影響Fig.4 Effects of secondary water extracts of different time of Eupolyphagasinensis on proliferation of MC3T3-E1 osteoblasts

2.6 討論

土鱉蟲是一類含有氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪酸、生物堿及微量元素等多種生物活性成分的傳統(tǒng)中藥材，具有抗腫瘤、抗凝血、促進(jìn)骨折愈合及調(diào)節(jié)血脂等十分廣泛的藥理作用[8-9]。相對于土鱉蟲廣泛的藥理作用而言，其有效活性成分的研究才剛剛起步，初步研究認(rèn)為土鱉蟲的脂溶性成分中脂肪酸與抑制腫瘤生長有關(guān)[10-11]，水溶性成分中核苷類化合物有鎮(zhèn)靜作用[12]，總生物堿有擴(kuò)張血管作用[13-15]，純化得到的蛋白單體有纖溶活性[16-17]和抗腫瘤活性[18-19]。

在土鱉蟲促進(jìn)骨折愈合的研究中，未明確活性成分，目前多以土鱉蟲粗提物進(jìn)行藥理活性研究。羅佩強(qiáng)[20]研究發(fā)現(xiàn)土鱉蟲粉飼喂骨折家兔，可促進(jìn)家兔血管形成，增加成骨細(xì)胞數(shù)量和活性，加速鈣鹽沉積。張立國等[21]研究證實(shí)，地鱉蟲50%水提物可修復(fù)骨細(xì)胞活性，增加成骨細(xì)胞的數(shù)量，加速鈣鹽沉積，從而加速骨折愈合。用土鱉蟲灌胃雄性SD大鼠，制備的含藥血清可促進(jìn)成骨細(xì)胞相關(guān)基因cbfa1的表達(dá)[22]，從而加速骨折愈合。本課題組前期利用土鱉蟲50%醇提物作用于MC3T3-E1成骨細(xì)胞，對成骨細(xì)胞有促進(jìn)作用[23]，并且此活性與本實(shí)驗(yàn)室利用動(dòng)物模型進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的相關(guān)性較好。因此，使用MC3T3-E1成骨細(xì)胞作為土鱉蟲不同提取成分促增殖的活性評價(jià)指標(biāo)，比較土鱉蟲中水溶性成分與脂溶性成分對成骨細(xì)胞增殖的作用效果。

3 結(jié)論

土鱉蟲作為傳統(tǒng)中藥，制備時(shí)不僅要以得率為參考指標(biāo)，更要考慮總藥效。本研究通過不同方法提取有效成分，利用MTT法比較了各組成分的生物活性。結(jié)果顯示，土鱉蟲中水溶性成分具有促M(fèi)C3T3-E1成骨細(xì)胞增殖作用，脂溶性成分無此作用。土鱉蟲25 ℃水提物中有效成分最大耐熱溫度和最長耐熱時(shí)間分別為50 ℃、10 h。土鱉蟲水溶性成分中促成骨細(xì)胞增殖的具體有效成分仍待深入探討。