早期營(yíng)養(yǎng)干預(yù)對(duì)幼齡反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系發(fā)育的影響

張劍搏，丁考仁青，梁澤毅，Ahmad Anum-ali，杜梅，鄭娟善，丁學(xué)智，2*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730050；3.甘南州畜牧工作站，甘肅 合作747000；4.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州730000）

預(yù)計(jì)到2050 年，世界人口將達(dá)到91.5 億，屆時(shí)人類對(duì)于食物的需求陡然增加，尤其對(duì)動(dòng)物蛋白質(zhì)的需求［1］，而反芻動(dòng)物作為一種“節(jié)糧型”經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，通過瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)將人類無(wú)法直接利用的植物纖維發(fā)酵轉(zhuǎn)化為高品質(zhì)動(dòng)物蛋白［2］。瘤胃內(nèi)的不同原核生物（細(xì)菌、古菌）、真核微生物（原生動(dòng)物和真菌）與宿主互利共生、相互作用，共同形成了復(fù)雜的瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)，可將纖維性飼料轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）的形式為反芻動(dòng)物提供約70%左右的日常能量［3?4］。近些年來，動(dòng)物學(xué)家嘗試開發(fā)一類新型化合物用于精準(zhǔn)調(diào)控瘤胃關(guān)鍵微生物群落及發(fā)酵體系，以期使瘤胃發(fā)酵朝更高效的代謝途徑進(jìn)行，但收效甚微，有時(shí)其結(jié)果往往與實(shí)踐相悖［5］。研究表明，發(fā)育成熟的瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)對(duì)宿主微生物群落具有很強(qiáng)的選擇特異性［6］，這將意味著任何關(guān)于瘤胃調(diào)控的措施一旦停止，則瘤胃微生物群落組成、發(fā)酵體系將恢復(fù)到原始預(yù)處理狀態(tài)［7?8］。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物的某些特征不僅可以遺傳，而且可能受到宿主遺傳因素的影響［9］。然而，新生反芻動(dòng)物瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)的發(fā)育為這種復(fù)雜微生物生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)控提供了潛在“窗口期”。早期研究指出，動(dòng)物早期飲食經(jīng)歷對(duì)其后期的飲食習(xí)慣具有更大、更持久的影響［10?11］，同時(shí)，動(dòng)物早期階段的發(fā)育可能涉及不同的生理過程且易被改變，使其能夠更好地適應(yīng)早期的生活環(huán)境［12］。近期研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控幼年反芻動(dòng)物的日糧組成、飼養(yǎng)管理等，可以促進(jìn)瘤胃內(nèi)不同微生物群落的定植并產(chǎn)生持久影響［11，13?16］。顯然，基于早期不同營(yíng)養(yǎng)干預(yù)致使瘤胃微生物產(chǎn)生適應(yīng)性變化，使得通過早期營(yíng)養(yǎng)干預(yù)重塑瘤胃微生物群落成為可能。目前，盡管已在這方面做了大量基礎(chǔ)性研究，但對(duì)宿主?微生物間的互作機(jī)制、瘤胃核心菌群的功能、瘤胃免疫功能以及微生物定植模式的改變對(duì)宿主產(chǎn)生的長(zhǎng)期影響等仍缺乏了解。因此，本研究將從3 個(gè)方面進(jìn)行詳細(xì)地綜述：1）幼齡反芻動(dòng)物瘤胃的發(fā)育；2）影響早期瘤胃微生物群落定植的因素；3）宿主對(duì)瘤胃微生物群落的免疫應(yīng)答，以期為通過遺傳選擇和育種來操縱和獲得理想的、有效的瘤胃微生物群落，為進(jìn)一步改善家畜生產(chǎn)性能和促進(jìn)粗飼料的高效利用提供依據(jù)。

1 幼齡反芻動(dòng)物瘤胃的發(fā)育

1.1 早期瘤胃的形態(tài)學(xué)發(fā)育

瘤胃的發(fā)育是幼齡反芻動(dòng)物面臨的重要生理挑戰(zhàn)［17］，不僅需要各類細(xì)胞的持續(xù)分化及瘤胃的不斷生長(zhǎng)，同時(shí)，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)輸送到腸道、肝臟和外周組織的模式發(fā)生了重大變化［18］。幼齡反芻動(dòng)物的瘤?網(wǎng)胃尚未發(fā)育完全且不具備發(fā)酵和消化粗纖維的能力，此時(shí)的幼畜主要通過皺胃（真胃）和小腸消化、吸收葡萄糖等其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)獲取能量；為了盡快彌補(bǔ)生長(zhǎng)損失，有效利用以飼草為基礎(chǔ)的日糧，瘤?網(wǎng)胃的發(fā)育及其微生物群落的定植對(duì)瘤胃的成熟發(fā)育起著關(guān)鍵作用［3］。

這種生理功能的巨大變化與瘤胃的發(fā)育密切相關(guān)，主要涉及3 個(gè)階段：組織形態(tài)學(xué)的發(fā)育（瘤胃容積及突起的生長(zhǎng)）［19］、微生物群落的定植（細(xì)菌、真菌、古菌和原生動(dòng)物等）［20?21］及瘤胃代謝功能的發(fā)育（發(fā)酵能力和酶活性增強(qiáng)）［22?23］。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)瘤胃組織形態(tài)和代謝功能從14～42 d 逐漸發(fā)育，而微生物定植從出生到28 d 最快［17］。發(fā)育成熟的瘤胃不僅有利于飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，也是提高反芻動(dòng)物健康生產(chǎn)的重要基礎(chǔ)。瘤胃組織形態(tài)的發(fā)育歷經(jīng)3 個(gè)階段：非反芻期（0～3 周）、過渡期（3～8 周）和反芻期（8 周后），而過渡期內(nèi)瘤胃乳突的生長(zhǎng)和發(fā)育對(duì)后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用至關(guān)重要，特別是VFA［17］。研究發(fā)現(xiàn)，隨著瘤胃pH 值的降低和丁酸鹽濃度的增加，上皮細(xì)胞對(duì)丁酸鹽的代謝能力也隨之增加；持續(xù)接觸VFA 是維持瘤胃乳突生長(zhǎng)、大小和功能的必要條件［24］。因此，VFA 的存在和吸收不僅能促進(jìn)瘤胃上皮組織的代謝功能，可能亦是啟動(dòng)瘤胃上皮組織發(fā)育的關(guān)鍵［18，24］。然而，不同的VFA 對(duì)這種發(fā)育的刺激程度不同，其中丁酸鹽最強(qiáng)，其次為丙酸鹽［24］。同時(shí)，飼草料的攝入亦能刺激和促進(jìn)瘤胃上皮組織的發(fā)育［17，25］，而瘤胃上皮相關(guān)微生物的建立和活性可能也是影響瘤胃上皮組織發(fā)育的另一因素［23，26?28］。

1.2 影響幼畜瘤胃發(fā)育的因素

幼畜瘤胃發(fā)育程度受許多因素的影響，其中哺乳方式、飼料組成及幼畜飼養(yǎng)模式等均有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，由于液體飼料（牛奶或代乳品）的化學(xué)成分及食管溝的存在，限制了犢牛早期瘤胃生理功能的發(fā)育［29］，甚至長(zhǎng)達(dá)12 周齡［30］，且瘤胃上皮代謝活動(dòng)減緩，VFA 的吸收降低［31］；而且，若犢牛從一種固體飼料和代乳品改為純牛奶/代乳品時(shí)，其瘤胃發(fā)育甚至出現(xiàn)退化現(xiàn)象［32］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)固體飼料（粗飼料）的攝入不但可以刺激瘤胃微生物的增殖及VFA 的產(chǎn)生，也能刺激瘤胃上皮組織的發(fā)育、增加瘤胃容積和維持表皮的完整性，甚至提高生產(chǎn)性能［33?35］。因此，以液體飼料為基礎(chǔ)雖能促進(jìn)幼齡反芻動(dòng)物的快速生長(zhǎng)，但并不能為反芻動(dòng)物利用固體飼料做好準(zhǔn)備。

目前，幼齡反芻動(dòng)物的飼養(yǎng)管理模式主要分為：1）商業(yè)模式，通常幼畜與母畜分開，以代乳品或全脂牛奶飼養(yǎng)；2）育肥模式，通常幼畜與母畜相伴直至斷奶?；谶@種飼養(yǎng)管理模式，研究發(fā)現(xiàn)，與代乳品飼喂的羔羊相比，由母畜哺乳羔羊的瘤胃發(fā)育更強(qiáng)大［13］；同時(shí)，當(dāng)犢牛與其他不同年齡階段的牛一起飼養(yǎng)時(shí)，更容易學(xué)會(huì)提前采食草料，而且奶牛第一次產(chǎn)奶量差異的22%與生命最初幾周的平均日增重有關(guān)［36?37］。因此，在商業(yè)模式下，犢牛在最初幾周與母畜共同飼養(yǎng)有助于其后期產(chǎn)奶量的提升，同時(shí)，幼畜與母畜相伴可獲得小劑量微生物接種的優(yōu)勢(shì)值得進(jìn)一步關(guān)注。在集約化養(yǎng)殖過程中，補(bǔ)充濃縮料是為動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)的常見方法，而為幼齡反芻動(dòng)物提供早期固態(tài)濃縮發(fā)酵劑也尤為重要［17］。近年來，反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育的研究主要集中在不同日糧組成及飼養(yǎng)管理系統(tǒng)對(duì)瘤胃發(fā)育的影響［25，38］。早期飼喂?jié)饪s料不僅可以刺激瘤胃上皮細(xì)胞的發(fā)育，而且大粒徑或高纖維的飼料可能是影響瘤胃肌肉發(fā)達(dá)和體積增加的主要刺激因素［19］，但全價(jià)顆粒飼料雖能提高犢牛瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸和乙酸的水平，但卻會(huì)抑制瘤胃纖維降解菌和厭氧真菌的生長(zhǎng)［39］。因此，早期不同的飼養(yǎng)管理模式和日糧組成對(duì)幼齡反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育具有重要作用［17，40］。

在解決瘤胃發(fā)育問題時(shí)，以下問題需引起注意：瘤胃的發(fā)育是否決定了哪些微生物的定居，宿主遺傳因素是否決定了瘤胃微生物的定植類型，或者微生物是否通過自身活動(dòng)及特定的信號(hào)傳導(dǎo)來決定瘤胃發(fā)育？如表1 所示，早期不同營(yíng)養(yǎng)干預(yù)對(duì)瘤胃重量、乳突長(zhǎng)度及數(shù)目均有不同程度的影響。在成年動(dòng)物中，飼料是微生物群落結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動(dòng)力［41］，但在幼齡反芻動(dòng)物中，微生物的定植和瘤胃的發(fā)育可能存在一種互作行為。最近研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃內(nèi)總細(xì)菌拷貝數(shù)的遺傳力估計(jì)值≥0.15，表明瘤胃微生物的某些特征是遺傳的且可能受到宿主遺傳的影響［9］。同時(shí)，通過宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及定量PCR 技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs（miRNAs）可能是協(xié)調(diào)宿主與微生物互作的橋梁［23］。Fan 等［42］研究指出，3 月齡斷奶犢牛的腸道菌群受宿主基因的影響顯著，而受父本基因組的影響尤為顯著；同時(shí)，證明宿主基因通過微生物?微生物的相互作用間接地改變了腸道微生物群落的組成。此外，目前尚不清楚反芻動(dòng)物的瘤胃類型（如上皮組織、肌化、收縮等）多大程度上是由基因預(yù)先決定的。

2 影響早期瘤胃微生物群落定植的因素

2.1 瘤胃微生物定植的時(shí)空特征

大多數(shù)動(dòng)物的胃腸道在出生后被認(rèn)為是無(wú)菌的，但隨著哺乳行為、接觸周圍環(huán)境及同伴使相應(yīng)微生物逐漸開始定植，最終形成復(fù)雜多樣的微生態(tài)系統(tǒng)［18，20，23，47?48］。大量研究表明，反芻動(dòng)物瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)為厭氧環(huán)境，其中的微生物也全為厭氧菌，而早期瘤胃微生物卻并非全為厭氧微生物［20］，但隨著幼齡反芻動(dòng)物瘤胃的發(fā)育，瘤胃微生物以一種特定的、漸進(jìn)的順序進(jìn)行定植［49］，逐漸形成一個(gè)全為厭氧微生物組成的厭氧環(huán)境。

表1 不同營(yíng)養(yǎng)干預(yù)對(duì)瘤胃早期發(fā)育的影響Table 1 Effects of different nutritional interventions on early rumen development

隨著分子技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)未成熟瘤胃系統(tǒng)中已建立了十分復(fù)雜的微生物群落，例如成熟瘤胃系統(tǒng)中占主導(dǎo)地位的部分嚴(yán)格厭氧菌已在出生后1～2 d 內(nèi)出現(xiàn)［20，50?51］，而且14 日齡的犢牛瘤胃已存在所有主要類型的瘤胃細(xì)菌，包括蛋白水解和纖維素分解的物種，甚至一些競(jìng)爭(zhēng)菌［12］。Rey 等［14］監(jiān)測(cè)了奶牛犢?gòu)某錾綌嗄唐陂g瘤胃細(xì)菌群落的建立，發(fā)現(xiàn)在犢牛出生后這些細(xì)菌群落的建立是快速且連續(xù)的，變形桿菌門（Proteobacteria）逐漸被擬桿菌門（Bacteroidetes）所取代成為優(yōu)勢(shì)菌門（圖1A）。Becker 等［52］首次證明，瘤胃纖毛蟲是通過含活性生物的唾液直接在動(dòng)物之間轉(zhuǎn)移。在幼齡反芻動(dòng)物出生后2 周內(nèi)，通常可以在瘤胃中發(fā)現(xiàn)纖毛蟲類原生動(dòng)物，在大型纖毛蟲和全部原生動(dòng)物出現(xiàn)之前，瘤胃中就已形成了小型的纖毛蟲［53?54］。但是，如果幼齡反芻動(dòng)物在出生后不久便與其他反芻動(dòng)物隔離，則其瘤胃內(nèi)將無(wú)原生動(dòng)物建立，這一特性已被廣泛應(yīng)用并將繼續(xù)用于研究原生動(dòng)物在反芻動(dòng)物中的作用［53，55?57］。同時(shí)，隨著分子技術(shù)的快速發(fā)展，使得早期發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷古細(xì)菌成為可能［58］。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)甲烷古細(xì)菌在固體飼料到達(dá)瘤胃之前（2～4 d）就已在羔羊未發(fā)育的瘤胃中發(fā)現(xiàn)，其濃度在出生后10～14 d左右便與成年動(dòng)物相當(dāng)［59］。同時(shí)，Guzman 等［60］在新生犢牛的瘤胃中發(fā)現(xiàn)了可活動(dòng)甲烷微菌（Methanomicrobium mobile）、沃氏甲烷短桿菌（Methanobrevibacter votae）和甲烷短桿菌（methanobrevibactersp.），而真菌種群主要由Neocallimastix frontalis組成，也會(huì)發(fā)現(xiàn)有Sphaeromonas communis的存在，這些真菌的出現(xiàn)是瘤胃的另一個(gè)特征，而這些微生物以前僅被發(fā)現(xiàn)于成年反芻動(dòng)物，顯然它們能夠在固體飼料進(jìn)入瘤胃之前就存在于瘤胃之中。正如Stewart 等［49］所述，厭氧真菌在出生后8～10 d 混群飼養(yǎng)羔羊的瘤胃中已建立，其中3 周齡的所有羊羔均發(fā)現(xiàn)厭氧真菌的存在［20］。

除了關(guān)注瘤胃內(nèi)不同菌群的定植模式外，還應(yīng)注意與胃壁相關(guān)微生物群落的定植。Stewart 等［49］指出，胃壁細(xì)菌群落在出生后不久便已建立并快速達(dá)到成年體內(nèi)的濃度，而且該群落的多樣性似乎隨著年齡而改變。Muel?ler 等［61］使用掃描電鏡描述了1～10 周齡羔羊胃壁24 種類型細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征，盡管在羔羊和成年羊中僅發(fā)現(xiàn)7種共有類型，可認(rèn)為是胃壁細(xì)菌群落的土著成員；同時(shí)，這個(gè)群落遵循一種典型的演替規(guī)律，其屬水平組成在生命前10 周發(fā)生顯著變化。此外，依據(jù)Mueller 等［62］的研究，從瘤胃內(nèi)容物的細(xì)菌群落來看，由于大多數(shù)分離菌株可歸為普通瘤胃菌屬，胃壁細(xì)菌群落并未出現(xiàn)明顯不同。然而，Sadet 等［63］使用PCR?DGGE 發(fā)現(xiàn)胃壁細(xì)菌群落與瘤胃內(nèi)細(xì)菌群落有所不同，發(fā)現(xiàn)從液體飼料到固體飼料的轉(zhuǎn)換影響了瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，但胃壁細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)并未受其影響，表明該細(xì)菌群落具有強(qiáng)烈的宿主效應(yīng)。最近，Malmuthuge 等［64］報(bào)道了犢牛斷奶前瘤胃中消化物和胃壁細(xì)菌群落之間存在巨大差異，與胃壁細(xì)菌群落相比，消化物內(nèi)具有更高豐度的普氏菌屬（Prevotella）和較低豐度的擬桿菌屬（Bacteroidetes）。此外，粘膜細(xì)菌群落的發(fā)育與粘膜組織中一些關(guān)鍵免疫相關(guān)基因的表達(dá)之間存在明顯的相關(guān)性［28］，表明未來瘤胃微生物定植的研究應(yīng)包括瘤胃壁細(xì)菌群落。

2.2 影響早期瘤胃微生物定植的因素及最佳“窗口期”選擇

瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)中的各類營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位在早期階段就被不同微生物占據(jù)，并且微生物定植的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)在于固體飼料的攝入［14］。目前，已有充分證據(jù)表明厭氧微生物在瘤胃早期階段就已定植［20，50?51］，但鮮有研究將早期階段微生物的定植模式與某些影響微生物群落定植的因素（如：母體影響、幼畜管理模式、液體/固體飼料、添加劑的使用等）進(jìn)行比較。

瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的不同原核生物（細(xì)菌、古菌）、真核微生物（原生動(dòng)物和真菌）與宿主互利共生，但原生動(dòng)物對(duì)于正常瘤胃功能并非不可或缺［53，65］，但是它的存在與否卻與不同細(xì)菌群落、產(chǎn)甲烷菌群落的結(jié)構(gòu)以及不同瘤胃發(fā)酵模式有關(guān)［56?57］。研究發(fā)現(xiàn)，原生動(dòng)物和真菌是瘤胃真核組的代表，占微生物生物量的50%［66］，且真菌孢子內(nèi)的碳水化合物能為瘤胃原生動(dòng)物提供能量［67］。成年反芻動(dòng)物的瘤胃擁有獨(dú)特的原生動(dòng)物種群［A 型為多甲屬（Polyplastron）、B 型為前毛屬（Epidinium）］，研究發(fā)現(xiàn)，若將多甲屬引入擁有B 型原生動(dòng)物種群的動(dòng)物瘤胃中可導(dǎo)致B 型原生動(dòng)物的消滅，然而，在大多數(shù)綿羊種群中，卻存在著大致相同數(shù)量的A 和B 型原生動(dòng)物種群，顯然有一些未知的宿主因素影響原生動(dòng)物對(duì)綿羊瘤胃的定植［53］。早期研究報(bào)道，在斷奶前后飼喂飼草或濃縮料將決定一些厭氧菌的濃度，加速瘤胃微生物群落的定植［68］。Skillman 等［69］利用雙胞胎羔羊來鑒定羔羊瘤胃中的產(chǎn)甲烷菌，發(fā)現(xiàn)雙胞胎羔羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌種群之間具有相似性，表明母羊可能是產(chǎn)甲烷菌的主要來源。最近一項(xiàng)關(guān)于幼齡反芻動(dòng)物瘤胃抑制甲烷（bromochloromethane，BCM）生成的研究進(jìn)一步支持了母體的重要性［70］，研究指出羔羊瘤胃古細(xì)菌群落的建立取決于其母羊是否接受了BCM 處理，這表明任何用于幼齡反芻動(dòng)物的早期干預(yù)措施，都應(yīng)將同樣的處理應(yīng)用到母畜身上［70］。Yá?ez-Ruiz 等［71］發(fā)現(xiàn)不同日糧組成影響了羔羊瘤胃細(xì)菌群落的定植，這種影響持續(xù)了4 個(gè)月，提示進(jìn)一步探索利用日糧或食用添加劑調(diào)控成年動(dòng)物體內(nèi)微生物種群的可行性。Abecia等［13］、Belanche 等［55］發(fā)現(xiàn)，人工喂養(yǎng)和母羊喂養(yǎng)的羔羊表現(xiàn)出了不同的瘤胃原生動(dòng)物定植模式。Abecia 等［13］表明，與喂養(yǎng)代乳品的羔羊相比，母羊喂養(yǎng)的羔羊瘤胃在不斷發(fā)育過程中pH 值持續(xù)降低，推測(cè)由于群體行為學(xué)習(xí)的原因，母羊喂養(yǎng)的羔羊容易消耗更多的體能去學(xué)習(xí)某些行為。因此，在瘤胃發(fā)育過程中不同的pH 環(huán)境對(duì)某些微生物群落的定植更有利，也可能形成不同的微生物群落。

除了在斷奶前后引入固體飼料外，早期階段的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)還有直接接種特定的微生物以及使用抑制（或促進(jìn)）某些微生物群落定植的化合物等。關(guān)于給動(dòng)物飼喂具有活性的微生物已不再是一個(gè)新穎的概念［72?73］，研究表明為斷奶犢牛提供成熟瘤胃的提取物［47，74?75］、某些瘤胃真菌（如Neocallimastixsp 等）［76］或發(fā)酵飼料（如，乳酸菌等）［77?78］，不僅能增加犢牛的采食量和體重，也能刺激犢牛瘤胃的發(fā)育。此外，為羔羊瘤胃連續(xù)7 d 接種新鮮瘤胃液，可使早期斷奶羔羊的平均日增重和消化能力均提高［79］；在犢牛喂奶1 h 后給予普氏棲糞桿菌（Faecalibacteri?um prausnitzii），可以顯著降低犢牛的腹瀉率和死亡率，且顯著增加犢牛斷奶后的平均日增重［80］；在犢牛日糧中添加2%的酵母培養(yǎng)物不但可以增加干物質(zhì)的攝入和促進(jìn)生長(zhǎng)，也能輕微地改善瘤胃的發(fā)育［31］。因此，使用瘤胃益生菌［如埃氏巨型球菌（Megasphaera elsdenii），丙酸桿菌（Propionibacteria）等］不僅能直接調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵參數(shù)，也有助于其他有益菌群的生長(zhǎng)［78，81?82］。

此外，利用無(wú)菌飼喂的幼齡動(dòng)物接種特定的微生物已成為研究特定微生物功能的一種新型方法。目前，利用該方法探究瘤胃內(nèi)直接參與H2代謝的微生物群落，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌最先在瘤胃內(nèi)定植，隨著瘤胃的發(fā)育逐漸被產(chǎn)甲烷的古細(xì)菌所取代［58］。Fonty 等［83］通過無(wú)菌羔羊證明，在缺乏瘤胃產(chǎn)甲烷菌的動(dòng)物中，產(chǎn)乙酸菌的引入使其還原產(chǎn)生的乙酸成為主要的產(chǎn)氫過程，且這種干預(yù)措施在產(chǎn)后的12 個(gè)月仍然有效。Gagen 等［58］為研究產(chǎn)甲烷菌對(duì)瘤胃產(chǎn)乙酸菌群落的影響，利用自然出生的羔羊（與其母羊一起生活17 h 后分離）放入無(wú)菌隔離器進(jìn)行無(wú)菌飼養(yǎng)，為其接種了纖維素分解細(xì)菌，隨后又接種了Methanobrevibactersp.87.7，發(fā)現(xiàn)出生17 h 后隔離的羔羊瘤胃中已存在產(chǎn)甲烷菌；盡管這些羔羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量較低，但其甲基輔酶還原酶A（methyl coenzyme re?ductase A，mcr A）基因的多樣性卻與2 歲正常綿羊無(wú)差異，這表明產(chǎn)甲烷菌定植可能在早期瘤胃中持續(xù)存在，并支持生命早期階段對(duì)微生物重構(gòu)的潛力。他們認(rèn)為，若有可靠的方法從動(dòng)物早期生活中除去產(chǎn)甲烷菌并接種產(chǎn)乙酸菌，可能是減少成年反芻動(dòng)物甲烷排放行之有效的方法。因此，關(guān)于早期對(duì)產(chǎn)甲烷菌的抑制，使用抑制某些微生物群落的建立或促進(jìn)其他微生物群落發(fā)展的化合物現(xiàn)已引起人們的注意。Abecia 等［21，84］研究表明，對(duì)幼齡山羊施用BCM 改變了瘤胃古細(xì)菌的定植，使其甲烷排放量減少約50%且斷奶后效果仍持續(xù)3 個(gè)多月。

綜上所述，鑒于某些特定因素有利于微生物的定植，掌握早期階段營(yíng)養(yǎng)干預(yù)的最佳窗口期尤為重要。近期研究表明，瘤胃微生物的最初定植在出生后即刻發(fā)生，且細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)需要3～4 周才能達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定（圖1B）［13，22?23，60］。Griffith 等［85］研究發(fā)現(xiàn)，成熟瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)更加穩(wěn)定，一些營(yíng)養(yǎng)干預(yù)措施不能長(zhǎng)期有效，一旦干預(yù)措施停止將即刻恢復(fù)原始狀態(tài)，這就意味著微生物群落一旦保持相對(duì)穩(wěn)定就失去了“重構(gòu)”機(jī)會(huì)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)正常反芻動(dòng)物瘤胃中微生物的定植早于其功能的發(fā)育，而解剖學(xué)上的發(fā)育最后才形成［17］，但這種變化與瘤胃微生物的實(shí)際定植時(shí)間有關(guān)，更重要的是這種過程的持久性仍需要進(jìn)一步闡明。因此，迫切需要更多的基礎(chǔ)研究來進(jìn)一步解決這一問題。

3 宿主對(duì)瘤胃微生物群落的免疫應(yīng)答

動(dòng)物胃腸道擁有各種非特異性與特異性的保護(hù)機(jī)制，使其與常駐菌群共存［90］。若機(jī)體在營(yíng)養(yǎng)吸收、共生微生物的耐受性及病原性微生物的屏障等功能上產(chǎn)生了沖突，則需要結(jié)合生理、生化和細(xì)胞機(jī)制的綜合系統(tǒng)來保護(hù)胃腸道粘膜免受病原體的侵襲［91］。機(jī)體免疫系統(tǒng)需要學(xué)習(xí)處理微生物負(fù)荷的訓(xùn)練過程已經(jīng)被廣泛強(qiáng)調(diào)，這在生命的早期階段尤為重要［92?93］；然而，目前對(duì)瘤胃第一批定居者的“耐受性”機(jī)制尚不清楚。

反芻動(dòng)物瘤胃特殊的發(fā)酵性質(zhì)及瘤胃壁對(duì)微生物的不斷暴露，使其影響瘤胃的某些生理因素可能不同于其他胃腸道部位。正如Trevisi 等［94］所述，與常見的腸道免疫研究相比，關(guān)于反芻動(dòng)物瘤胃上皮免疫系統(tǒng)的研究鮮有報(bào)道。通常，腸道粘膜區(qū)域的免疫反應(yīng)是由粘膜相關(guān)淋巴組織（mucosal-associated lymphoid tissue，MALT）和腸道淋巴組織（gut-associated lymphoid tissue，GALT）協(xié)調(diào)作用的結(jié)果。然而，瘤胃上皮組織由多達(dá)15 層的細(xì)胞層組成，卻不含淋巴組織，這可能限制了大分子的滲透性［95］。因此，瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)的平衡是由多種機(jī)制的組合共同實(shí)現(xiàn)的，如圖1C 所示：需要唾液持續(xù)提供免疫球蛋白（immunoglobulin A，IgA 和immunoglobulin G，IgG）［96］、活性Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）［28］、一組基因編碼模式的識(shí)別受體（pattern recognition recep?tors，PRR）［97］、肽聚糖識(shí)別蛋白（peptidoglycan recognition proteins，PGLYRP1）［28］及抗菌肽（防御素）［28，87］共 同作用。

圖1 瘤胃微生物群落的定植，生態(tài)系統(tǒng)發(fā)育歷程和免疫調(diào)節(jié)組分［28，86-89］Fig.1 Colonization of microbial communities，rumen microecosystem development history and illustration of different elements of the immune-regulation

動(dòng)物血清中含有針對(duì)多種抵抗革蘭氏陰性細(xì)菌（特別是腸桿菌）的循環(huán)抗體［98］，但這類抗體被認(rèn)為是在未明顯感染情況下產(chǎn)生的天然抗體。Sharpe 等［99］在牛、綿羊、山羊和馬的血液中發(fā)現(xiàn)了針對(duì)瘤胃細(xì)菌特定菌株的抗體，吸收試驗(yàn)顯示反芻動(dòng)物的天然凝集素抗體具有高度特異性，但在豬、兔子和人類的血液中卻沒有。瘤胃微生物的能動(dòng)性與其激發(fā)天然抗體能力之間似乎存在著密切的關(guān)系，因?yàn)樵擃惪贵w可以抵抗能動(dòng)性強(qiáng)的丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、鏈球菌（Streptococci）和乳酸桿菌（Lactobacilli）；進(jìn)一步研究表明，這類抗體主要存在于初乳中并轉(zhuǎn)移到小牛血清中［100］。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)犢牛出生后12 h 內(nèi)延遲供給初乳，將造成IgG 被動(dòng)轉(zhuǎn)移受阻，延遲腸道細(xì)菌的定植，可能引發(fā)犢牛感染病菌［101］。雖不排除離開皺胃無(wú)活性的瘤胃細(xì)菌是小腸抗原刺激來源的可能性，但早期一項(xiàng)將盲腸作為抗原刺激替代部位的研究發(fā)現(xiàn)，盲腸內(nèi)的許多細(xì)菌與瘤胃內(nèi)的細(xì)菌相似，瘤胃上皮為非腺性的角質(zhì)化組織，而盲腸上皮組織卻含有淋巴組織和漿細(xì)胞，但盲腸作為活躍免疫器官的作用有待進(jìn)一步研究［102］。Sharpe 等［100］用4 只以牛奶、發(fā)酵劑和草料飼養(yǎng)的無(wú)菌羔羊來研究早期瘤胃微生物定植與抗原產(chǎn)生之間的關(guān)系，為其分別接種了韋榮氏球菌屬（Veillonela）、棲瘤胃普雷沃氏菌屬（Prevotella ruminicola）、瘤胃球菌屬（Ruminicoc?cus）、新月形單孢菌屬（Selenomonas）、巨球形菌屬（Megasphaera）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、丁酸弧菌屬（Bu?tyrivibrio）和大腸桿菌（Escherichia coli），發(fā)現(xiàn)普雷沃氏菌屬、新月形單孢菌屬和巨球形菌屬產(chǎn)生了很強(qiáng)的免疫應(yīng)答，其中普雷沃氏菌屬、新月形單胞菌的抗體在接種后20～40 d 出現(xiàn)，而且球形菌屬的抗體在28～74 d 出現(xiàn)；凝集素對(duì)韋榮氏球菌屬和瘤胃球菌屬的作用較弱，僅在接種后100～136 d 才出現(xiàn)。不出所料，未接種的細(xì)菌未檢測(cè)到凝集素，而且未得到初乳的無(wú)菌羔羊出生時(shí)僅有微量的免疫球蛋白，在74～77 d 后合成了相當(dāng)數(shù)量的免疫球蛋白（immunoglobulin M，IgM）和相對(duì)較少的IgG，但在第140 天時(shí)，IgG 水平卻上升到與IgM 相當(dāng)?shù)乃?。因此，這些結(jié)果證明了瘤胃微生物定植和特異性抗原產(chǎn)生之間具有密切聯(lián)系。如前所述，唾液可能是引入免疫球蛋白的主要載體。在探索反芻動(dòng)物接種疫苗對(duì)抗特定瘤胃微生物可能性的背景下，分別對(duì)牛血清、唾液和瘤胃液中IgA 和IgG 的水平進(jìn)行了研究［103］。這些研究證實(shí)，牛唾液和瘤胃中主要的免疫球蛋白類型為IgA；相反，血清中的主要類別是IgG；與IgG 相比，IgA 顯然更能抵抗瘤胃微生物的降解，可能是IgA 的某些分泌成分使免疫球蛋白對(duì)瘤胃中的蛋白酶活性更具抗性［104］。雖然開發(fā)特異性瘤胃微生物疫苗的研究證明，增加唾液中免疫球蛋白的攝入量是可以實(shí)現(xiàn)的，但通過唾液不斷供應(yīng)免疫球蛋白在塑造共生微生物群落中的作用，以及這種先天應(yīng)答功能在瘤胃發(fā)育過程中的作用尚不清楚。

動(dòng)物日糧的改變會(huì)導(dǎo)致瘤胃微生物群落比例的變化，但免疫系統(tǒng)如何應(yīng)對(duì)這種變化卻鮮為人知［105］。通過研究不同易感性酸中毒動(dòng)物的瘤胃上皮TLR4 基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)胃壁細(xì)菌總16S rRNA 基因拷貝數(shù)與瘤胃pH、總VFA 濃度、TLR4 基因表達(dá)之間存在相關(guān)性，預(yù)示上皮組織的先天免疫反應(yīng)與胃壁細(xì)菌的活性有關(guān)［106］。目前，反芻動(dòng)物中總共研究了10 個(gè)TLRs［28，86，89，97，106］，主要分為兩組：1）TLRs1、TLRs2、TLRs4、TLRs5、TLRs6、TLRs10，主要在細(xì)胞表面表達(dá)并識(shí)別細(xì)菌表面相關(guān)分子模式；2）TLRs3、TLRs7、TLRs8、TLRs9，主要識(shí)別來自病毒和細(xì)菌的特定核酸。盡管已知成年反芻動(dòng)物瘤胃上皮具有天然抗體存在，但很少有研究涉及幼齡反芻動(dòng)物。Malmuth?uge 等［28］研究發(fā)現(xiàn)隨著犢牛年齡的增長(zhǎng)，瘤胃、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸中大部分TLRs的表達(dá)明顯下調(diào)；且犢牛斷奶前β-防御素和PGLYRP1 的表達(dá)受到限制，表明此時(shí)犢牛胃腸道上皮免疫系統(tǒng)發(fā)生了顯著的發(fā)育變化。同時(shí)，新生反芻動(dòng)物可能依賴TLRs作為主要的先天免疫機(jī)制監(jiān)測(cè)斷奶前瘤胃共生菌群和病原體，隨著年齡的增長(zhǎng)其他先天免疫機(jī)制在宿主防御及減少有害炎癥方面變得更積極［28］。目前尚不清楚TLR的表達(dá)水平在多大程度上對(duì)瘤胃不同微生物的定植模式起作用。有趣的是Liang 等［27］研究發(fā)現(xiàn)miRNA 在犢牛早期胃腸道（包括瘤胃）發(fā)育過程中具有潛在的調(diào)控作用，首次發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌或乳酸菌的16S rRNA 基因拷貝數(shù)與瘤胃上皮組織中miR-15/16、miR-29、miR-196 的表達(dá)水平呈正相關(guān)（P<0.05）；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)這3 種miRNA 可能是淋巴組織發(fā)育（miR-196），樹突狀細(xì)胞成熟（miR-29）和免疫細(xì)胞（miR-15/16）發(fā)育的重要啟動(dòng)元件，為宿主?微生物間的相互作用調(diào)控胃腸道發(fā)育機(jī)制提供了新證據(jù)［27］。同時(shí)，隨著年齡的增長(zhǎng)，腸道微生物群落的定植及微生物的代謝功能發(fā)育逐漸加快，這可能為微生物群落?代謝組?免疫系統(tǒng)在發(fā)育過程中的相互作用提供新的線索［85］。

綜上所述，關(guān)于不同定植模式對(duì)早期瘤胃免疫系統(tǒng)的影響及長(zhǎng)期影響的研究鮮有報(bào)道?？梢约僭O(shè)，如果在早期階段阻止了某些特定微生物群落的定植，若該菌群在以后的生活中重新定植時(shí)，那么免疫系統(tǒng)很可能不會(huì)識(shí)別該類菌群，宿主可能會(huì)對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)；也許這是一種調(diào)控特定菌群定植的方法，但這并不適用于早期瘤胃原生動(dòng)物的定植模式［55］。盡管如此，仍需更多的基礎(chǔ)研究來揭示不同微生物定植模式對(duì)動(dòng)物的免疫反應(yīng)，以及接種未知菌群后瘤胃如何適應(yīng)。

4 展望

瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)的早期建立對(duì)瘤胃機(jī)能的完善及腸道健康和機(jī)體免疫系統(tǒng)的完善至關(guān)重要。目前，研究發(fā)現(xiàn)早期營(yíng)養(yǎng)干預(yù)確實(shí)可以影響早期瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)的發(fā)育，但瘤胃微生物群落的定植規(guī)律、核心菌群間的相互作用機(jī)制以及宿主?微生物間的免疫互作機(jī)制仍有待解決。因此，后續(xù)關(guān)于幼畜瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)育的研究有必要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的試驗(yàn)，真正評(píng)估早期營(yíng)養(yǎng)干預(yù)對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)性能及健康的影響。同時(shí)，還應(yīng)從以下幾個(gè)方面研究：

1）綜合多種組學(xué)技術(shù)（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等）深入研究早期瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)育，深度挖掘核心菌群的定植及其代謝功能的形成，探索核心菌群間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，尋找最小驅(qū)動(dòng)菌群，以期實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)，提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能及健康水平。

2）早期營(yíng)養(yǎng)干預(yù)對(duì)調(diào)控幼齡反芻動(dòng)物瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)育具有巨大潛力，應(yīng)進(jìn)一步深入探究早期瘤胃液移植，瘤胃益生菌、粗飼料等的攝入對(duì)幼齡反芻動(dòng)物的長(zhǎng)期影響作用，開發(fā)用于提高反芻動(dòng)物粗飼料利用、降低甲烷排放的早期營(yíng)養(yǎng)干預(yù)措施。

3）瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)作為一個(gè)潛在的寶貴生物資源，擁有獨(dú)特的發(fā)酵體系、多樣的微生物資源及豐富的酶資源，為了深入挖掘其巨大的潛在價(jià)值，就必須篩選目標(biāo)菌群、分離培養(yǎng)獲得單獨(dú)菌株；同時(shí)，結(jié)合宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組、宏蛋白組及宏代謝組等技術(shù)深入挖掘菌株信息，明晰代謝通路，找到編碼特定酶類的目標(biāo)基因，以期利用基因工程獲得大量微生物資源和酶類資源。

4）通過深入研究幼齡反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)免疫系統(tǒng)的構(gòu)建，在分子水平上確定與早期微生物定植相關(guān)的關(guān)鍵免疫元件，有助于理解宿主?微生物間的免疫互作機(jī)制。

5）確定反芻動(dòng)物和瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)的理想表型，利用基因組技術(shù)逐層解析該表型的生物學(xué)基礎(chǔ)，最后，采用動(dòng)物育種與微生物育種相結(jié)合的新型育種模式，培育高產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)的動(dòng)物新品種。