吳少波，臧淇娟，邢梓軒，代秉玲(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，西安 710061)

腎透明細胞癌(KIRC)是腎癌中最常見的惡性腫瘤，占腎臟原發(fā)惡性腫瘤的75%～82%[1-2]。近年來，免疫檢查點抑制劑已成為KIRC一線治療的標(biāo)準(zhǔn)[3-5]。BUB1B是紡錘體裝配檢查點蛋白家族的成員之一，已被證實與多種癌癥相關(guān)，但其在KIRC發(fā)生中的確切作用尚不清楚。研究表明，多種因素可能在KIRC免疫微環(huán)境的形成過程中發(fā)揮不同的作用。免疫檢查點阻斷療法已被證實對KIRC患者預(yù)后的改善具有一定作用[6]，但免疫浸潤細胞與KIRC預(yù)后的關(guān)系仍不清楚。

本研究采用癌癥基因組圖譜(TCGA，https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)數(shù)據(jù)庫中的KIRC數(shù)據(jù)，通過基因表達譜交互分析(GEPIA)和Cox比例風(fēng)險回歸模型回歸分析確定BUB1B與KIRC表達的相關(guān)性及對預(yù)后的影響。利用CIBERSORT和TIMER計算KIRC中22種不同類型腫瘤浸潤性免疫細胞(TIICs)的相對比例，探討B(tài)UB1B與TIICs的關(guān)系。此外，對BUB1B進行基因功能富集，分析其表達影響的通路，最后利用GEO和UCLCAN數(shù)據(jù)庫對結(jié)果進行外部數(shù)據(jù)驗證。BUB1B有可能成為新的評估KIRC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物和腫瘤免疫治療靶點。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)下載和預(yù)處理 下載KIRC患者的基因表達譜和臨床信息，包括539份腫瘤樣本和72份正常樣本，均來自于TCGA(是高通量芯片實驗數(shù)據(jù)的公共存儲庫)。剔除年齡、總生存時間、腫瘤原發(fā)灶(T)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)和遠處轉(zhuǎn)移(M)分期資料不足或缺失的病例。最后，對497例臨床資料符合要求的患者進行后續(xù)分析。

1.2GEPIA數(shù)據(jù)庫分析 用GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/)對TCGA數(shù)據(jù)庫中BUB1B在腫瘤和正常樣本中的表達量進行分析。GEPIA是一個公共平臺，用于分析來自TCGA和基因型-組織表達(GTEx)數(shù)據(jù)庫項目的9 736個腫瘤和8 587個正常樣本的RNA測序表達數(shù)據(jù)[7]。本研究使用GEPIA分析KIRC總生存與BUB1B表達的相關(guān)性及其表達與病理分期之間的聯(lián)系。

1.3免疫浸潤分析 TIMER是一個用于系統(tǒng)分析各種癌癥類型免疫浸潤的數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)[8]。本研究通過基因模塊評估KIRC中BUB1B與6種免疫細胞豐度的關(guān)系。此外，為了評估樣本集中基因表達的相對差異，使用了一種名為CIBERSORT的基于表達的反卷積算法。利用CIBERSORT計算了22種類型免疫細胞的免疫應(yīng)答，以評估它們在KIRC中與BUB1B表達的關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)與TIICs之間的相關(guān)性。

1.4基因功能富集分析 基因功能富集分析(GSEA)通常用于評估某一特定基因集在一定的生物學(xué)狀態(tài)下是否存在顯著差異。本研究通過GSEA分析BUB1B低表達組和高表達組在哪些通路上存在顯著差異表達。

1.5外部數(shù)據(jù)來源 本研究分析了從GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載的2個KIRC基因表達譜芯片數(shù)據(jù)集，分別為GSE36895和GSE71963。UALCAN是一個驗證目標(biāo)基因和確定腫瘤亞群特異性候選生物標(biāo)志物的數(shù)據(jù)平臺(http://ualcan.path.uab.edu)[9]，通過UALCAN分析了BUB1B在KIRC中的表達差異、腫瘤分期以及預(yù)后。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)處理基于R(3.6.3)軟件，來源于Bioconductor (https://www.Bioconductor.org/)。數(shù)據(jù)整理:如果數(shù)據(jù)出現(xiàn)缺少任意單個值則刪除整個樣本，采用單因素Cox和多因素Cox分析評估BUB1B表達及其他病理臨床因素(年齡、性別、淋巴結(jié)、遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤狀態(tài)、分期)與總生存期之間的相關(guān)性。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1KIRC患者的臨床特征及Cox分析 與正常組織相比，KIRC中BUB1B的表達水平明顯升高(log2FC<1，P<0.01)，見表1和圖1。由圖1可知，通過GEPIA發(fā)現(xiàn)，BUB1B高表達與低總生存率(P=0.008 2)(圖1B)和病理晚期(P<0.01)顯著相關(guān)(圖1C)。單因素Cox回歸分析表明，年齡、腫瘤分期、腫瘤分級、腫瘤原發(fā)灶(T)、遠處轉(zhuǎn)移(M)分期和BUB1B高表達都是不良預(yù)后的危險因子。多因素Cox分析表明，年齡、腫瘤分期、腫瘤分級以及BUB1B高表達均與患者預(yù)后顯著相關(guān)。因此，BUB1B表達上調(diào)[風(fēng)險比(HR)=1.23，P=0.00]可作為預(yù)測患者預(yù)后的獨立危險因素。

圖1 GEPIA中BUB1B的表達與預(yù)后及臨床病理因素的相關(guān)性分析注：A.BUB1B在癌旁組織樣本和腫瘤樣本中的差異表達；B.BUB1B高、低表達組在KIRC患者中的生存曲線；C.不同腫瘤分期中BUB1B表達的箱式圖；D.多因素Cox分析的森林圖。Fig.1 Expression of BUB1B，survival prognosis and correlation analysis with clinicopathological factors by GEPIANotes：A.BUB1B is differentially expressed in normal samples and tumor samples； B.the prognosis survival curve of KIRC patients with high and low BUB1B expression group； C.Box diagram of BUB1B expression in different tumor stages；D.forest map by multivariate Cox analysis.

表1 患者總體生存和多變量特征的相關(guān)性Tab.1 Correlation between overall survival and multivariable characteristics

2.2KIRC患者免疫浸潤水平以及免疫浸潤細胞與預(yù)后的關(guān)系 見圖2。由圖2可知，經(jīng)TIMER評估得出，BUB1B的表達水平與KIRC 6種免疫細胞浸潤水平呈顯著正相關(guān)(圖2A)。此外，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)過濾樣本，最后得到13例正常樣本和415例腫瘤樣本，利用CIBERSORT分析計算免疫細胞的密度，評估它們在正常組和腫瘤組中表達水平的差異(圖2B)。結(jié)果表明，CD8+T細胞、激活的CD4+記憶性T細胞、T-regs細胞、M0巨噬細胞和中性粒細胞在腫瘤組中呈高表達(P<0.05)，靜息的CD4+記憶性T細胞、靜息的NK細胞、單核細胞和靜息的肥大細胞在腫瘤組中呈低表達(P<0.05)。KIRC中22種免疫細胞之間的相關(guān)性評估見圖3。正相關(guān)用紅色表示，負相關(guān)用藍色表示。由圖3可見，CD8+T細胞與靜息的CD4+記憶性T細胞呈強負相關(guān)(-0.63)，與M2巨噬細胞也呈一定的負相關(guān)(-0.51)。

圖2 BUB1B與免疫浸潤細胞的相關(guān)性和KIRC中不同免疫細胞的比例Fig.2 Correlation of BUB1B with immune-infiltrating cells and proportions of different immune cells in KIRC

2.3GSEA分析 GSEA分析顯示了BUB1B富集到的存在顯著差異的KEGG通路[錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05且P<0.05]。見表2和圖4。由表2和圖4可知，KEGG通路分析顯示了與BUB1B高表達呈正相關(guān)的5個通路：細胞周期、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性、P53信號通路、T細胞受體信號通路和非小細胞肺癌；呈負相關(guān)性的3個通路是亨廷頓病、氧化磷酸化和帕金森氏病。結(jié)果表明，BUB1B在KIRC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

圖4 基因功能富集圖Fig.4 Map of gene function enrichment

表2 基因功能富集分析Tab.2 Gene sets enriched in phenotype

2.4外部數(shù)據(jù)驗證 見圖5。由圖5可知，提取GEO數(shù)據(jù)集GSE36895(正常樣本=23，腫瘤樣本=29)和GSE71963(正常樣本=16，腫瘤樣本=32)中的基因表達矩陣，發(fā)現(xiàn)BUB1B在腫瘤組織中高表達；通過UALCAN分析可知，BUB1B同樣也在腫瘤組織中高表達(圖5C)。此外，UALCAN數(shù)據(jù)庫還分析了134例BUB1B高表達樣本和397例中低表達樣本的生存曲線，發(fā)現(xiàn)BUB1B高表達組的預(yù)后更差(P<0.000 1)，且BUB1B的表達水平與腫瘤各分期呈顯著正相關(guān)，與之前的結(jié)論一致(圖5D和圖5E)。

圖5 外部數(shù)據(jù)驗證結(jié)果注：A.數(shù)據(jù)集GSE36895中BUB1B的表達情況；B.數(shù)據(jù)集GSE71963中BUB1B的表達情況；C.UALCAN中BUB1B的表達情況；D.UALCAN中BUB1B高、低表達患者的生存曲線；E.UALCAN中BUB1B的臨床分期表達情況。Fig.5 Results of external data validationNotes：A.expression of BUB1B in data set GSE36895；B.expression of BUB1B in data set GSE71963；C.ehe expression of BUB1B in UALCAN；D.survival curve of patients with high and low expression of BUB1B in UALCAN；E.clinical stage expression of BUB1B in UALCAN.

3 討論

KIRC在全球范圍內(nèi)是最常見的十大癌癥之一，每年約有338 000例新發(fā)病例[10-11]。與其他腎癌亞型患者相比，KIRC患者的預(yù)后更差。目前，包括手術(shù)和靶向治療的綜合治療已經(jīng)被用于治療KIRC，患者的總體存活率得到了提高[12]。然而，Cost N G等[13]報道靶向分子治療對透明KIRC血栓的臨床效果微乎其微。近年來，KIRC的基因治療逐漸成為研究者關(guān)注的熱點[14]。研究表明，目前的治療遠遠不能滿足KIRC患者的需求，對于KIRC的治療和預(yù)后評價，迫切需要新的生物標(biāo)志物。據(jù)報道，BUB1B的表達與多形成性膠質(zhì)細胞瘤(GBM)患者的不良預(yù)后相關(guān)，可促進膠質(zhì)母細胞瘤患者腫瘤細胞的增殖[15-16]。此外，BUB1B與腫瘤生長和前列腺癌的進展有關(guān)[17]，BUB1B高表達已被證實與人類肺腺癌有關(guān)[18]，但其在KIRC中的作用尚未見報道。KIRC常伴有免疫細胞浸潤，被認為是一種免疫原性癌[19]。從KIRC中分離出多種免疫細胞，包括自然殺傷細胞(NK)、對自體腫瘤細胞有特異性的細胞毒性T細胞、輔助T細胞和表達白細胞介素-1(IL-1)和白細胞介素-2(IL-2)，并作為抗原提呈細胞的樹突狀細胞[20-23]，而巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞可能是免疫檢查點抑制劑療法重要的靶標(biāo)[24]。本研究首次論證了BUB1B作為獨立危險因素在預(yù)測KIRC患者預(yù)后以及在免疫微環(huán)境中的調(diào)控潛力。

本研究顯示，BUB1B在KIRC組織中呈顯著高表達。多因素Cox分析結(jié)果顯示，BUB1B可作為獨立危險因素預(yù)測KIRC患者更差的預(yù)后，這在外部數(shù)據(jù)GEPIA和UALCAN中均得到了驗證，說明研究BUB1B對KIRC患者的預(yù)后具有臨床意義。進一步研究發(fā)現(xiàn)，不同的免疫細胞浸潤水平與KIRC中BUB1B的表達量呈顯著正相關(guān)，在癌旁組織和腫瘤組織樣本中有多種免疫細胞存在顯著差異表達。在大多數(shù)實體瘤中，CD8+T細胞的高浸潤有利于腫瘤的治療[25-27]，在KIRC的免疫細胞中，CD8+T細胞所占比例最大，而腎癌中CD8+T細胞的高浸潤與不良預(yù)后有關(guān)[28]。NK細胞是存在于腎細胞癌中的一種浸潤性免疫細胞，有研究表明，NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性通路在腎細胞癌中表現(xiàn)出較高的活性，提高KIRC細胞對NK細胞的細胞毒性的敏感性可能是治療KIRC的有效方法[29]。一些基于NK細胞毒性作用的KIRC新治療方法的研究已經(jīng)完成[30]。這些發(fā)現(xiàn)有助于進一步研究BUB1B在KIRC中的預(yù)后價值以及與免疫浸潤細胞相互作用的可能機制。此外，本研究還表明，BUB1B與許多免疫應(yīng)答途徑和癌癥通路顯著相關(guān)。BUB1B高表達組富集到的通路包括自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性、T細胞受體信號通路和非小細胞肺癌等，BUB1B低表達組富集到的通路包括亨廷頓病、氧化磷酸化和帕金森氏病。有研究發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化下調(diào)、三羧酸循環(huán)(TCA)通路及其相關(guān)通路可能在KIRC的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用，趨化因子信號通路及其相關(guān)通路的上調(diào)可能有助于KIRC的轉(zhuǎn)移[29]。

基于本研究結(jié)果以及以往對BUB1B的研究，有理由認為BUB1B在KIRC免疫浸潤細胞的調(diào)控中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。建議進一步深入研究，逐步完善BUB1B生物學(xué)效應(yīng)的證據(jù)。綜上所述，BUB1B是一個具有潛在應(yīng)用前景的預(yù)后生物標(biāo)志物，可能成為KIRC免疫治療的新靶點。