高洋洋，丁 瑞，王寅飛(大連市第三人民醫(yī)院藥劑部，大連 116033)

人參皂苷-Rg5(G-Rg5)是從人參中提取的一種稀有的三萜皂苷類化合物[1]，藥理學研究表明，G-Rg5具有抗腫瘤、抗血管生成、抗炎、抗過敏、抗氧化、抗衰老和抗糖尿病等藥理活性[2]，其中G-Rg5對食道癌[3]、胃癌[4]、乳腺癌[5]和宮頸癌[6]等多種癌癥的抗腫瘤作用備受研究者的廣泛關注。但G-Rg5的水溶性較差，需要通過制劑技術來提高其溶解性，改善其生物利用度[7]，進而發(fā)揮G-Rg5的臨床應用價值。本研究將G-Rg5制備成固體脂質納米粒 (G-Rg5 SLNs)，并通過四甲基偶氮唑鹽比色(MTT)法評價了G-Rg5 SLNs對人宮頸癌細胞(Hela)的抑制效果，為進一步開展動物體內藥效學評價實驗奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1儀器 LC-60Tvp型高效液相色譜儀(無錫創(chuàng)想分析儀器有限公司)；DF-101S型集熱式無極調速恒溫磁力攪拌器(常州市儀都儀器有限公司)；JY92-IIN型超聲波細胞粉碎機(上海精其儀器有限公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90型納米粒徑電位分析儀(英國Malvern公司)；JEM-F200 場發(fā)射透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.2試藥 人參皂苷Rg5原料藥(G-Rg5，成都彼樣生物科技有限公司，批號1300145，質量分數(shù)為98.2%)；蛋黃卵磷脂(南京威爾藥業(yè)股份有限公司)；山崳酸甘油酯(Compritol-888 ATO)和泊洛沙姆188(Poloxamer 188)，均購自德國巴斯夫公司；無水乙醇(南京化學試劑股份有限公司)；純化水，默克密理博Milli-Q超純水機制備，其他試劑均為分析純。

1.3細胞 人宮頸癌細胞(Hela，上海復祥生物科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1G-Rg5 SLNs的制備 通過熱熔乳化超聲-低溫固化法制備G-Rg5 SLNs[8]。將處方量的G-Rg5、Compritol-888 ATO(固體脂質)和蛋黃卵磷脂(乳化劑)溶解到氯仿10 mL中，旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑，收集得到固體混合物；將固體混合物加熱至85 ℃(高于Compritol ATO 888的熔融溫度5 ℃)得到熔融狀透明油狀溶液，作為油相，85 ℃恒溫保存，備用；將處方量的Poloxamer 188(助乳化劑)溶解到純化水10 mL中，作為水相，加熱至85 ℃并恒溫保存，備用；在15 000 r·min-1高速剪切條件下，將水相加到油相中，并持續(xù)剪切10 min；最后將溶液進行超聲處理，超聲功率為200 W，超聲10 s，間歇5 s，連續(xù)超聲5 min，超聲結束后將溶液立即置于冰水浴中冷卻，即得到G-Rg5 SLNs。

2.2粒徑分布測定 取少量G-Rg5 SLNs溶液，用純化水稀釋，使用Malvern Zetasizer Nano-ZS納米粒徑/電位分析儀測定粒度分布，測定參數(shù)：光源為He-Ne激光器，波長為633 nm，固定角度為90°，環(huán)境溫度為25 ℃。所有樣品均測定3次，取平均值。

2.3包封率測定 取G-Rg5 SLNs溶液0.5 mL,置于25 mL量瓶中，加入甲醇10 mL破乳，振搖，使G-Rg5 SLNs完全溶解，得到透明狀溶液，加入甲醇定容，得到待測樣質量濃度(C總)；另取G-Rg5 SLNs溶液2 mL，置于尖底離心管中，以20 000 r·min-1離心60 min，吸取上層澄清透明狀溶液0.5 mL,置于25 mL量瓶中并定容，得到待測樣質量濃度(C游離)。取上述2份樣品，經(jīng)HPLC法檢測藥物含量，按照公式計算G-Rg5 SLNs的包封率[9]。

包封率=(C總-C游離)÷C總×100%。

2.4實驗設計

2.4.1Box-Behnken實驗軟件優(yōu)化處方 初步實驗表明，脂質質量濃度、乳化劑質量濃度和助乳化劑質量濃度3個變量對G-Rg5 SLNs的粒徑分布與藥物包封率起著關鍵作用。本研究以脂質質量濃度(X1)、乳化劑質量濃度(X2)和助乳化劑質量濃度(X3)作為獨立變量，以G-Rg5 SLNs的粒徑分布(Y1)與藥物包封率(Y2)作為因變量，采用Box-Behnken實驗設計優(yōu)化G-Rg5 SLNs的處方。在初步實驗的基礎上確定了脂質質量濃度、乳化劑質量濃度和助乳化劑質量濃度的低(-1)、中(0)和高(+1)3個水平(見表1)，共進行了15次實驗，結果見表2。

表1 Box-Behnken實驗設計的變量與水平Tab.1 The variables and levels in Box-Behnken experimental design

2.4.2方差分析 應用Box-Behnken實驗軟件對表2中的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結果顯示,Y1和Y2的2個模型的P值均小于0.05，表明模型顯著；Y1的R2(調整)和R2(預測)分別為0.992 7、0.968 6，Y2的R2(調整)和R2(預測)分別為0.975 2、0.928 3，R2(調整)和R2(預測)之間的差值均小于0.2，表明模型擬合良好；失擬項P值分別為0.3961、0.3441，模型預測值與實際值無顯著差異，模型擬合具有較高的可信度[10]。脂質質量濃度(X1)、乳化劑質量濃度(X2)和助乳化劑質量濃度(X3)對G-Rg5 SLNs的粒徑分布(Y1)和包封率(Y2)均具有顯著性影響(P<0.05)。見表3和表4。通過軟件生成的三維效應面圖可直觀地分析脂質質量濃度(X1)、乳化劑質量濃度(X2)和助乳化劑質量濃度(X3)與G-Rg5 SLNs的粒徑分布(Y1)和藥物包封率(Y2)之間的關系，結果見圖1和圖2。

表2 實驗設計及結果Tab.2 The experimental design and results

表3 X1、X2和X3對粒徑分布(Y1)影響的方差分析結果Tab.3 The ANOVA results of the influence of X1，X2 and X3 on particle size distribution (Y1)

表4 X1、X2和X3對包封率(Y2)影響的方差分析結果Tab.4 The ANOVA results of the influence of X1，X2 and X3 on encapsulation efficiency (Y2)

由表2可知，15次實驗制備的G-Rg5 SLNs的粒徑分布為190.2～301.5 nm。通過繪制的三維效應面圖可知，在乳化劑質量濃度恒定時，G-Rg5 SLNs的粒徑分布隨著脂質質量濃度的增加而增大，這是由于脂質質量濃度增加，體系黏度增大，粒子間易發(fā)生聚集所致[11]；在總脂質質量濃度恒定時，增加乳化劑質量濃度可減小G-Rg5 SLNs的粒徑分布，這是由于增加乳化劑質量濃度，可有效降低體系界面張力，形成的納米粒粒徑更小[12]；助乳化劑對G-Rg5 SLNs的粒徑影響與乳化劑作用效果相似。擬合得到的多元二次方程為：Y1=-357.81+53.27X1+26.51X2+31.89X3+0.08X1X2-0.41X1X3+0.42X2X3-1.59X12-1.55X22-2.42X32(R2=0.997 4)。

由表2可知，15次實驗制備的G-Rg5 SLNs的包封率為58.1%～91.9%。由圖1可知，在乳化劑質量濃度恒定時，G-Rg5 SLNs的包封率隨著脂質質量濃度的增加而增大，這是由于增加的脂質可以為藥物提供更多的溶解空間，提高了包封率[13]；在總脂質質量濃度恒定時，G-Rg5 SLNs的包封率隨著乳化劑質量濃度的增加而降低，這是由于乳化劑質量濃度增加，多余的乳化劑在溶液中以膠束形式存在，一部分藥物被包裹在膠束中，最終導致G-Rg5 SLNs中的藥物包封率降低。擬合得到的多元二次方程為：Y2=92.36-5.25X1+2.40X2-3.16X3+0.15X1X2+0.03X1X3+0.16X2X3+0.18X12-0.27X22+0.17X32(R2=0.991 2)。

2.4.3處方優(yōu)化與驗證 納米粒的粒徑大小對制劑的穩(wěn)定性、藥物釋放以及體內吸收具有關鍵作用[14]；包封率也是納米制劑質量控制的一個重要指標。本研究要求G-Rg5 SLNs的粒徑分布為最小化，包封率為最大化，通過實驗軟件獲得G-Rg5 SLNs的最優(yōu)處方為：脂質質量濃度為19.0 mg·mL-1，乳化劑質量濃度為9.0 mg·mL-1，助乳化劑質量濃度為10.0 mg·mL-1，預測粒徑分布為206.0 nm，包封率為86.8%。按照最優(yōu)處方制備3批G-Rg5 SLNs進行驗證，根據(jù)最佳處方制備了3批G-Rg5 SLNs，其粒徑分布為(212.9±12.3) nm，包封率為85.1%±2.6%，實驗值與預測值一致，證實了模型的可預測性和有效性。

2.5微觀形態(tài) 取G-Rg5 SLNs，用純化水適當稀釋，將樣品滴加到碳涂覆的銅網(wǎng)格表面，均勻鋪展，用濾紙從邊緣吸取多余的水分，自然晾干，將樣品浸泡在磷鎢酸溶液中，10 min后取出，再次用濾紙從邊緣吸取多余的水分，自然晾干，在透射電子顯微鏡下觀察G-Rg5 SLNs的微觀形態(tài)，并拍攝照片。見圖3，由圖3可知，G-Rg5 SLNs呈圓球狀，表面光滑，無聚集，分散性良好。

圖3 G-Rg5 SLNs的透射電鏡照片F(xiàn)ig.3 Transmission electron micrograph of G-Rg5 SLNs

2.6體外藥物釋放 使用膜滲析法比較了G-Rg5乙醇溶液和G-Rg5 SLNs在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中的體外藥物釋放特征，釋放介質中加入質量濃度為5 mg·mL-1的吐溫80作為增溶劑。將G-Rg5 SLNs和G-Rg5乙醇溶液(含藥量均為5 mg·mL-1)各2 mL加入到處理好的透析袋(截留相對分子質量為12 000～15 000 Da)中，綁緊兩端，浸入到100 mL釋放介質中，水浴溫度為(37.0±0.5) ℃，以50 r·min-1磁力攪拌，在規(guī)定的時間點(0、1、2、3、4、6、8、12、24 h)取出3 mL釋放介質(并補加等量的新鮮釋放介質)，經(jīng)適當稀釋，通過HPLC法測定G-Rg5的質量濃度，計算藥物累積釋放度并繪制釋放曲線。見圖4。

圖4 G-Rg5乙醇溶液和G-Rg5 SLNs的體外藥物釋放曲線 (n=6)Fig.4 The in vitro drug release curves of G-Rg5 ethanol solution and G-Rg5 SLNs (n=6)

G-Rg5 SLNs和G-Rg5乙醇溶液的體外藥物釋放曲線見圖5，G-Rg5乙醇溶液中藥物可在4 h內釋放完全；而G-Rg5 SLNs中藥物釋放呈雙相模式，初始藥物釋放為突釋，即在前4 h內藥物釋放較快，釋放量為43.9%±2.6%，之后藥物持續(xù)緩慢釋放，直到24 h藥物總釋放量為83.4%±3.5%，前期突釋是由于游離的和吸附在G-Rg5 SLNs表面的藥物釋放，而后期是由包裹在納米粒內部藥物被緩慢釋放出[15]。

2.7抑瘤效果研究 采用MTT法比較G-Rg5原料藥和G-Rg5 SLNs對Hela細胞的體外抑制效果[6]。見圖5。將Hela細胞系接種到10%胎牛血清(含有0.1 g·L-1青霉素/鏈霉素)培養(yǎng)液中，放置在37 ℃、相對濕度為95%、體積分數(shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，取處于生長期的Hela細胞，以每孔5×103個細胞的密度接種在96孔板中，孵育24 h后，各孔中分別加入G-Rg5溶液(以5 mg·mL-1吐溫80作為溶劑)和G-Rg5 SLNs，質量濃度分別為10、25、50、75、100 μg·mL-1，每個藥物質量濃度設置3個復孔，另選3孔加入5 mg·mL-1吐溫80溶液作為空白對照，將細胞在37 ℃下孵育48 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液，在37 ℃下孵育4 h，加入二甲基亞砜溶解甲臜沉淀，使用酶標儀測量(檢測波長為490 nm)各孔的吸光度值A，同時以未加藥物組作為對照組，不含細胞組作為空白組，按照公式計算細胞存活率。細胞存活率=[(A實驗組-A空白)÷(A對照組-A空白)]×100%。

圖5 G-Rg5原料藥和G-Rg5 SLNs對Hela細胞抑制作用比較 (n=3)Fig.5 Comparison of the inhibitory effects of G-Rg5 API and G-Rg5 SLNs on Hela cells (n=3)

由圖5可知，G-Rg5原料藥和G-Rg5 SLNs對Hela細胞的抑制作用均隨藥物質量濃度的增加而增強，說明G-Rg5對Hela細胞的抑制作用具有質量濃度依賴性；另外，在藥物質量濃度相同的情況下，G-Rg5 SLN對Hela細胞的抑制作用均高于G-Rg5原料藥，這可能是由于G-Rg5 SLNs的粒徑較小，與Hela細胞之間存在較強的吸附作用，被細胞吸附后通過胞吞作用進入細胞內部而發(fā)揮藥效，表現(xiàn)出比G-Rg5原料藥更強的抗腫瘤活性[16]。

3 討論

固體脂質納米粒(SLNs)是由活性藥物分子以及固體脂質、乳化劑和(或)助乳化劑組成，具有以下潛在優(yōu)勢[17]：所選用的輔料均可生物降解，毒性低，生物相容性好；藥物以分子狀態(tài)包裹或夾嵌于類脂核中，提高了藥物的溶解度，進而增加了藥物的生物利用度；粒徑通常在10～1 000 nm范圍內，能夠提高藥物的靶向性作用。因此，SLNs已成為一種具有極大開發(fā)潛力的納米粒給藥系統(tǒng)[18-19]。本研究采用熱熔乳化超聲-低溫固化法制備G-Rg5 SLNs，以提高G-Rg5的溶解度，增加其抗腫瘤效果。前期預實驗研究顯示，脂質質量濃度、乳化劑質量濃度、助乳化劑質量濃度對G-Rg5 SLNs的粒徑分布和藥物包封率影響較顯著，最終通過Box-Behnken實驗設計優(yōu)化得到G-Rg5 SLNs的最佳處方，其粒徑分布為(212.9±12.3) nm，包封率為85.1%±2.6%，通過透射電鏡可觀察到G-Rg5 SLNs呈圓球狀、表面光滑。體外藥物釋放研究結果顯示，G-Rg5 SLNs在前期釋藥較快，后期釋藥較平緩。體外藥效學研究表明，G-Rg5原料藥和G-Rg5 SLNs對Hela細胞均表現(xiàn)出良好的抑制效果，且G-Rg5 SLN對Hela細胞的抑制作用要高于G-Rg5原料藥。本研究為進一步開展動物體內藥效學評價奠定了初步的實驗基礎。