LC-MS/MS法測(cè)定跌打酒中9種成分及主成分分析

藍(lán)曉慶，韋瑀龍，陸蘭娟

0 引言

跌打酒是廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由制馬錢(qián)子、大黃、三七、續(xù)斷、乳香、沒(méi)藥、蘇木、澤蘭、土鱉蟲(chóng)、自然銅、無(wú)名異等十多味中藥所組成，具有活血止痛，通絡(luò)化瘀的功效，臨床觀察研究表明[1-3]，該藥用于跌打損傷，關(guān)節(jié)疼痛，四肢麻木等癥療效顯著。方中馬錢(qián)子通絡(luò)止痛，散結(jié)消腫，具有鎮(zhèn)痛、促進(jìn)骨折愈合、修復(fù)軟骨損傷和抗骨質(zhì)增生的藥理作用[4]；大黃涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》有言：本品主下瘀血、血閉、寒熱、破癥瘕積聚；三七散瘀止血，消腫定痛，以上三者均為跌打損傷的常用要藥。

本研究嘗試采用液質(zhì)聯(lián)用色譜法在同一色譜質(zhì)譜條件下測(cè)定跌打酒中來(lái)源于馬錢(qián)子(馬錢(qián)子堿和士的寧)、大黃(大黃酸、大黃酚、大黃素和大黃素甲醚)和三七(三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1)的9種成分，并進(jìn)行主成分分析，經(jīng)查閱文獻(xiàn)未見(jiàn)有上述9個(gè)成分同時(shí)測(cè)定方法的報(bào)道，本方法的開(kāi)發(fā)建立可為跌打酒或類似制劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

超聲波清洗機(jī)(VGT-2227QTD，廣東固特超聲股份有限公司)，電子分析天平(GR-202，日本)，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS TripleQuad 3500)；馬錢(qián)子堿(批號(hào)：MUST-17041906)、士的寧(批號(hào)：MUST-17053001)對(duì)照品購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司；大黃酸(批號(hào)：0757-200206)、大黃酚(批號(hào)：110796-200412)、大黃素(批號(hào)：110756-200110)、大黃素甲醚(批號(hào)：110704-200420)、三七皂苷R1(批號(hào)：110745-200415)、人參皂苷Rb1(批號(hào)：110704-200420)、人參皂苷Rg1(批號(hào)：110703-201731)對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱kinetex C18(50 mm × 3 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～1.0 min,90.0%A;1.0～1.5 min,90.0%～80.0%A;1.5～5.0 min,80.0%～55.0%A;5.0～7.0 min,55.0%～8.0%A;7.0～9.0 min,8.0%A;9.0～9.1 min,8.0%～90.0%A;9.1～11.0 min,90.0%A)；流速0.35 ml/min，柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μl。質(zhì)譜條件：離子源為ESI；檢測(cè)模式：正、負(fù)離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：500.0 ℃。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 9種成分的質(zhì)譜參數(shù)[5-7]

圖1 9種成分的提取離子流色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

2.2.1 精密稱取馬錢(qián)子堿、士的寧、大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對(duì)照品適量，分別置10 ml量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，分別得到濃度為1.0 mg/ml的對(duì)照品貯備液。再分別精密量取對(duì)照品貯備液適量，以甲醇依次稀釋成濃度為100 μg/ml，10 μg/ml，1 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 精密吸取馬錢(qián)子堿、士的寧、三七皂苷R1對(duì)照品溶液適量至25 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得含馬錢(qián)子堿、士的寧、三七皂苷R1均為1 μg/ml的混合對(duì)照品溶液A。

2.2.3 精密吸取大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液適量至25 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得含大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1均為1 μg/ml的混合對(duì)照品溶液B。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚供試品溶液 精密量取跌打酒1.0 ml，至50 ml量瓶中，加甲醇-水(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 馬錢(qián)子堿、士的寧、三七皂苷R1供試品溶液 精密量取“2.3.1”項(xiàng)的供試品溶液10.0 ml，至50 ml量瓶中，加甲醇-水(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1供試品溶液 精密量取“2.3.1”項(xiàng)的供試品溶液1.0 ml，至50 ml量瓶中，加甲醇-水(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 線性關(guān)系 精密吸取混合對(duì)照品溶液A適量，甲醇-水(1∶1)稀釋成對(duì)照品濃度為80、100、150、200、400、600、800 ng/ml系列梯度，在“2.1”項(xiàng)下條件下進(jìn)樣測(cè)定；精密吸取混合對(duì)照品溶液B適量，甲醇-水(1∶1)稀釋成對(duì)照品濃度為20、50、80、100、150、200、400 ng/ml系列梯度，在“2.1”項(xiàng)下條件下進(jìn)樣測(cè)定。上述測(cè)定結(jié)果以濃度(ng/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分的線性回歸方程

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，進(jìn)樣，測(cè)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液A、B，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，測(cè)定方法的重復(fù)性和儀器精密度良好，且供試品溶液在12 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取同一已知含量的樣品0.5 ml，按表4供試品溶液制備方法分別制備各成分加樣回收試驗(yàn)用供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 加樣回收供試液制備

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

取10批跌打酒樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法分別平行制備供試品2份，在“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 10批樣品的測(cè)定結(jié)果(μg/ml)

2.10 主成分分析 以SPSS 19.0 對(duì)上述測(cè)定的9個(gè)成分進(jìn)行主成分分析，計(jì)算其特征值和方差貢獻(xiàn)率，以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn)，得出前三個(gè)主成分因子特征值分別為4.125、2.435、1.280，是評(píng)價(jià)跌打酒質(zhì)量的主要影響因子，三個(gè)主成分因子的方差貢獻(xiàn)率為87.106%，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 主成分因子的特征值及方差貢獻(xiàn)率

表8 旋轉(zhuǎn)后的主因子載荷矩陣表

表9 10批樣品的主成分因子綜合得分及排序

3 討論

中藥制劑尤其是復(fù)方制劑成分復(fù)雜，采用單一成分的含量評(píng)價(jià)制劑質(zhì)量有所欠缺，而采用高效液相色譜法測(cè)定多個(gè)成分雖較易于普及，但耗時(shí)較長(zhǎng)，且部分成分因結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異較大，在同一色譜條件下的分離度不甚理想，而液質(zhì)聯(lián)用色譜法能進(jìn)一步通過(guò)提取相應(yīng)成分的特征離子流，所以其定性與定量受樣品色譜分離度的影響不大。

前期試驗(yàn)考察以0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相，人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1色譜峰響應(yīng)低、干擾大，改成0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇后，不僅能有效改善人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1色譜行為，同時(shí)不影響其他成分的檢測(cè)。

從主成分分析結(jié)果來(lái)看，測(cè)定的10批樣品中，前期生產(chǎn)的6個(gè)批次中部分成分含量的批間波動(dòng)較大，而后期生產(chǎn)的4個(gè)批次(即20171121、20180228、20180825、20190114)批間成分含量差異小，且整體質(zhì)量更好，這可能與近年來(lái)國(guó)家加強(qiáng)對(duì)中藥飲片的監(jiān)管有關(guān)，使得購(gòu)進(jìn)的原料質(zhì)量有所保障，進(jìn)而保證了產(chǎn)品質(zhì)量。