王怡夢,劉雪姣，王 倩,魏 慶，竇彩霞，尚智援，喬家運，李海花*

(1.天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津市農業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2.天津師范大學生命科學學院，天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387)

沙門菌(Salmonella)是一種寄生在人和動物腸道中的人畜共患病原菌，血清型繁多且致病性強，可引起人類食物中毒，以及幼齡動物胃腸炎、敗血癥等。6月齡以下斷奶仔豬較易感沙門菌，其中l(wèi)～4月齡多發(fā)，感染后可出現(xiàn)豬副傷寒等疾病。沙門菌作為一種主要的腸道致病菌，通常直接侵襲宿主的特殊抗原捕獲M細胞或腸上皮細胞，破壞腸道的緊密連接[1]。緊密連接(tight junction TJ)是腸上皮細胞間的重要連接方式，緊密連接蛋白1(ZO-1)和閉合蛋白(Occludin)是其中兩種重要的緊密連接蛋白，影響腸道通透性，對于腸道黏膜的損傷修復十分關鍵。當病原菌感染腸上皮細胞后，緊密連接蛋白的表達量下降，腸道通透性增加，病原菌突破上皮屏障并進入腸道細胞后，引起仔豬腹瀉或腸道炎癥等疾病[2]。因此，研究ZO-1和Occludin在病原菌感染下的表達變化有助于了解病原菌對豬腸道屏障的影響。

核因子-κB(NF-κB)信號通路是機體內免疫調節(jié)的經典通路，當宿主細胞受到細菌感染后，細胞表面的模式識別受體識別病原體相關分子模式，將侵襲信號傳遞給免疫細胞，誘導NF-κB表達增加，刺激細胞因子的分泌，從而激活炎癥反應[3]。革蘭陰性菌釋放的脂多糖(LPS)進入機體，引起緊密連接蛋白異常表達，腸道屏障損傷后，內毒素等穿過腸壁，誘導活化細胞表面Toll樣受體4(TLR4)激發(fā)下游的NF-κB信號通路，進而促進促炎性細胞因子(IL-8和TNF-α等)的合成與釋放，繼而加重腸道的損傷[4]。Wnt/β-catenin信號通路是一條和機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)密切相關且高度保守的信號通路，參與細胞增殖與凋亡、炎癥反應等活動[5]。當細菌感染機體時，β-catenin能調控細胞周期蛋白D1(cyclinD1)和原癌基因(c-Myc)等靶基因的轉錄，cyclin D1和c-Myc是細胞增殖的重要調控因子，其上調能促進豬腸上皮細胞的增殖，從而抑制細胞凋亡[6]。用銅綠假單胞菌感染小鼠的巨噬細胞以及角膜上皮細胞后，激活了Wnt/β-catenin信號通路，β-catenin蛋白表達量下降，引起細胞損傷[7]。但是，關于沙門菌引致細胞損傷與NF-κB/β-catenin信號通路之間的關系報道較少。

本試驗以豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)為體外模型，研究了沙門菌對IPEC-J2的損傷作用，以及NF-κB/β-catenin信號通路在沙門菌引致細胞損傷中的作用，有助于深入了解沙門菌引致小腸上皮細胞損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和菌株

IPEC-J2細胞株購自上海冠導生物工程有限公司；豬霍亂沙門菌自腸炎仔豬糞便中分離，由天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院預防獸醫(yī)學實驗室保存。

1.2 主要試劑

RPMI Medium 1640 基礎培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶EDTA消化液均購自美國Gibco公司，PBS緩沖液、青鏈霉素和DMSO均購自北京索萊寶生物公司。豬白細胞介素-8(IL-8)、豬腫瘤壞死因子(TNF-α)和豬乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒均購自美國BD公司。DNA和RNA核酸萃取試劑盒、反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自美國GeneCpoeia公司。

1.3 沙門菌的培養(yǎng)與計數

將沙門菌接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，8 000 r·min-1離心5 min收集菌泥，然后，用滅菌生理鹽水洗滌菌沉淀3次，再加入適量的生理鹽水制成菌懸液。對菌懸液進行倍比稀釋，采用懸滴法接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后進行菌落總數(cfu)計數，確定沙門菌菌液的濃度。

1.4 IPEC-J2的復蘇、傳代和培養(yǎng)

從液氮中取出凍存細胞，迅速置于37 ℃水浴中融化大約1 min，經1 000 r·min-1離心1 min后棄去凍存液，再加入1 mL完全培養(yǎng)液重懸細胞。將4 mL 含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM-1640細胞完全培養(yǎng)液倒入6 mm的培養(yǎng)皿，把細胞均勻接種到培養(yǎng)皿中，放入5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

當細胞融合度達到80%～90%便可以傳代，將細胞培養(yǎng)上清倒掉，用不含血清的DMEM-1640細胞培養(yǎng)液洗去死細胞等，再加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，晃動平皿使其均勻浸沒培養(yǎng)皿整個底部，放入培養(yǎng)箱中消化1～2 min。然后用顯微鏡觀察，若細胞不貼壁且形態(tài)呈圓形，即可加入4 mL完全培養(yǎng)液終止其消化，然后用移液槍輕輕吹打細胞使其脫落下來。將消化好的細胞懸液轉移到5 mL離心管中，1 000 r·min-1離心3 min，棄上清，用3 mL完全培養(yǎng)液重懸細胞，然后加入到含有適量培養(yǎng)液的100 mm培養(yǎng)皿中，靜置培養(yǎng)。

1.5 引物設計與合成

根據NCBI數據庫中豬NF-κBp65、β-catenin、cyclinD1和c-Myc基因的全序列，使用Primer Premier 5軟件設計引物，引物序列見表1。另外，ZO-1、Occludin和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的熒光定量PCR引物序列參考李?；ǖ萚8]的文獻報道。引物委托上海生工生物工程有限司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.6 熒光定量PCR

采用熒光定量PCR(qPCR)檢測ZO-1、Occludin、NF-κBp65、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和GAPDH的表達。方法參照李海花等[8]的文獻報道，簡述如下：用TacoTMRNA試劑盒中的裂解液收集并裂解待分析的細胞樣品，嚴格按照試劑盒操作說明提取IPEC-J2細胞中總RNA，按照All-in-OneTMFirst cDNA Synthesis試劑盒說明書操作步驟將總RNA逆轉錄為cDNA。按照SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒操作說明進行qPCR反應體系的配制：上、下游引物各2 μL，all-in-one qPCR Mix (2×) 10 μL，cDNA 3 μL，補加DEPC處理的滅菌水至20 μL。qPCR反應條件：95 ℃ 預變性10 min；95 ℃變性10 s，62 ℃或64 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)；熔解曲線條件為72 ℃ 10 s、+0.3 ℃和95 ℃ 10 s。每個樣品均設置未經逆轉錄的模板作為陰性對照，同時，每個樣品均設置相應的內參作為對照，得到各自的熒光閾值循環(huán)數(Ct值)，采用相對定量法2-ΔΔCt進行計算。

1.7 沙門菌引起IPEC-J2損傷

將IPEC-J2細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細胞融合度達到80%，使用沙門菌(1×103CFU·mL-1) 刺激IPEC-J2細胞3、6、12和24 h， 同時，設置未處理只加細胞培養(yǎng)液的對照組，每組3個重復。到達刺激時間后，用無菌管收集培養(yǎng)上清液，3 000 r·min-1離心20 min，仔細收集上清，用于分析LDH的含量。細胞的損傷程度通過檢測細胞培養(yǎng)上清液中LDH的含量、貼壁細胞中LDH的含量以及漂浮培養(yǎng)液凋亡小體中LDH的含量而決定，細胞毒性(%)=培養(yǎng)上清液中LDH含量/總LDH含量×100，仔細收集細胞培養(yǎng)上清液和凋亡小體以及貼壁細胞，再嚴格按照LDH的ELISA檢測試劑盒說明書進行LDH的檢測。上清液收集完畢后，用PBS清洗兩遍培養(yǎng)板中的細胞，每孔中加入200 μL的細胞裂解液，用于提取細胞中的RNA，采用上述qPCR方法分析ZO-1和Occludin的表達。

1.8 沙門菌感染IPEC-J2后對NF-κB/β-catenin信號通路的影響

將IPEC-J2細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細胞至融合度達到80%，按照上述“1.7”中方法用沙門菌處理細胞，并在刺激細胞3、6、12和24 h后收集培養(yǎng)上清液和細胞裂解液。嚴格按照豬白細胞介素-8(IL-8)和豬腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA檢測試劑盒的說明書對細胞培養(yǎng)液中的促炎性細胞因子進行檢測。采用“1.6”的方法檢測細胞中NF-κBp65、β-catenin、cyclinD1和c-Myc的表達。

1.9 NF-κB信號通路在沙門菌引起IPEC-J2損傷中的作用

將IPEC-J2細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細胞融合度達到80%，使用10 μmol·L-1的NF-κB抑制劑BAY11-7082或二甲基亞砜(DMSO)處理細胞1 h，再用1 × 103CFU·mL-1的沙門菌刺激IPEC-J2細胞，刺激6、12和18 h后收集細胞及其培養(yǎng)上清液。試驗分組包括只加細胞培養(yǎng)液的空白對照組、DMSO單獨處理組、抑制劑單獨處理組、DMSO處理細胞后用沙門菌刺激組、抑制劑處理細胞后用沙門菌刺激組，每組3個重復。按照上述ELISA方法檢測LDH、TNF-α和IL-8含量，以及qPCR方法檢測細胞中NF-κBp65，ZO-1和Occludin的表達。

1.10 β-catenin信號通路在沙門菌引起IPEC-J2損傷中的作用

根據豬β-catenin全基因序列，委托上海生工生物工程有限公司設計合成特異性的siRNA。siRNA-β-catenin 序列：正向5′-GCAGCUGGAAUUCUUUCUATT-3′，反向5′-UAGAAAGAAUUCCAGCUGCTT-3′。陰性對照(siRNA-NC)序列：正向5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。將IPEC-J2細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細胞融合度達到80%，使用Lipofectamine 2000轉染試劑按照說明書進行siRNA轉染，轉染后24 h收獲細胞，按照上述qPCR方法分析β-catenin的表達。同時，設置陰性對照轉染組。干擾效率分析表明，siRNA-β-catenin的干擾效率高達84.6%。

將IPEC-J2接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細胞融合度達到80%，用siRNA-β-catenin或siRNA-NC轉染IPEC-J2細胞6 h后，再用沙門菌刺激細胞，分別在細菌刺激后6、12和18 h收集細胞及其培養(yǎng)上清液。試驗分組包括只加細胞培養(yǎng)液的空白對照組、siRNA-NC單獨轉染組、siRNA-β-catenin單獨轉染組、siRNA-NC轉染細胞后再用沙門菌刺激細胞組、siRNA-β-catenin轉染細胞后再用沙門菌刺激細胞組，每組3個重復。按照ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液中LDH含量，以及qPCR方法檢測細胞中β-catenin、cyclinD1和c-Myc的表達。

1.11 數據處理

使用Excel和SPSS 20.0軟件對數據進行整理和統(tǒng)計分析，采用單因素ANOVA法進行方差分析以及t檢驗進行組間差異顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示無顯著差異。另使用GraphPad Prism 5軟件進行圖像制作。

2 結 果

2.1 沙門菌引起IPEC-J2損傷

用沙門菌刺激IPEC-J2，分析沙門菌是否引起IPEC-J2損傷，結果見圖1。由圖1可知，試驗組與對照組相比，ZO-1和OccludinmRNA表達量在6和24 h均極顯著下調(P<0.01)，并且在24 h表達量降低最多，表現(xiàn)為ZO-1和Occludin分別是對照組表達量的40%和45%；LDH的釋放量在6 h時極顯著高于對照組(P<0.01)，并且隨著沙門菌作用時間的延長，LDH的釋放量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。此試驗結果顯示，沙門菌抑制了IPEC-J2緊密連接蛋白的表達，影響了細胞的屏障功能，導致細胞損傷。

肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), while with the same letter superscript means no significant difference (P>0.05). The same as below圖1 沙門菌引致IPEC-J2損傷Fig.1 Salmonella caused IPEC-J2 damage

2.2 沙門菌感染IPEC-J2后對NF-κB/β-catenin信號通路的影響

用沙門菌刺激IPEC-J2，分析沙門菌對NF-κB/β-catenin信號通路的影響，結果見圖2。由圖2A、2B和2C可知，與對照組相比，試驗組TNF-α和IL-8的含量分別在感染后的3和6 h極顯著升高(P<0.01)，并且均隨著感染時間的延長而呈極顯著增加(P<0.01)；而試驗組NF-κBp65的表達水平在感染后1 h極顯著高于對照組(P<0.01)，并且隨著感染時間的延長也呈極顯著增加(P<0.01)。由圖2D、2E和2F可知，與對照組相比，cyclinD1和c-Myc基因的表達量在3 h差異不顯著(P>0.05)，在6和12 h差異顯著(P<0.05)，在24 h呈現(xiàn)極顯著下降(P<0.01)；β-catenin的表達水平在3、6和12 h差異不顯著(P>0.05)， 在24 h呈現(xiàn)極顯著下降(P<0.01)。這些數據表明，沙門菌激活了NF-κB 信號通路，引發(fā)了細胞炎性反應，此炎癥反應強度可能超過了細胞自身調節(jié)能力，使細胞出現(xiàn)了炎癥損傷；與此同時，沙門菌抑制了β-catenin信號通路，細胞增殖相關蛋白表達下降，減慢了細胞修復的速度，因而細胞損傷速度大于細胞修復速度，最終呈現(xiàn)出細胞損傷。

圖2 沙門菌對IPEC-J2中NF-κB/β-catenin信號通路的影響Fig.2 Effect of Salmonella on NF-κB/β-catenin signaling pathway in IPEC-J2

2.3 NF-κB信號通路在沙門菌引起IPEC-J2損傷中的作用

采用NF-κB抑制劑處理細胞，以確定NF-κB信號通路在沙門菌引致IPEC-J2損傷中的作用，結果見圖3。由圖3可知，與空白對照組相比，DMSO處理組的NF-κBp65的表達水平在各時間點無顯著差異(P>0.05)，而抑制劑處理組的NF-κBp65表達水平在各時間點均呈現(xiàn)極顯著下降(P<0.01)；DMSO處理組和抑制劑處理組的ZO-1、Occludin、TNF-α、IL-8和LDH的含量在各時間點均無顯著差異(P>0.05)，DMSO+沙門菌處理組的NF-κBp65、TNF-α、IL-8和LDH的含量在各時間點均極顯著上升(P<0.01)，ZO-1和Occludin在各時間點卻均呈極顯著下降(P<0.01)；與DMSO+沙門菌處理組相比，抑制劑+沙門菌處理組的ZO-1的表達水平在各時間點均呈極顯著升高(P<0.01)，Occludin表達水平在12和18 h也均呈極顯著增高(P<0.01)，同時，伴隨NF-κBp65、TNF-α和IL-8的表達以及LDH釋放量在各時間點均呈極顯著降低(P<0.01)。此試驗結果表明，抑制NF-κB 信號通路可以減輕沙門菌引起的IPEC-J2損傷，NF-κB信號通路在沙門菌引致IPEC-J2損傷中發(fā)揮著一定的作用。

圖3 NF-κB信號通路參與沙門菌引起IPEC-J2損傷Fig.3 NF-κB signaling pathway involved in Salmonella-induced IPEC-J2 damage

2.4 β-catenin信號通路在沙門菌引起IPEC-J2損傷中的作用

采用小干擾RNA沉默IPEC-J2中β-catenin基因表達，以確定β-catenin信號通路在沙門菌引致IPEC-J2損傷中的作用，結果見圖4。由圖4可知，與空白對照組相比，陰性對照組(siRNA-NC組)的β-catenin、cyclinD1和c-Myc表達量以及LDH的釋放量在各時間點均無顯著差異(P>0.05)，siRNA-β-catenin單獨處理組、siRNA-NC+沙門菌處理組和siRNA-β-catenin+沙門菌處理組的β-catenin、cyclinD1和c-Myc的表達量在各時間點均呈極顯著降低(P<0.01)；與空白對照組相比，siRNA-β-catenin組、siRNA-NC+沙門菌處理組和siRNA-β-catenin+沙門菌處理組的LDH釋放量在各時間點均呈極顯著增加(P<0.01)；與siRNA-NC+沙門菌處理組相比，siRNA-β-catenin+沙門菌處理組的β-catenin、cyclinD1和c-Myc的表達量在各時間點均呈極顯著降低(P<0.01)，LDH釋放量在6和12 h均呈極顯著增加(P<0.01)，在18 h呈增加趨勢但差異不顯著(P>0.05)。此試驗結果表明，抑制β-catenin信號通路可以加重沙門菌引起的IPEC-J2損傷，β-catenin信號通路在沙門菌引致IPEC-J2損傷中的發(fā)揮著一定作用。

圖4 β-catenin信號通路參與沙門菌引起IPEC-J2損傷Fig.4 β-catenin signaling pathway involved in Salmonella-induced IPEC-J2 damage

3 討 論

緊密連接是由跨膜和膜相關蛋白組成的多蛋白復合物，在腸道上皮屏障中發(fā)揮著重要作用，多種生理、病理因素參與改變緊密連接結構的功能[9]。LDH是一種存在于機體所有組織細胞中胞質內的酶，一旦細胞被損傷破壞，LDH被釋放且含量升高。LDH常用來反映組織細胞的損傷以及損傷程度。本試驗利用沙門菌感染IPEC-J2細胞，細胞中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達量降低，培養(yǎng)上清液中LDH含量增加，表明緊密連接結構發(fā)生改變，細胞屏障功能受到破壞，IPEC-J2細胞受損。

NF-κB是一種多效轉錄調節(jié)因子，可以調控宿主細胞中細胞因子或炎癥介質的基因轉錄，在炎癥反應中起關鍵作用[10]。Lei等[11]利用體外巨噬細胞和體內小鼠模型，分析了鼠傷寒沙門菌毒力因子SrfA引起的炎癥反應與NF-κB信號通路的關系，與野生型鼠傷寒沙門菌相比，SrfA缺陷型菌株能夠抑制巨噬細胞中NF-κB的活化，降低小鼠炎癥反應，提高小鼠存活率。這表明，鼠傷寒沙門菌引起的炎癥反應與NF-κB信號通路的激活有一定的關系，并且這種炎性反應與毒力因子SrfA有關系。本試驗所用的沙門菌分離株來自腸炎仔豬糞便，經生化試驗和16S rRNA鑒定后，確定該菌株為豬霍亂沙門菌，并且該菌株對小鼠具有很強的致病性(數據待發(fā)表)。本試驗發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路被抑制后，豬霍亂沙門菌能夠降低IPEC-J2中NF-κBp65的mRNA表達，以及促炎性細胞因子IL-8、TNF-α的表達和LDH的釋放，減輕了細胞損傷。這說明，本試驗所用的豬霍亂沙門菌引起的炎癥反應與NF-κB信號通路的活化有關，但是本試驗所用豬霍亂沙門菌分離株是否具有毒力因子SrfA暫時還不清楚，需要進一步深入研究。除了發(fā)現(xiàn)豬霍亂沙門菌分離株對小鼠具有致死性外，本研究還發(fā)現(xiàn)，該菌株對IPEC-J2也具有很強的致死性。在本研究前期試驗中，分別用濃度為1 × 102CFU·mL-1(低劑量)、1 × 103CFU·mL-1(中劑量)和1 × 104CFU·mL-1(高劑量)的豬霍亂沙門菌刺激IPEC-J2細胞，刺激細胞后6 h通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)和檢測LDH的含量來分析該菌株對細胞的損傷。結果發(fā)現(xiàn)，與未刺激的對照組相比，3種劑量的沙門菌對細胞的毒性均顯著增強，其中高劑量沙門菌作用細胞6 h后，可見大量細胞不再貼壁而是呈圓形漂浮在培養(yǎng)液中，而中劑量和低劑量沙門菌作用細胞6 h后，細胞仍可貼壁生長并且無可見的形態(tài)變化。這說明，分離株作用劑量為1×104CFU·mL-1時能夠嚴重損傷細胞，對IPEC-J2具有很強的致死性，故在本試驗中，我們選擇1×103CFU·mL-1的作用劑量來研究沙門菌引致IPEC-J2細胞損傷。

在機體被細菌感染時，TLRs會通過不同機制激活相關的下游信號通路，NF-κB信號通路的激活和促炎細胞因子的表達與細胞中TLR4的激活有關[12]。以感染產腸毒素大腸桿菌(ETEC)的仔豬為實驗模型，分析嗜酸乳桿菌在NF-κB信號通路中的作用，試驗結果為嗜酸乳桿菌通過抑制ETEC誘導的TLR4的表達來抑制NF-κB信號通路的激活，以此減輕ETEC引起的炎癥反應[13]。在炎性腸病動物中也觀察到NF-κB的表達增加，特別是在黏膜巨噬細胞和上皮細胞中，同時伴有促炎細胞因子(如IL-8、TNF-α)的增加[14]。前人以IPEC-J2為研究對象，驗證環(huán)境中廣泛分布的沙門菌菌株滲透和調節(jié)細胞先天免疫的能力，結果顯示，有3種沙門菌具有獨特的滲透IPEC-J2細胞的能力，且細胞因子IL-8、TNF-α的表達上調，與本試驗結果一致，同時，此試驗結果也證實了，IPEC-J2細胞是評估宿主-腸道-病原菌相互作用的一個實用模型，并表明，IL-8和TNF-α可能是沙門菌侵襲腸道細胞的預測指標[15]。

目前，與Wnt/β-catenin信號通路有關的研究較多，以沙門菌引起的結腸炎小鼠為試驗模型，分析沙門菌對腸道干細胞的調節(jié)發(fā)現(xiàn)，沙門菌激活了Wnt/β-catenin信號通路，沙門菌蛋白AvrA調節(jié)Wnt信號，β-catenin的表達上調，激活了Wnt/β-catenin的轉錄活性[16]。本試驗應用沙門菌感染IPEC-J2細胞，β-catenin的表達量與其調控的靶基因cyclinD1和c-Myc均下降，表示β-catenin信號通路的下調參與沙門菌引起IPEC-J2細胞的損傷。這一結果雖與上述研究結果不一致，但有前人闡述，對于β-catenin發(fā)揮抗炎或促炎作用取決于刺激細胞的類型以及與其他信號通路的串擾[17]。Wnt/β-catenin信號通路可以通過抑制或激活NF-κB信號通路，參與炎癥反應[18]。敲除小鼠樹突狀細胞中的β-catenin，用LPS感染細胞，結果顯示，激活了NF-κB信號通路和促炎細胞因子的表達，炎癥反應增強；此研究揭示了β-catenin的抗炎作用，表明Wnt/β-catenin信號通路或許通過不同的機制對NF-κB的活性產生抑制作用[19]。

Wnt/β-catenin信號通路是生物體中普遍存在的調節(jié)細胞增殖和細胞分化的重要信號通路之一，在生長發(fā)育等生理過程和腫瘤等病理過程中發(fā)揮著重要作用。RNA干擾技術作為一種強大的反基因技術，已廣泛應用于沉默相關基因的表達。應用siRNA沉默β-catenin基因來阻斷Wnt/β-catenin信號通路，結果顯示，下調β-catenin的表達抑制了腎小管上皮細胞轉分化，減輕了腎小管上皮細胞組織纖維化[20]。本試驗應用siRNA干擾IPEC-J2細胞中β-catenin的表達，再用沙門菌刺激細胞，結果顯示，細胞增殖相關蛋白cyclinD1和c-Myc的表達量下降，可能減緩了損傷細胞的修復，致使LDH釋放量增加，由此可見，豬霍亂沙門菌感染IPEC-J2后，β-catenin信號通路的下調加重了IPEC-J2細胞的損傷。本試驗通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化證實，該信號通路在豬霍亂沙門菌致病性中發(fā)揮重要的作用。有相似研究利用痢疾志賀菌感染的大鼠回腸環(huán)模型，分析了β-catenin和NF-κB信號通路在炎癥反應中的作用發(fā)現(xiàn)，痢疾志賀菌促進β-catenin降解和NF-κB信號通路的活化，從而促炎性細胞因子TNF-α和IL-8的生成，引致大鼠回腸炎癥，此研究還表明，β-catenin是炎癥反應的一個重要調節(jié)蛋白[21]。

4 小 結

本試驗用沙門菌感染IPEC-J2后，細胞緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達量下降，細胞屏障功能受損，細胞培養(yǎng)液中LDH含量增高；激活了NF-κB 信號通路，促進了TNF-α和IL-8表達，細胞發(fā)生炎癥反應，造成IPEC-J2損傷，NF-κB信號通路被抑制后，能夠降低NF-κB表達量，減輕細胞損傷；沙門菌抑制了Wnt/β-catenin信號通路，降低了β-catenin、cyclinD1和c-Myc表達，減緩了損傷細胞的修復，用siRNA沉默β-catenin的表達后，β-catenin 信號通路的下調進一步加重細胞損傷。綜上所述，沙門菌通過激活NF-κB信號通路和抑制β-catenin 信號通路引致IPEC-J2損傷。