王澤琛 肖 榮 歐陽樂軍* 李莉梅 梁楚炎 潘璟茵 劉智超

（1. 喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點實驗室，喀什 844000；2. 廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，茂名 525000）

植物生命活動的正常代謝由激素調(diào)控，其影響著植物的生命周期中的全過程。植物激素包括有生長素（auxin）、細(xì)胞分裂素（cytokinin，CK）、赤霉 素（gibberellin，GA）、脫 落 酸（abscisic acid，ABA）、油菜素甾醇類（brassinosteroids，BRs）、乙烯（ethylene，Eth）、茉莉酮酸酯類（jasmonates，JAs）、多胺（polyamines，PAs）以及水楊酸類（salicylic acid，SAs）等九大類［1］，這些激素在植物體內(nèi)構(gòu)成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控著植物生命周期中的各階段。

細(xì)胞分裂素氧化酶（cytokinin oxidase，CKX）在20 世紀(jì)70 年代首次發(fā)現(xiàn)于煙草的髓組織培養(yǎng)物粗勻漿中，之后隨著研究的深入在菜豆、蠶豆、小麥和玉米中相繼被報道［2］。CKX 是一種黃素酶，對DNA 的次級代謝產(chǎn)物—細(xì)胞分裂素（CK）有著很強(qiáng)的專一性。CKX 是目前已知的專一降解天然異戊烯類CK 及其核苷的酶，該反應(yīng)為不可逆降解，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)植物內(nèi)源CK 含量的關(guān)鍵因素之一［3］。在CKX 發(fā)現(xiàn)之后的十多年中，絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CKX 為含銅的胺氧化酶，在催化反應(yīng)中其活性受到氨基乙腈和氰化物強(qiáng)烈抑制并且需要分子氧參與。研究表明CKX可以降解作為電子受體的2，6-二氯靛酚。隨后，代謝產(chǎn)物H2O2在玉米重組CKX的研究中檢測不到［4］。證明從大麥和小麥中純化的CKX 的催化反應(yīng)無需氧且不產(chǎn)生H2O2，因此建議將該酶更名為脫氫酶［5］。目前，在多種植物中CKX基因已經(jīng)被克隆鑒定。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在不同的物種中CKX基因均為多基因家族［6］。隨著植物CKX基因的獲取、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展以及模式植物的建立，極大加快研究CKX基因的功能的步伐。在轉(zhuǎn)CKX的擬南芥植株中，CKX 的代謝明顯增強(qiáng)，同時CK 的含量減少，轉(zhuǎn)基因植株的表型為根部異常發(fā)達(dá)，而地上莖矮小［7］經(jīng)過科學(xué)家們多年的研究證明，CK 對地上部分莖為促進(jìn)作用，而對地下部分的根系統(tǒng)為負(fù)調(diào)控作用［8］。在擬南芥中轉(zhuǎn)入Ds CKX1基因后，該植株表現(xiàn)出CK 不足的性狀［9］。也有研究表明在調(diào)控植物相關(guān)花器官的發(fā)育過程中CKX 也起到十分重要的作用，在玉米中花特異性啟動子下游轉(zhuǎn)入ZmCKX1基因，在啟動子的控制下，轉(zhuǎn)基因植株花芽檢測到CK 含量顯著地減少，并表現(xiàn)出雄性不育的癥狀［10］。作為降解CK的酶CKX廣泛存在于植物各個部位，因此研究CKX的功能和代謝具有重要的現(xiàn)實意義。

CRISPR/Cas是細(xì)菌和古菌在長期進(jìn)化過程中形成的一種免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以抵抗外源性的遺傳物質(zhì)的入侵，為它們提供獲得性免疫。CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以精準(zhǔn)識別出外源性遺傳物質(zhì)，并將外源基因切斷并沉默其表達(dá)［11］。正是因為這種精準(zhǔn)的靶向功能，所以成為一種快速高效的基因組編輯工具。在自然界中，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是CRISPR/Cas 系統(tǒng)眾多類型中的一種，而其在實際應(yīng)用中更適合于基因編輯，因此對其研究最深入，應(yīng)用相對比較成熟。利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，在模式植物擬南芥中，選取部分其CKX基因構(gòu)建一種帶有紅色熒光蛋白基因mCherry定向敲除基因的CRISPR/Cas9 載體。在轉(zhuǎn)化后進(jìn)一步檢測擬南芥CKX基因編輯后對于其生長發(fā)育的影響。將可視化篩選與分子鑒定相結(jié)合，為后續(xù)研究純合轉(zhuǎn)基因后代RNA 豐度、激素水平提供材料。純合轉(zhuǎn)基因子代還可再進(jìn)行敲除，達(dá)到CKX基因家族的單敲除、部分敲除，甚至完全敲除。本研究建立的高效編輯載體不僅局限于模式植物的應(yīng)用，還可進(jìn)行更多生物的基因編輯研究。從而為植物功能基因編輯、植物激素調(diào)控研究提供借鑒與參考。

1 材料和方法

1.1 主要試驗材料

本試驗所用的帶有熒光篩選標(biāo)記基因mCher‐ry的質(zhì)粒pHDE-mCherry由加州大學(xué)（圣地亞哥分校）Professor Zhao Yunde 贈送，DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和GV3101 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞分別購自廣州鼎國生物技術(shù)有限公司和上海維地生物技術(shù)有限公司，Col-0 野生型擬南芥生長于廣東石油化工學(xué)院植物培養(yǎng)室。

1.2 主要試驗試劑

質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、Platinum SuperFi ⅡDNA 聚合酶購于賽默飛公司、Epicentre T5 exonuclease、Husion DNA polymerase（DNA 聚合酶）、BsaI 限制性內(nèi)切酶和Taq DNA Ligase（DNA 連接酶）購自NEB 公司（美國），DNA Loading Buffer、氯霉素、卡那霉素、Tiangen DNA Marker 購自天根生化（北京）科技有限公司、引物合成及基因測序在上海生物工程有限公司完成，二硫蘇糖醇（DTT）購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 靶位點的設(shè)計

在NCBI 上查閱下載擬南芥CKX3、CKX4、CKX7基因序列，以此目標(biāo)序列。通過CRISPR/Castarget 在線設(shè)計網(wǎng)站（http：//crispr.dbcls.jp）分別設(shè)計CKX基因的2個Target位點。

1.4 引物設(shè)計

實驗所用引物均在NCBI引物在線設(shè)計，并由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成（見表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence used in the expriment

1.5 pHEE401-mCherry-CKX表達(dá)載體的構(gòu)建

1.5.1CKX3sgRNA片段的擴(kuò)增

以pCBC 質(zhì)粒（含gRNA）為模板，CKX3-F 和CKX3-R 為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃4 min，35 個循環(huán)（變性94℃30 s，退火56℃30 s，延伸72℃45 s），總延伸72℃2 min，4℃保存。然后使用1.4%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR 產(chǎn)物檢驗，將符合預(yù)期結(jié)果的目的條帶切膠，用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒進(jìn)行回收。CKX4和CKX7的sgRNA片段按照上述方法進(jìn)行擴(kuò)增獲取。

1.5.2 質(zhì)粒pHEE401-mChenry的酶切及同源重組

用BasⅠ酶對pHEE401E 質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切緩沖液（Cutsmart）2.0 μL，BsaⅠ（10U）0.8 μL，pHEE401E 質(zhì)粒（850 ng·μL-1）3.0 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20.0 μL，37℃反應(yīng)6 h，以未酶切質(zhì)粒為對照，將酶切好的質(zhì)粒進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗證。

將CKX3純化回收到的目的片段與酶切產(chǎn)物進(jìn)行同源重組，5.0 μL體系（重組酶2.5 μL，酶切質(zhì)粒0.5 μL，目標(biāo)sg RNA片段2 μL），50℃水浴1 h。

1.5.3 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌與菌液PCR鑒定

利用熱擊法將重組產(chǎn)物導(dǎo)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的DH5α 感受態(tài)細(xì)胞在LB 固體培養(yǎng)基上（含Kan）培養(yǎng)12 h。每個同源載體從轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)基上挑取單克隆，接種至500 μL LB培養(yǎng)基中，37℃下200 r·mim-1搖床培養(yǎng)5 h 后進(jìn)行PCR 鑒定。反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃4 min，35個循環(huán)（變性94℃30 s，退火56℃30 s，延伸72℃45 s），總延伸72℃2 min，4℃保存。

1.5.4 重組PHEE401-mCherry-CKX的質(zhì)粒提取與重組質(zhì)粒鑒定

將菌液PCR 結(jié)果符合預(yù)期的菌液在LB 液體培養(yǎng)基中（含50 mg·mL-1卡那霉素）擴(kuò)繁培養(yǎng)，并于37℃搖菌12 h，用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒PCR 鑒定，反應(yīng)條件同菌液PCR。挑選質(zhì)量較好的的重組質(zhì)粒送到生工生物工程股份有限公司（廣州）測序，并用Mega7 軟件進(jìn)行序列比對。

1.6 擬南芥的轉(zhuǎn)化

1.6.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及浸染液的配制

將測序成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，制備工程菌浸染液。

1.6.2 擬南芥的浸染

選用未開放花苞的Col野生型擬南芥，如果已經(jīng)開放花蕾的植株，需在浸染前1 d 前將所有已經(jīng)開放的花蕾以及出現(xiàn)的果莢剪除。用配置好的工程菌浸染液浸染花苞，并輕輕攪動，在浸泡1～2 min 后取出，并用小木棍將其固定支撐植株，葉片以及莖上的殘留液體用吸水紙吸除，使用保鮮膜將浸泡好的擬南芥罩住，并留有一定孔洞透氣，暗培養(yǎng)3 d 后正常培養(yǎng)，待新一批花苞長出時再次浸染。在果莢成熟后及時收取，并做好標(biāo)記。

1.7 轉(zhuǎn)化后代的可視化篩選與鑒定

將轉(zhuǎn)化后的種子命名為T0，然后利用倒置熒光顯微鏡在T0代種子中篩選帶有紅色熒光的種子并種植，得到的植株命名為T1。

觀察T1植株的表型是否與野生型植株有所異同，并剪取T1植株（尤其是性狀特殊）幼嫩葉片，提取植株的DNA，以此為模板，并利用對應(yīng)CKX基因的GT1 和GT2 這對鑒定引物對目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后初步鑒定目的基因打靶的優(yōu)劣。

選取電泳結(jié)果符合預(yù)期的植株，再次提取其基因組，并使用高保真Pfu 酶再次PCR，并使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA 凝膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物，并送往生工生物工程股份有限公司（廣州）測序。使用Mega7 軟件進(jìn)行序列比對驗證目標(biāo)基因編輯情況。

1.8 擬南芥突變體激素測定

取CKX3 純合突變體幼苗的全部根部進(jìn)行激素提取和測定。操作步驟為：突變體幼苗全部根部樣品用液氮研磨，經(jīng)異丙醇/鹽酸、二氯甲烷處理、氮氣除有機(jī)相、甲醇（1%甲酸）溶解后，進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測。

取野生型幼苗全部根部進(jìn)行激素提取和測定。方法如同突變體提取。

2 結(jié)果與分析

2.1 pHEE401E-mCherry-CKX3 表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果

經(jīng)PCR 擴(kuò)增目的基因條帶CKX3sgRNA（見圖1A），大小為600 bp 左右，與預(yù)期擴(kuò)增長度610 bp相符，切膠回收后可與酶切后的質(zhì)粒同源重組。

重組質(zhì)粒經(jīng)熱激法導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，菌液PCR 結(jié)果（見圖1B）顯示，擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符。選取圖1B 中符合預(yù)期結(jié)果的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)之后，分別提取CKX3sgRNA 的pHEE401E-mcherry-CKX3表達(dá)載體質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR 檢驗結(jié)果（見圖1C），與預(yù)期結(jié)果相符。表明分別含有CKX3sgRNA、的pHEE401E-mCherry-CKX表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 重組質(zhì)粒pHEE401E-mCherry-CKX 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌結(jié)果

將重組好的pHEE401E-mCherry-CKX3質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；為驗證轉(zhuǎn)化是否成功進(jìn)行菌液PCR 鑒定（見圖2），由圖2 可知，條帶大小600 bp 左右，與預(yù)期結(jié)果相符，證明農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化工程菌轉(zhuǎn)化成功。

2.3 轉(zhuǎn)化Col野生型擬南芥后的可視化篩選

在構(gòu)建好含有擬南芥種皮重組啟動子的重組質(zhì)粒中啟動熒光篩選標(biāo)記，mCherry基因的紅色熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)化成功的T0種子，在580 nm 激發(fā)光中會發(fā)出紅色熒光；沒有轉(zhuǎn)化成功的種子不會發(fā)出熒光（見圖3）?；谶@種可視化的篩選方法，能夠更加快速篩選出陽性轉(zhuǎn)化后代，極大地提高工作效率。

2.4 CKX3轉(zhuǎn)化陽性T1后代分子鑒定

將陽性T0后代種子種植，在萌發(fā)后提取幼嫩葉片的DNA進(jìn)行分子鑒定（見圖4A），圖4A顯示在轉(zhuǎn)化中有部分呈現(xiàn)出兩條帶的結(jié)果：一條為1 000 bp左右，另一條則為750 bp 左右，在與野生型結(jié)果條帶（大約1 000 bp）對照可知為雜合子，即敲除CKX3等位基因中1個；另一情況為單一條帶為500 bp左右且清晰，可知為完整敲除CKX3基因的純合突變。

將鑒定結(jié)果中的純合子，進(jìn)行移栽成長之后再次進(jìn)行DNA 基因組提取鑒定（見圖4B）。圖4B呈現(xiàn)單一500 bp 左右的條帶，再次表明敲除成功。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，將其送往上海生工廣州分公司進(jìn)行測序（見圖5），表明在位于兩個Target 位點之間的CKX3基因大片段敲除，與預(yù)期設(shè)計完全致。

2.5 CKX3轉(zhuǎn)化陽性T0后代性狀分析

T0后代中經(jīng)可視化篩選，將陽性純合擬南芥植株培養(yǎng)成熟，并與野生型對比（見圖6）；結(jié)果表明陽性純合敲除CKX3基因的植株，相較野生型產(chǎn)生了自身解除頂端優(yōu)勢的性狀，并可以明顯觀察到植株的主莖明顯變粗，側(cè)枝生長旺盛。由此可見，在當(dāng)CKX3基因敲除之后，CK 代謝發(fā)生改變，持續(xù)積累于植株體內(nèi)。結(jié)果導(dǎo)致自解除頂端優(yōu)勢，植株橫向發(fā)展（桿莖變粗）。

2.6 CKX3轉(zhuǎn)化陽性T1后代激素測定

經(jīng)激素檢測GA3、ABA、6-BA 在突變體中分別是0.503、3.633、4.280 ng·g-1，野生型含量分別為是0.190、2.766、3.223 ng·g-1經(jīng)差異顯著性檢驗都達(dá)到顯著水平，且突變體中激素含量均比野生型擬南芥有所提高（見圖7）。

3 討論

在進(jìn)行分子設(shè)計育種和功能基因組學(xué)基礎(chǔ)研究的重要材料是植物突變植株，同時也是研究植物體內(nèi)激素含量、代謝機(jī)理的重要材料。常規(guī)的植物突變體來源于劇烈的外界環(huán)境因素影響如物理、化學(xué)等因素或者自身DNA的錯配導(dǎo)致突變，具有很大的盲目性和局限性，不能滿足大規(guī)模的分子設(shè)計育種和功能基因組學(xué)研究的需求。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，在進(jìn)行目標(biāo)基因打靶的需求下，作為第三代基因編輯的技術(shù)CRISPR/Cas 就表現(xiàn)出其優(yōu)越性，CRISPR-Cas技術(shù)因其操作便捷、有效得到廣泛使用［12］。到目前為止，廣泛使用的CRISPR/Cas 技術(shù)包括Ⅱ型的Cas9 以及Ⅴ型的Cas12a［13］具有成本低廉，操作簡易方便且基因編輯效率的高效性的優(yōu)點，只需將目標(biāo)靶位基因設(shè)計入sgRNA中，并與Cas9 組裝便可獲取打靶載體［14］。其次，CRISPR/Cas9 技術(shù)體系在完成對目的基因的遺傳編輯之后，在形成合子的時候伴隨染色體的自由組合，加上一定的外界人工干預(yù)可在編輯后代中不留下轉(zhuǎn)基因的痕跡、剔除外源基因、生物安全性高。特別在近年CRISPR/Cas9 技術(shù)的研究潮來臨，其所具有的優(yōu)勢得到更一步挖掘和利用，應(yīng)用范圍也將越來越廣泛，對任何物種的基因組編輯成為可能，促使更加深入了解各種基因的功能作用。

在基因編輯中，編輯目的靶位基因的成功表達(dá)檢測是一件較為繁瑣、成本較高的事情；在考慮目的靶位基因的表達(dá)高效性同時需要考慮基因表達(dá)的時間、空間特異性。利用來自于蘑菇珊瑚的紅色熒光蛋白mCherry，所編碼的蛋白具有很強(qiáng)的光穩(wěn)定性［15］。在熒光顯微鏡的特定波長的激發(fā)下，應(yīng)用外源轉(zhuǎn)化元件具有熒光的特點。本研究中將種皮特異性啟動子At2S3促使其表達(dá)，實現(xiàn)在轉(zhuǎn)化后代中可視化篩選出陽性轉(zhuǎn)化種子。CRISPR/Cas9表達(dá)系統(tǒng)的方法簡單便于操作，基因打靶精度和效率都較高［16］，經(jīng)過可視化篩選后基因編輯植株的檢測只需要進(jìn)行簡單的PCR 驗證，即可確定是否獲得基因編輯陽性的植株后代。

本研究分別通過設(shè)計CKX3的sgRNA，使其識別基因靶向序列，提高打靶特異性，最終構(gòu)建pHEE401E-mCherry-CKX3的高效編輯載體，進(jìn)行CKX3基因打靶。CKX 為降解CK 的活性酶類，當(dāng)CKX 含量和活性受到影響，將造成CK 在植物體內(nèi)的累積，并出現(xiàn)自身頂端優(yōu)勢解除的性狀，側(cè)面證明CK 可能為植物控制腋芽生長的信使。有研究證明當(dāng)對植株打頂后，在之后6 h 可在腋芽檢測到大量的CK［17］。并可在純合植株的基礎(chǔ)上，進(jìn)行RNA 研究，進(jìn)一步去驗證CKX3基因?qū)χ参顲K 代謝影響；另一方面也可將CKX4、CKX7載體浸染純合植株，獲得雙突、多突的純合植株，甚至將CKX家族全員敲除，更進(jìn)一步研究CKX基因。進(jìn)而通過CK 代謝控制為農(nóng)業(yè)、林業(yè)等經(jīng)濟(jì)型植物的種植生產(chǎn)活動增產(chǎn)增收。但在具體應(yīng)用、降低脫靶概率、提高基因重組效率和基因編輯后的優(yōu)良性穩(wěn)定遺傳等仍是需要深入探究的問題。