清肺保元膠囊對COPD模型大鼠氣道炎癥的抑制作用及對NLRP3信號通路的影響

胡萬福 劉明 楊燕 李玲 李廣松

摘 要 目的：探討清肺保元膠囊對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）模型大鼠氣道炎癥的抑制作用，以及對NOD樣受體蛋白3（NLRP3）信號通路的影響。方法：將60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、地塞米松組（陽性對照，0.2 mg/kg）和清肺保元膠囊高、中、低劑量組（1 232.0、616.0、308.0 mg/kg），每組10只。除空白對照組外，其余各組大鼠經(jīng)煙熏28 d和氣管內(nèi)滴注脂多糖2次以復(fù)制COPD模型。自實(shí)驗(yàn)第29天起，空白對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物;給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)28 d。末次給藥后，檢測各組大鼠肺功能;采用蘇木精-伊紅染色法觀察其肺組織病理學(xué)變化，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測其支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的含量并進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù);采用Western blotting法檢測其肺組織中NLRP3、剪切的胱天蛋白酶1（Cleaved caspase-1）蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果：模型組、地塞米松組和清肺保元膠囊高、中、低劑量組分別有3、2、1、1、2只大鼠死亡。與空白對照組比較，模型組大鼠第0.3秒用力呼氣容積/用力肺活量比值（FEV0.3/FVC）顯著降低（P<0.01）;其肺組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤，病變明顯;其支氣管肺泡灌洗液中IL-1β含量和白細(xì)胞計數(shù)以及肺組織中NLRP3、Cleaved caspase-1蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠FEV0.3/FVC均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;其肺組織病變不同程度地改善;其肺泡灌洗液中IL-1β含量和白細(xì)胞計數(shù)，肺組織中NLRP3蛋白（清肺保元膠囊低劑量組除外）和Cleaved caspase-1蛋白（清肺保元膠囊中、低劑量組除外）的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：清肺保元膠囊可減輕COPD模型大鼠的肺組織病理損傷、改善其肺功能，這種作用可能與抑制NLRP3信號通路進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 清肺保元膠囊;慢性阻塞性肺疾病;氣道炎癥;NOD樣受體蛋白3信號通路;大鼠

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）03-0309-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.03.10

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate inhibitory effects of Qingfei baoyuan capsule on airway inflammation in rats with chronic obstructive pulmonary disease （COPD）， and its effects on NLRP3 signaling pathway. METHODS： Totally 60 SD male rats were randomly divided into blank control group， model group， dexamethasone group （positive control， 0.2 mg/kg）， Qingfei baoyuan capsule high-dose， medium-dose and low-dose groups （1 232.0， 616.0， 308.0 mg/kg）， with 10 rats in each group. Except for blank control group， other groups were fumigated for 28 days and given intratracheal dripping of lipopolysaccharide twice to induce COPD model. Since the 29th day after modeling， blank control group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， and administration groups were given related medicine intragastrically. The administration volume was 10 mL/kg， once a day， for consecutive 28 days. After last administration， the lung function was detected. The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining. The content of interleukin-1β （IL-1β） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were detected by ELISA， and the number of leukocytes was counted; the expression of NLRP3 and Cleaved caspase-1 in lung tissue of rats were detected by Western blotting assay. RESULTS： Three， two， one， one and two rats died in model group， dexamethasone group， Qingfei baoyuan capsule high-dose， medium-dose and low-dose groups， respectively. Compared with blank control group， FEV0.3/FVC of rats in model group was significantly decreased （P<0.01）. A large number of inflammatory cells infiltration were found in the lung tissue， and lung tissue lesion was obvious. The content of IL-1β and white blood cell count in BALF， relative expression of NLRP3 and Cleaved caspase-1 protein in lung tissue were increased significantly? （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， FEV0.3/FVC of administration groups were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）; lung tissue lesion of them were improved to different extents. The content of IL-1β and white cell count in BALF， relative expression of NLRP3 protein （except for Qingfei baoyuan capsule low-dose group） and Cleaved caspase-1 protein （except for Qingfei baoyuan capsule medium-dose and low-dose groups） in lung tissue were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Qingfei baoyuan capsule can relieve lung tissue lesion and improve lung function in COPD model rats， the effects of which may be associated with inhibiting inflammation reaction by inhibiting NLRP3 signaling pathway.

KEYWORDS? ?Qingfei baoyuan capsule; Chronic obstructive pulmonary disease; Airway inflammation; NLRP3 signaling pathway; Rat

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD），因其高發(fā)病率和病死率，已成為全球重大的健康問題[1]。吸煙是COPD重要的危險因素，由于吸煙引起的慢性氣道炎癥進(jìn)一步加重了小氣道異常和實(shí)質(zhì)損傷[2-3]。近年許多研究表明，NOD樣受體蛋白3（NLRP3）通路參與了COPD的氣道炎癥進(jìn)程[4-5]，故其已成為COPD治療的新靶點(diǎn)。清肺保元膠囊處方源于貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科使用的中藥復(fù)方“清肺保元湯”，由紫花地丁、茯苓、當(dāng)歸等藥材組成，具有清熱化痰、宣肺止咳、活血化淤的功效[6]。為便于患者使用，該院將其開發(fā)成醫(yī)院制劑“清肺保元膠囊”，臨床實(shí)踐證實(shí)該藥治療COPD的效果較好[7]，具有開發(fā)成上市藥品的潛力，但其抗COPD的藥理作用及其具體機(jī)制尚不清楚?；诖耍狙芯繑M利用煙熏加脂多糖復(fù)制COPD大鼠模型，觀察清肺保元膠囊對NLRP3通路相關(guān)蛋白[NLRP3、剪切的胱天蛋白酶1（Cleaved caspase-1）]、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等表達(dá)的影響從而探討其對COPD模型大鼠氣道炎癥的改善作用機(jī)制，為該藥治療COPD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

實(shí)驗(yàn)用主要儀器包括動物熏煙箱（自制，60 cm×50 cm×40 cm）、AniRes 2005型動物肺功能分析系統(tǒng)（北京貝蘭博科技有限公司）、RM2245型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）、DYCZ-40型電泳儀（北京六一儀器廠）、BX51T-? PHD-J11型顯微鏡（日本Olympus公司）、MK3型全功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、S10型高速均質(zhì)器（上海利聞科學(xué)儀器有限公司）、Tanno 5200型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

實(shí)驗(yàn)用主要藥品與試劑有：清肺保元膠囊（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科生產(chǎn)，批號20181108，規(guī)格每粒裝0.44 g;用法用量為口服，每次4粒，每日3次），醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號180316，規(guī)格0.75 mg），黃果樹牌香煙（貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司），脂多糖（美國Sigma公司，批號026M4015V），吉姆薩染色液試劑盒（安徽雷根生物技術(shù)有限公司，批號20190121），生理鹽水（貴州鑫源生物科技有限公司，批號180413），水合氯醛（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號20180123），大鼠IL-1β免疫酶聯(lián)吸附測定法（ELISA）試劑盒、兔抗大鼠NLRP3抗體、兔抗大鼠Cleaved caspase- 1抗體、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為12621873002、12CM405B、12J18、12I16B26），兔β-actin抗體（英國Abcam公司，批號ab8216），生物素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號12AB512C），微量BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號MS190124），蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號201812017），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）制備試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司，批號20181125）;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動物

實(shí)驗(yàn)用SPF級SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2014-0011。所有大鼠均于溫度21～24 ℃、濕度50%～55%、12 h光照/12 h黑暗交替的環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分成空白對照組、模型組、地塞米松組（0.2 mg/kg，按臨床用量的7倍折算）和清肺保元膠囊高、中、低劑量組（1 232.0、616.0、308.0 mg/kg，分別按臨床用量的14、7、3.5倍折算），每組10只。采用氣管內(nèi)滴注脂多糖生理鹽水溶液（200 μg/μL）聯(lián)合煙熏法制作COPD大鼠模型[8-9]：分別于實(shí)驗(yàn)第1、14天時在大鼠氣管內(nèi)滴注上述溶液（空白對照組大鼠氣管內(nèi)滴注生理鹽水）;于實(shí)驗(yàn)第2～28天（除第14天外），使其被動吸煙30 min，1支/只（空白對照組大鼠不作處理）。自實(shí)驗(yàn)第29天開始，各藥物組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，空白對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水;給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)28 d。

2.2 肺功能檢測

參照文獻(xiàn)[9-10]，于末次給藥后，腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL/kg）對大鼠進(jìn)行麻醉，將其以仰臥位固定，切開頸部皮膚、肌肉后暴露氣管，朝心方向剪一小口，行氣管插管約2 cm，結(jié)扎固定。氣管插管另一端與動物肺功能分析系統(tǒng)連接，檢測大鼠的用力肺活量（FVC）和第0.3秒用力呼氣容積（FEV0.3），并以兩者比值（FEV0.3/FVC）作為評價大鼠肺功能的指標(biāo)。

2.3 標(biāo)本制備

肺功能檢測結(jié)束后，在大鼠處于麻醉狀態(tài)下于其腹主動脈取血后，切開胸部，結(jié)扎右肺門，于頸部氣管下端作一T形切口，行氣管插管，以磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）進(jìn)行肺泡灌洗。收集支氣管肺泡灌洗液，以2 000? ?r/min離心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中保存，用于IL-1β含量、白細(xì)胞計數(shù)的檢測。處死大鼠，取右肺組織適量，立即置于液氮中冷凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，用于NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測;取左肺組織適量，于4%多聚甲醛溶液中固定，用于肺組織形態(tài)學(xué)觀察。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 肺組織病理觀察 采用HE染色法。取“2.3”項(xiàng)下固定于4%多聚甲醛溶液中的大鼠左肺組織適量，經(jīng)常規(guī)乙醇梯度洗脫、石蠟包埋后，切片（厚度約5 μm），再經(jīng)HE染色后，于顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理改變。

2.4.2 支氣管肺泡灌洗液中IL-1β含量 采用ELISA法。取“2.3”項(xiàng)下大鼠支氣管肺泡灌洗液適量，使用全功能酶標(biāo)儀檢測其中IL-1β的含量，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作。

2.4.3 支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞計數(shù) 采用吉姆薩染色法檢測。取“2.3”項(xiàng)下支氣管肺泡灌洗液10 μL，涂抹于玻片上，晾干后滴加少量甲醇固定，將玻片置于吉姆薩染色液中浸染，用水沖洗后自然干燥，于顯微鏡下觀察被染成紫色或藍(lán)紫色的白細(xì)胞并計數(shù)，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作。

2.4.4 肺組織中NLRP3、Cleaved caspase-1蛋白的表達(dá)情況 采用Western blotting法檢測。取“2.3”項(xiàng)下大鼠右肺組織適量，置于EP管內(nèi)，于冰上搗碎后勻漿，以13 000 r/min離心5 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白含量后，煮沸變性。取變性蛋白適量，行SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在室溫下以5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入NLRP3、Cleaved Caspase-1、β-actin一抗（稀釋度分別為1 ∶ 300、1 ∶ 2 500、1 ∶ 6 000），4 ℃孵育過夜;用TBST溶液緩慢清洗5 min×3次，分別加入二抗（稀釋度為1 ∶ 10 000），于室溫下孵育2 h;用TBST溶液緩慢清洗5 min×3次，經(jīng)ECL顯影液顯影后，置于化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀下成像。使用Image J v1.8.0軟件進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參（β-actin）條帶的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法（方差齊）或Games-Howell法（方差不齊）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 清肺保元膠囊對模型大鼠肺功能的影響

因造模損傷，除空白對照組外，其余各組均有動物死亡，其中模型組、地塞米松組和清肺保元膠囊高、中、低劑量組分別死亡3、2、1、1、2只，藥物組動物死亡較模型組少。

與空白對照組比較，模型組大鼠FEV0.3/FVC顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠FEV0.3/FVC均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 清肺保元膠囊對模型大鼠肺組織病理改變的影響

空白對照組大鼠肺泡腔內(nèi)未見炎性滲出物，肺泡腔結(jié)構(gòu)正常、無病理性擴(kuò)大;模型組大鼠肺泡壁增厚、過度膨脹，肺泡數(shù)目減少，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，部分可見肺泡融合;地塞米松組和清肺保元膠囊高、中劑量組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常;清肺保元膠囊低劑量組大鼠肺組織可見少量炎性細(xì)胞浸潤，詳見圖1。

3.3 清肺保元膠囊對模型大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β含量和白細(xì)胞計數(shù)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β含量和白細(xì)胞計數(shù)均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠支氣管肺泡灌洗液中上述指標(biāo)均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.4 清肺保元膠囊對模型大鼠肺組織中NLRP3、Cleaved caspase-1蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織中NLRP3、Cleaved caspase-1蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，地塞米松組和清肺保元膠囊中、高劑量組大鼠肺組織中NLRP3蛋白以及地塞米松組和清肺保元膠囊高劑量組大鼠肺組織中Cleaved caspase-1蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表3。

4 討論

COPD屬于臨床常見的慢性炎癥性疾病，長期暴露在煙霧環(huán)境下是導(dǎo)致其發(fā)病的主要原因[9]。本研究將大鼠長期放置于香煙煙霧環(huán)境中，并于其氣管內(nèi)滴注脂多糖以制備COPD模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型大鼠肺泡壁增厚，支氣管管腔局部變形、上皮細(xì)胞脫落，支氣管內(nèi)分泌物增多、可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，且肺泡壁毛細(xì)血管及小靜脈擴(kuò)張充盈，顯示肺組織存在瘀血、局部存在水腫，提示模型制備后大鼠支氣管和肺組織均發(fā)生病理性損傷。通過肺功能檢測發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠FEV0.3/FVC顯著降低，提示其氣道阻力增加，存在氣流受限和肺通氣功能障礙，即肺功能降低，符合COPD模型的基本特征[9，11]，表明造模成功。經(jīng)清肺保元膠囊干預(yù)治療后，各劑量組大鼠肺組織病理損傷均不同程度地改善，F(xiàn)EV0.3/FVC均顯著升高，提示清肺保元膠囊具有改善COPD模型大鼠肺組織病理損傷和肺功能的作用。

越來越多的研究表明，NLRP3炎癥小體與一系列慢性炎癥性疾病有關(guān)[12-14]。炎癥小體又叫炎性小體，是由胞漿內(nèi)模式識別受體參與組裝的多蛋白復(fù)合物，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。炎癥小體能識別病原相關(guān)分子模式或者宿主來源的危險信號分子，招募和激活促炎癥蛋白酶Caspase-1，活化的Caspase-1可切割I(lǐng)L-1β、IL-18前體，從而分泌IL-1β和IL-18;此外，炎癥小體的活化還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的炎癥壞死[15]。已發(fā)現(xiàn)的炎癥小體一般均含有凋亡相關(guān)微粒蛋白（ASC）、Caspase家族以及1種NOD樣受體（NLR）家族蛋白（如NLRP1）或HIN200家族蛋白（如AIM2）[16-17]。其中，NLRP3炎癥小體可通過與ASC、Cleaved caspase-1組成高分子蛋白復(fù)合體，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-1β、IL-18、IL-33等相關(guān)炎癥因子的成熟、釋放，從而引起炎癥反應(yīng)，參與疾病的發(fā)生與發(fā)展，其中IL-1β是該信號通路中研究較多的細(xì)胞因子之一[18-19]?；诖耍狙芯繉L-1β、NLRP3、Cleaved caspase-1作為考察指標(biāo)。結(jié)果顯示，COPD模型大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β含量顯著升高，白細(xì)胞計數(shù)顯著增多，表現(xiàn)出了明顯的氣道炎癥反應(yīng);同時，其肺組織中NLRP3、Cleaved caspase-1蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高，可見大鼠NLPR3通路相關(guān)蛋白表達(dá)異常，提示COPD的發(fā)生機(jī)制可能是因?yàn)镹LRP3和Cleaved caspase-1的激活誘導(dǎo)了IL-1β的成熟與釋放，從而引起COPD氣道炎癥的發(fā)生。經(jīng)清肺保元膠囊干預(yù)治療后，各劑量組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β含量、白細(xì)胞計數(shù)均顯著降低，肺組織中NLRP3（低劑量組除外）、Cleaved caspase-1蛋白（低、中劑量組除外）的相對表達(dá)量均顯著減少，提示清肺保元膠囊具有抑制COPD模型大鼠氣道炎癥的作用，其作用機(jī)制與下調(diào)NLRP3信號通路有關(guān)。

綜上所述，清肺保元膠囊可減輕COPD模型大鼠的肺組織病理損傷、改善其肺功能，這種作用可能與抑制NLRP3信號通路進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。然而，COPD的發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，本文僅初步研究了清肺保元膠囊對NLRP3信號通路的調(diào)控作用，該藥是否還能通過其他途徑發(fā)揮作用目前尚不清楚，還有待后續(xù)深入探究。

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（收稿日期：2020-08-08 修回日期：2020-11-30）

（編輯：張元媛）