李建成,馮 斌
1)駐馬店市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 河南駐馬店 463000 2)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科 鄭州 450003
肺炎是兒童常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一,且以金黃色葡萄球菌等細(xì)菌性及病毒性肺炎較為多見[1],同時(shí),由于兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟,如果肺炎治療不及時(shí),疾病可能進(jìn)展為細(xì)菌性腦膜炎等,造成肺組織及腦神經(jīng)損傷,甚至造成患兒死亡[2]。丹酚酸B是從傳統(tǒng)中藥材丹參中提取得到的活性成分,近年來(lái)研究[3-4]表明,丹酚酸B具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用。本文通過(guò)研究丹酚酸B對(duì)金黃色葡萄球菌肺炎幼年小鼠(幼鼠)肺組織修復(fù)及腦神經(jīng)保護(hù)的作用及機(jī)制,為丹酚酸B在肺炎患兒中的臨床應(yīng)用提供參考和依據(jù)。
1.1試劑和儀器丹酚酸B購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;SOD活性檢測(cè)試劑盒及MDA檢測(cè)試劑盒,TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒,離子鈣接頭分子(Iba-1)、p-NF-κBp65、NF-κBp65及GAPDH抗體,免疫熒光染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司;金黃色葡萄球菌菌株(編號(hào)ATCC4300)購(gòu)自美國(guó)ATCC;ECLIPSETS100-F 倒置顯微鏡購(gòu)自日本 Nikon 公司;MRZ14M010高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司;SpectraMax190多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自上海美谷分子儀器有限公司;ChemiDoc XRS凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;BX50/BX-FLA/DP70型光學(xué)/熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;UniCel DxC 800 Synchron全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司。
1.2動(dòng)物分組及處理健康雄性C57BL/6幼鼠125只,購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,4~6周齡,動(dòng)物房溫度(22±2) ℃,濕度(50±10)%,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,除25只幼鼠作為對(duì)照組外,其余100只幼鼠參照文獻(xiàn)[5]方法建立金黃色葡萄球菌肺炎幼鼠模型。7.5 g/L的戊巴比妥鈉腹腔注射對(duì)幼鼠進(jìn)行麻醉后,使用移液槍取金黃色葡萄球菌菌液10 μL(1×1010CFU/mL)緩慢滴入幼鼠鼻腔,使幼鼠與操作臺(tái)成45°角保持1 min,1次/d,連續(xù)3 d,以幼鼠出現(xiàn)呼吸急促、活動(dòng)量減少及肺組織病理改變視為造模成功。100只均造模成功。將造模成功的幼鼠分為4組,每組25只,分別為模型組、丹酚酸B低劑量組、丹酚酸B中劑量組、丹酚酸B高劑量組。丹酚酸B低、中、高劑量組分別按照5、10、20 mg/kg腹腔注射丹酚酸B[6-7],對(duì)照組及模型組腹腔注射等體積生理鹽水,1次/d,連續(xù)7 d[5-6]。
1.3各組幼鼠動(dòng)脈氧分壓(PaO2)、氧合指數(shù)(OI)的測(cè)定各組幼鼠最后一次給藥24 h后,每組取10只幼鼠,7.5 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,自左心室采血2 mL,采用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)PaO2、OI。
1.4各組幼鼠肺組織濕干重比值(W/D)的測(cè)定每組取10只幼鼠,頸椎脫臼法處死幼鼠后迅速分離幼鼠肺組織,并用濾紙吸干水分后置于玻璃試管中稱重,然后置于烘箱中,80 ℃烘烤24 h至恒重后,計(jì)算各組幼鼠肺組織W/D。W/D=幼鼠肺組織濕重(mg)/幼鼠肺組織干重(mg)。
1.5各組幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)定利用Morris水迷宮,對(duì)各組幼鼠進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。每組取15只幼鼠,將幼鼠放入水槽自由游泳2 min,適應(yīng)迷宮內(nèi)、外環(huán)境及游泳狀態(tài),持續(xù)訓(xùn)練3 d,2次/d。于第4天進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn),幼鼠從4個(gè)不同的標(biāo)記點(diǎn)分別入水,記錄其自入水到爬上平臺(tái)所需要的時(shí)間,記為逃避潛伏期;如果幼鼠在90 s內(nèi)未找到平臺(tái),則將其引導(dǎo)至平臺(tái)休息10 s,逃避潛伏期記為90 s。定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn):撤出平臺(tái),將幼鼠放入水中自由游泳,記錄首次穿過(guò)平臺(tái)所在象限需要的時(shí)間以及在90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù)。采用Morris水迷宮圖像自動(dòng)監(jiān)視處理系統(tǒng)測(cè)定逃避潛伏期、首次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間、90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)。
1.6各組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平的測(cè)定水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每組取15只幼鼠摘除眼球取血至干凈離心管中,于4 ℃靜置4 h,然后置于離心機(jī)中4 ℃ 3 500 r/min離心10 min,取上清液,按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)幼鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平。
1.7各組幼鼠肺組織SOD活性及MDA水平的測(cè)定每組取15只幼鼠,取肺組織,用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水洗去表面血液后,用濾紙吸干表面水分,按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)幼鼠肺組織SOD活性及MDA水平。
1.8各組幼鼠肺組織病理學(xué)檢查每組取15只幼鼠,處死后取肺組織,在體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛中固定后脫水、石蠟包埋,5 μm厚切片,常規(guī)HE染色,顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。
1.9各組幼鼠肺組織中NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的檢測(cè)每組取15只幼鼠,取肺組織裂解后提取總蛋白,蛋白定量后,取等量蛋白進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜,經(jīng)NF-κBp65、p-NF-κBp65及內(nèi)參GAPDH抗體(均1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜。PBST充分洗膜后,加入二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h,PBST清洗后顯色液顯影,應(yīng)用Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。
1.10各組幼鼠腦組織中Iba-1蛋白的免疫熒光染色每組取15只幼鼠腦組織制作石蠟切片,體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清封閉后,滴加Iba-1一抗 (1∶200稀釋),4 ℃過(guò)夜,依次經(jīng)山羊抗兔二抗(1∶500稀釋)室溫下孵育50 min,CY3孵育10 min,經(jīng)含吐溫磷酸鹽緩沖液洗滌3次,滴加抗熒光淬火封片液,孵育5 min,DAPI染色10 min后使用熒光顯微鏡觀察,利用Image Pro Plus 6.0合成Merge圖,Image J圖像分析系統(tǒng)分析平均熒光強(qiáng)度,即蛋白的表達(dá)水平。平均熒光強(qiáng)度=區(qū)域熒光強(qiáng)度總和/區(qū)域面積。
1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。5組幼鼠W/D、PaO2、OI,逃避潛伏期、首次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間、90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù),血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平,肺組織SOD活性、MDA水平,肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白表達(dá)水平及p-NF-κBp65/NF-κBp65比值,腦組織Iba-1蛋白表達(dá)水平的比較均采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
2.15組幼鼠肺組織W/D、PaO2、OI的比較結(jié)果見表1。由表1可知,與對(duì)照組相比,模型組幼鼠肺組織W/D升高,PaO2、OI降低;與模型組相比,丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠肺組織W/D降低,PaO2、OI升高,隨劑量升高,各指標(biāo)改善更為顯著。
表1 5組幼鼠肺組織W/D、PaO2、OI的比較
2.25組幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較結(jié)果見表2。由表2可知,與對(duì)照組相比,模型組幼鼠逃避潛伏期及首次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間延長(zhǎng),90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)減少;與模型組相比,丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠逃避潛伏期及首次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間縮短,90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)增加,隨劑量升高,各指標(biāo)改善更為顯著。
表2 5組幼鼠逃避潛伏期、首次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間、90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)的比較
2.35組幼鼠血清炎癥因子水平的比較結(jié)果見表3。由表3可知,與對(duì)照組相比,模型組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高;與模型組相比,丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低,隨劑量升高,3種炎癥因子水平降低更為顯著。
表3 5組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平的比較 ng/L
2.45組幼鼠肺組織SOD活性及MDA水平的比較結(jié)果見表4。由表4可知,與對(duì)照組相比,模型組幼鼠肺組織SOD活性降低,MDA水平升高;與模型組相比,丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠肺組織SOD活性升高,MDA水平降低,隨劑量升高,各指標(biāo)改善更為顯著。
表4 5組幼鼠肺組織SOD活性及MDA水平的比較
2.55組幼鼠肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果見圖1。與對(duì)照組相比,模型組幼鼠肺泡邊緣不整齊,間質(zhì)水腫,可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),支氣管上皮細(xì)胞壞死,腔內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞,血管周圍水腫,提示造模成功;與模型組相比,丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠肺泡邊緣結(jié)構(gòu)明顯改善,丹酚酸B低、中劑量組幼鼠肺間質(zhì)水腫及支氣管上皮細(xì)胞壞死明顯減輕,少見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),丹酚酸B高劑量組幼鼠肺組織病理學(xué)明顯改善,偶見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),少見支氣管上皮細(xì)胞壞死。
A:對(duì)照組;B:模型組;C:丹酚酸B低劑量組;D:丹酚酸B中劑量組;E:丹酚酸B高劑量組
2.65組幼鼠肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65及腦組織Iba-1水平的比較結(jié)果見圖2、3及表5??芍?,與對(duì)照組相比,模型組幼鼠肺組織NF-κBp65和p-NF-κBp65水平、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值、腦組織Iba-1水平升高;與模型組相比,丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠肺組織NF-κBp65和p-NF-κBp65水平、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值、腦組織Iba-1水平降低,隨劑量升高,各指標(biāo)改善更為顯著。
1:對(duì)照組;2:模型組;3:丹酚酸B低劑量組;4:丹酚酸B中劑量組;5:丹酚酸B高劑量組
圖3 5組幼鼠腦組織Iba-1的免疫熒光染色(×200)
表5 5組幼鼠肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65及腦組織Iba-1水平的比較
肺炎以細(xì)菌性和病毒性肺炎較為多見,而細(xì)菌性肺炎的常見致病菌主要有金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌及鮑曼不動(dòng)桿菌等[1-2]。由于兒童自身免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完全,所以肺炎患者中以兒童較為多見,同時(shí)表現(xiàn)出治療周期長(zhǎng)的特點(diǎn),若治療不及時(shí),容易引發(fā)血行感染,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌性腦膜炎的發(fā)生,嚴(yán)重者可導(dǎo)致患兒不可逆性智力下降,甚至死亡[2]。
丹酚酸B是從唇形科植物丹參的根及莖中提取得到的單體化合物,研究[3]表明丹酚酸B具有抗炎、心肌保護(hù)、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。近年來(lái)丹酚酸B對(duì)肺組織的保護(hù)作用及損傷修復(fù)作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。金粟等[8]發(fā)現(xiàn)丹酚酸B具有抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化病理進(jìn)展的作用;同時(shí),張敏等[9]發(fā)現(xiàn)丹酚酸B能夠通過(guò)抑制肺成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路抑制肺纖維化進(jìn)展;梁家紅等[10]研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B具有明顯的抗炎及抗凋亡作用,從而發(fā)揮對(duì)急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用。同時(shí),研究[11]表明,丹酚酸B也有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化有關(guān)。研究[12]表明大鼠肺損傷后,TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高加重肺組織損傷,同時(shí)肺組織MDA水平的升高及SOD活性下降則加重了肺組織氧化損傷,所以在肺損傷后上述指標(biāo)的改善直接關(guān)系到肺損傷的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。
本研究結(jié)果表明,與模型組相比,丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平,肺組織W/D、MDA水平降低;PaO2、OI、肺組織SOD活性升高,肺組織病理學(xué)損傷明顯改善;提示丹酚酸B能夠降低金黃色葡萄球菌肺炎幼鼠體內(nèi)炎癥因子水平和肺組織氧化應(yīng)激水平,改善肺炎幼鼠肺組織病理學(xué)變化。NF-κB信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,與免疫、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)等多種生物過(guò)程密切相關(guān),研究[13]表明,NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活可以誘導(dǎo)并加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)。NF-κBp65為NF-κB蛋白家族的成員之一,在機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。本研究表明,丹酚酸B各劑量組幼鼠肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值降低,提示丹酚酸B能夠降低肺炎幼鼠NF-κB信號(hào)通路及相關(guān)蛋白水平,抑制NF-κBp65的磷酸化,進(jìn)而發(fā)揮其抗炎及肺組織保護(hù)作用。
小膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng),正常狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞處于休眠或靜息狀態(tài),當(dāng)腦組織發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí),會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)及功能變化,激活免疫應(yīng)答,釋放大量炎癥介質(zhì)及細(xì)胞毒素[14],而Iba-1的高表達(dá)是腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與模型組比較,丹酚酸B各劑量組幼鼠逃避潛伏期及首次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間縮短,90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)增加,提示丹酚酸B能明顯改善幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力;丹酚酸B各劑量組幼鼠腦組織Iba-1水平降低,提示丹酚酸B能夠顯著改善肺炎幼鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,抑制腦組織炎癥反應(yīng),進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)作用。
綜上所述,丹酚酸B能夠減輕金黃色葡萄球菌肺炎幼鼠體內(nèi)炎癥狀態(tài),改善幼鼠肺組織及腦組織炎癥水平,保護(hù)幼鼠腦神經(jīng),提高幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2021年1期