miR-491-5p參與調(diào)節(jié)人膀胱癌細(xì)胞系EJ對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性

楊 鋒，徐 佳，仇國(guó)輝，楊志玲

(湖南省人民醫(yī)院 藥學(xué)二部，湖南 長(zhǎng)沙 410002)

膀胱癌(bladder cancer)一般采用根治術(shù)或局部切除術(shù)后輔以全身化療的策略，但經(jīng)此種方案治療后，依然有大量膀胱癌患者在5年內(nèi)復(fù)發(fā)[1]。造成這種現(xiàn)象的主要原因之一是膀胱癌化療耐藥性的產(chǎn)生而導(dǎo)致化療藥物不能徹底殺死殘存的癌細(xì)胞[2]。目前，雖然對(duì)膀胱癌細(xì)胞的耐藥表型相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但化療耐藥的關(guān)鍵決定因素仍不完全清楚。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是膀胱癌患者全身化療的常用化療藥物之一[3]。因此，尋找潛在的能逆轉(zhuǎn)5-FU耐藥性的生物標(biāo)志物和治療方法能降低膀胱癌患者復(fù)發(fā)率。

一些miRNAs在腫瘤的生長(zhǎng)、死亡、轉(zhuǎn)移和化療耐藥中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。miR-491-5p在胃癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中可作為抑癌因子[5-6]，且有報(bào)道m(xù)iR-491在胃癌和骨肉瘤中可抑制化療多藥耐藥性[7-8]。但關(guān)于miR-491-5p在膀胱癌中對(duì)5-FU耐藥的作用和機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究miR-491-5p在膀胱癌細(xì)胞中對(duì)5-FU的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑： DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Gibco公司)；Trizol試劑和Lipofectamine 3000試劑(Thermo Fisher Scientific公司)；CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、Annexin V-FITC/PI試劑盒、β-actin抗體和HRP耦合的二抗(江蘇碧云天研究所)；5-FU粉劑(Sigma公司)；miR-491-5p抑制劑、miR-491-5p模擬物和miR-NC質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因公司合成)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；AKT、p-AKT、STAT3和p-STAT3抗體(Cell Signal Technology公司)。

1.1.2 細(xì)胞與組織： 人膀胱癌細(xì)胞系EJ(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。納入30例行膀胱癌根治術(shù)前接受過(guò)以5-FU為基礎(chǔ)的全身化療方案的復(fù)發(fā)性膀胱癌患者，收集切除的膀胱癌組織，其中9例化療敏感組織，21例化療耐藥組織。本研究經(jīng)湖南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批文號(hào)：hnkyll-lx-20180716)，并取得所有涉及此項(xiàng)研究患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 EJ/5-FU耐藥細(xì)胞系的構(gòu)建： 根據(jù)文獻(xiàn)[9]方法稍作修改，以細(xì)胞系EJ為母本細(xì)胞，通過(guò)5-FU濃度遞增反復(fù)刺激法，最終使細(xì)胞能在52 μmol/L 5-FU中穩(wěn)定，獲得5-FU耐藥的EJ/5-FU細(xì)胞系。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組： 按照說(shuō)明書(shū)步驟，用Lipofectamine 3000試劑將miR-491-5p抑制劑或miR-NC轉(zhuǎn)入細(xì)胞系EJ，將miR-491-5p模擬物或miR-NC轉(zhuǎn)入EJ/5-FU細(xì)胞系。然后將細(xì)胞系EJ分為溶媒對(duì)照組、5-FU處理組、5-FU+miR-NC組和5-FU+miR-491-5p抑制劑組；將EJ/5-FU細(xì)胞系分為溶媒對(duì)照組、5-FU處理組、5-FU+miR-NC組和5-FU+miR-491-5p模擬物組。其中，5-FU的終濃度為52 μmol/L，溶媒對(duì)照為等體積的DMSO。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)miR-491-5p表達(dá)： 用Trizol試劑提取組織和細(xì)胞的總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板并加入SYBR GreenⅠ和引物后，用ABI 7500型快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。引物：U6上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，U6下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；miR-491-5p上游引物：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′，miR-491-5p下游引物：5′-TGCTAGTGGGGAACCCTTC-3′。U6為內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算miR-491-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞生存率： 各組細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板(1×104個(gè)/孔)中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞生存率。

1.2.5 Annexin/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡： 各組細(xì)胞分別接種于6孔培養(yǎng)板(1×107個(gè)/孔)中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，按annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 Transwell小室法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲： 分別取100 μL各組細(xì)胞的細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/mL)接種Transwell上室(微孔濾膜用于檢測(cè)細(xì)胞遷移；Matrigel包被的微孔濾膜用于檢測(cè)細(xì)胞侵襲)，取500 μL含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基加入下室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用結(jié)晶紫染色穿透至上室下膜的細(xì)胞，并在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞傷口愈合： 各組細(xì)胞分別接種于6孔板(1×107個(gè)/孔)中，當(dāng)細(xì)胞增殖至匯合時(shí)，細(xì)胞行劃痕處理后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。顯微鏡下拍攝劃痕后0和24 h劃痕區(qū)的細(xì)胞圖像，用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞愈合的面積。

1.2.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)： 用RIPA裂解液萃取細(xì)胞全蛋白后，用常規(guī)Western blot檢測(cè)AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)。上述蛋白的稀釋比例為1∶1 000。以β-actin為內(nèi)參，用Image J軟件量化細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-491-5p在膀胱癌化療耐藥組織和EJ/5-FU細(xì)胞系中表達(dá)情況

與化療敏感組織比較，miR-491-5p在膀胱癌耐藥組織中表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)(圖1A)。與細(xì)胞系EJ比較，miR-491-5p在EJ/5-FU細(xì)胞系中表達(dá)水平也顯著下調(diào)(P<0.01)(圖1B)。

A.expression levels of miR-491-5p in bladder cancer chemotherapy-sensitive (n=9) and resistant (n=21) tissues; *P<0.01 compared with sensitive tissues; B.expression levels of miR-491-5p in EJ and EJ/5-FU cell line; n=3; *P<0.01 compared with EJ cell line圖1 miR-491-5p在膀胱癌化療耐藥組織和EJ/5-FU細(xì)胞系中表達(dá)情況Fig 1 Expression of miR-491-5p in bladder cancer chemo-therapy-resistant tissues and EJ/5-FU cell line

2.2 下調(diào)miR-491-5p表達(dá)降低細(xì)胞系EJ對(duì)5-FU的敏感性

miR-491-5p抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞系EJ后，miR-491-5p表達(dá)顯著降低(圖2A)(P<0.01)。與溶媒對(duì)照組比較，5-FU處理組細(xì)胞系EJ活性(圖2B)、細(xì)胞劃痕愈合面積(圖2E, F)、遷移細(xì)胞數(shù)(圖2G, H)和遷移侵襲數(shù)(圖2G, I)均顯著降低(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率(圖2C, D)顯著增加(P<0.01)；與5-FU處理組比較，5-FU+miR-491-5p抑制劑組細(xì)胞系EJ活性(圖2B)、細(xì)胞劃痕愈合面積(圖2E, F)、遷移細(xì)胞數(shù)(圖2G, H)和遷移侵襲數(shù)(圖2G, I)均顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率(圖2C, 2D)顯著降低(P<0.05)。

2.3 上調(diào)miR-491-5p表達(dá)抑制EJ/5-FU細(xì)胞系對(duì)5-FU的耐藥性

miR-491-5p模擬物轉(zhuǎn)染EJ/5-FU細(xì)胞系后，miR-491-5p表達(dá)顯著增加(圖3A)(P<0.01)。與溶媒對(duì)照組比較，5-FU處理組細(xì)胞系EJ活性(圖3B)、細(xì)胞凋亡率(圖3C, D)、細(xì)胞劃痕愈合面積(圖3E，F(xiàn))、遷移細(xì)胞數(shù)(圖3G，H)和遷移侵襲數(shù)(圖3G, I)無(wú)顯著影響；與5-FU處理組比較，5-FU+miR-491-5p模擬物組細(xì)胞系EJ活性(圖3B)、細(xì)胞劃痕愈合面積(圖3E, F)、遷移細(xì)胞數(shù)(圖3G, H)和遷移侵襲數(shù)(圖3G, I)均顯著降低(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率(圖3C, D)顯著增加(P<0.01)。

A.after transfected miR-491-5p inhibitor into EJ cells, the expression levels of miR-491-5p was detected by RT-qPCR; B.cell viabilities of various groups were detected by CCK-8 assay; C,D.cell apoptosis of various groups were detected by annexin/PI staining; E,F.closed woud areas of various groups were detected by scratch assay; G-I.cell migration and invasion of various groups were detected by Transwell assay;scale bar=100 μm; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group or vehicle group; #P<0.05 compared with 5-FU group

2.4 miR-491-5p對(duì)AKT及STAT3磷酸化水平的影響

與母本細(xì)胞系EJ比較，EJ/5-FU細(xì)胞系中p-AKT和p-STAT3表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)(圖4A～C)。在細(xì)胞系EJ中，與miR-NC處理組比較，miR-491-5p抑制劑組p-AKT和p-STAT3表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)(圖4D～F)。在EJ/5-FU細(xì)胞系中，與miR-NC處理組比較，miR-491-5p模擬物組p-AKT和p-STAT3表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)(圖4G～I(xiàn))。

3 討論

迄今已發(fā)現(xiàn)眾多miRNAs參與調(diào)節(jié)腫瘤化療敏感性[4]。其中，miR-491-5p的表達(dá)降低與腫瘤的化療耐藥性相關(guān)[7-8]。但在膀胱癌中，miR-491-5p對(duì)5-FU的影響和機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-491-5p在化療耐藥組織和EJ/5-FU細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，提示miR-491-5p可能在膀胱癌細(xì)胞5-FU耐藥過(guò)程中起著重要作用。為證明miR-491-5p參與調(diào)節(jié)膀胱癌5-FU敏感性的作用，本研究將miR-491-5p抑制劑轉(zhuǎn)入細(xì)胞系EJ中，發(fā)現(xiàn)5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少和細(xì)胞活性增加；將miR-491-5p模擬物轉(zhuǎn)入EJ/5-FU細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加和細(xì)胞活性降低，以上結(jié)果證明了miR-491-5p可調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。

A.after transfected miR-491-5p mimic into EJ/5-FU cells, the expression level of miR-491-5p was detected by RT-qPCR; B.cell viabilities of various groups were detected by CCK-8 assay; C,D.cell apoptosis of various groups were detected by annexin/PI staining; E,F.closed woud areas of various groups were detected by scratch assay; G-I.cell migration and invasion of various groups were detected by Transwell assay;scale bar=100 μm; *P<0.01 compared with control group or vehicle group

A-C.expression levels of p-AKT and p-STAT3 proteins in EJ and EJ/5-FU cell line were detected by Western blot; D-F.after transfection miR-491-5p inhibitor, the expression levels of p-AKT and p-STAT3 proteins in EJ cell line were detected by Western blot; G-I.after transfection miR-491-5p mimic, the expression levels of p-AKT and p-STAT3 proteins in EJ/5-FU cell line were detected by Western blot; *P<0.01 compared with miR-NC group

化療后的腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥引起化療失敗的主要體現(xiàn)之一[10]?；熕幬镎T導(dǎo)獲得的化療耐藥細(xì)胞的侵襲與遷移能力高于母本細(xì)胞[11-12]，這表明腫瘤細(xì)胞化療耐藥性和腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲能力具有密切的聯(lián)系。因此，本研究進(jìn)一步觀(guān)察了miR-491-5p對(duì)5-FU誘導(dǎo)遷移與侵襲的影響，結(jié)果顯示，在細(xì)胞系EJ中，敲減miR-491-5p導(dǎo)致5-FU對(duì)細(xì)胞系EJ遷移與侵襲的抑制能力減弱；在EJ/5-FU細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)miR-491-5p能增強(qiáng)5-FU抑制EJ/5-FU細(xì)胞系遷移與侵襲，這些結(jié)果體現(xiàn)miR-491-5p可調(diào)節(jié)5-FU誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞遷移與侵襲。

本研究進(jìn)一步對(duì)miR-491-5p調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞耐5-FU機(jī)制進(jìn)行了探索。在膀胱癌多藥耐藥細(xì)胞中AKT-STAT3信號(hào)活性增強(qiáng)，而AKT或STAT3抑制劑均能逆轉(zhuǎn)膀胱癌多藥耐藥細(xì)胞的化療耐藥性[13-14]。本研究觀(guān)察到在EJ/5-FU細(xì)胞系中p-AKT和p-STAT3表達(dá)高于母本細(xì)胞系EJ；而在miR-491-5p抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系EJ中p-AKT和p-STAT3表達(dá)明顯增加；miR-491-5p模擬物轉(zhuǎn)染的EJ/5-FU細(xì)胞系中，p-AKT和p-STAT3表達(dá)明顯降低。這些結(jié)果表明miR-491-5p可通過(guò)調(diào)節(jié)AKT-STAT3信號(hào)活性來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。

綜上，本實(shí)驗(yàn)證明了miR-491-5p表達(dá)下調(diào)是膀胱癌細(xì)胞5-FU耐藥的標(biāo)志物，且miR-491-5p可通過(guò)抑制AKT-STAT3信號(hào)的激活來(lái)降低膀胱癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。