化學(xué)抑制劑對果蔬食品多酚氧化酶性質(zhì)影響的研究進(jìn)展

周亨樂，王富海，易俊潔，程馮云，袁蕾，?；刍?，周林燕

(昆明理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，云南 昆明， 650500)

酶促褐變是果蔬食品中普遍存在的一種現(xiàn)象，能夠引起果蔬外觀的劣變，導(dǎo)致果蔬的風(fēng)味和營養(yǎng)發(fā)生變化。因此，在食品工業(yè)生產(chǎn)中使用相關(guān)技術(shù)手段對多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO) 進(jìn)行抑制，降低褐變發(fā)生率十分重要。化學(xué)抑制劑因具有方便高效的特點，近年來有關(guān)其對PPO抑制效果的報道越來越多，抑制機理的研究也日趨成熟。本文列舉了五類化學(xué)抑制劑對 PPO的抑制作用和機理，并從分子水平上探討了化學(xué)抑制劑對PPO構(gòu)象的影響。

1 多酚氧化酶

1.1 PPO概述

PPO是自然界一種常見的氧化還原酶，廣泛存在于各種生物中，其在食品工業(yè)有著重要的應(yīng)用[1]。PPO通常先以無活性的前體形式存在，其前體一般由N-端導(dǎo)肽、中間高度保守的Cu結(jié)合區(qū)和C-端疏水區(qū)3部分組成。其中Cu結(jié)合區(qū)是該酶的主要功能區(qū)，其他部分則對酶的構(gòu)象、高級結(jié)構(gòu)的形成和維持起作用。PPO的活性位點在PPO催化反應(yīng)中起著重要作用。如圖1所示，PPO分子的活性位點有兩個Cu，包括CuA和CuB 區(qū)域，CuA 區(qū)域含3個保守的His殘基和1個Cys殘基，CuB區(qū)域含3個或4個保守的His殘基，形成了有特定三維結(jié)構(gòu)的活性部位[2]。

a-正交空間群中雙核銅結(jié)合位點的三維結(jié)構(gòu)；b-用tropolone展現(xiàn)表面活性中心的三維結(jié)構(gòu)圖1 PPO Cu2+活性中心[2]Fig.1 Binuclear copper binding site

不同種植物和同一植物體的不同部位、同一部位的多基因家族的不同成員之間，PPO的分子質(zhì)量不同。PPO是一種寡聚蛋白分子，前體單體的分子質(zhì)量為60～71 kDa，而成熟單體的分子質(zhì)量為40～68 kDa，表明PPO分子由無活性轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘倪^程中經(jīng)過了肽鏈加工[3]。不同種植物之間的PPO常常具有高度的相似性。研究發(fā)現(xiàn)蘋果的PPOs氨基酸序列與番茄、土豆、蠶豆、葡萄等有43%～58%的相似性[4]。PPO是由核基因編碼，多個基因控制，表現(xiàn)出多基因的家族性。其基因的表達(dá)比較復(fù)雜，不同種植物、同一植物體的不同部位及同一部位的多基因家族表達(dá)的種類及表達(dá)的量都不同。例如香蕉其編碼的BPO1與BPO11、BPO34、BPO35之間序列同源性為50%左右，BPO34與BPO35同源性較高，達(dá)80%左右[5]。它們往往具有不同的底物特異性、表達(dá)時間和空間差異，表明PPO參與了多種生理過程。

1.2 PPO的酶促褐變

PPO是引起果蔬酶促褐變的主要內(nèi)源性酶，PPO也因參與果蔬褐變而在食品科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的研究。如圖2所示，PPO的酶促褐變過程是指其在氧分子存在的條件下可催化單酚酶羥基化和將鄰二酚氧化為鄰醌；隨后醌類化合物被氧化成醌衍生物，形成的鄰醌與其他醌、氨基酸、蛋白質(zhì)非酶聚合形成褐色化合物[6]。目前，主要存在3種關(guān)于PPO酶促褐變機理的假說：酚酶區(qū)域分布假說、自由基傷害假說和保護(hù)酶系統(tǒng)假說，其中酚酶區(qū)域性分布假說更受推崇[7]。該假說認(rèn)為在組織細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的PPO，一種是游離態(tài)多酚氧化酶(sPPO)，存在于細(xì)胞質(zhì)中；一種是膜結(jié)合態(tài)多酚氧化酶(mPPO)，束縛于細(xì)胞膜上。由于正常植物組織中的多酚類物質(zhì)分布在細(xì)胞液泡內(nèi)，PPO分布在各種質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，因此多酚類物質(zhì)與PPO難以接觸，即使它們與氧同時存在也不會發(fā)生褐變。而細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)一旦被破壞后，mPPO便游離出來，向sPPO轉(zhuǎn)化，sPPO活性顯著提高，表現(xiàn)PPO和酚類物質(zhì)的區(qū)催化活性[8]。通常只有這種空間隔離被打破，PPO才表現(xiàn)出酶活性。果蔬加工及貯藏過程中的切割、破碎等外加條件會導(dǎo)致膜系統(tǒng)的破壞，打破區(qū)域化分布，酶和底物得以接觸從而引起酶促褐變。

圖2 單酚酶與二酚酶氧化反應(yīng)過程[5]Fig.2 Oxidation mechanism between monophenolase and diphenolase

1.3 PPO對果蔬食品的影響

PPO引起的酶促褐變是造成果蔬劣變的主要原因之一，據(jù)報道，全球50%以上的果蔬及其加工產(chǎn)品的損失是由酶促褐變引起的，其對果蔬產(chǎn)業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[9]。以目前市場上較受歡迎的NFC果蔬汁和鮮切果蔬為例，NFC果蔬汁的生產(chǎn)需先破碎后榨汁，以提高出汁率。在破碎和壓榨過程，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，多酚類物質(zhì)更易溶出，使得果蔬汁中的多酚含量顯著上升，同時更易與PPO接觸，導(dǎo)致嚴(yán)重的酶促褐變發(fā)生。鮮切果蔬以其營養(yǎng)、方便、可食率達(dá)100%等特點深受歡迎，但在去皮、切分等加工過程中，細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)極易受到損傷, 使得細(xì)胞組織與空氣直接接觸，加速了酶促褐變進(jìn)程。這些在貯藏、運輸及加工的過程中不可避免發(fā)生的酶促褐變，影響了果蔬的商業(yè)價值，降低消費者的接受率，嚴(yán)重阻礙了果蔬產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此控制酶促褐變成為果蔬產(chǎn)品加工過程中極其重要的一步。

2 化學(xué)抑制劑

酶促褐變的發(fā)生需要3個條件：底物(多酚類物質(zhì))、氧介質(zhì)、PPO。在實際生產(chǎn)中想要除去食品中PPO底物不僅困難而且不現(xiàn)實，因此使用抑制劑抑制PPO活性是一種有效的手段?；瘜W(xué)抑制劑對PPO具有高效的抑制效果且使用方便，被廣泛應(yīng)用于果蔬產(chǎn)業(yè)，故對它的研究具有廣泛的理論和實際意義。酶化學(xué)抑制劑種類繁多，其抑制機理也各不相同，本文將化學(xué)抑制劑分為以下五類進(jìn)行討論。

2.1 羧酸類

羧酸(carboxylic acid)作為食品組分天然存在于許多植物中，是由烴基與羧基相連構(gòu)成的有機酸。目前發(fā)現(xiàn)很多羧酸類物質(zhì)可作為PPO的有效抑制劑，如檸檬酸、草酸、酒石酸和蘋果酸。檸檬酸作為最常見的羧酸，對芒果[10]、蘋果[11]和香蕉[12]等提取獲得的PPO抑制效果較好。在這些研究中檸檬酸的濃度范圍較寬且大部分有效濃度范圍高于10 mmol/L能抑制80%的PPO活性。草酸是二元酸，對蘋果[11]、香蕉[12]和梨[13]等提取獲得的PPO酶液抑制效果顯著。在這些研究中草酸濃度在10 mmol/L就能有效抑制粗酶液中80%的PPO活性，與其他結(jié)構(gòu)類似的羧酸相比抑制效果更強。同時，羧酸應(yīng)用于食品體系也有著良好的抑制效果。羧酸類對果蔬汁和鮮切果蔬等食品體系中的PPO均有較好抑制效果，且大多抑制劑使用濃度范圍與粗酶體系中相似。例如，添加0.5%～2.5%的檸檬酸于果蔬汁中能較好抑制褐變，采用1%～2%的檸檬酸浸泡鮮切果蔬能較好減少貯藏過程中顏色變化[14]。

羧酸主要通過降低體系pH、螯合銅輔基等2個方面來抑制PPO活性。羧酸作為酸化劑能降低體系pH，導(dǎo)致酶變性或者使酶處于最適pH范圍外[11]。大多果蔬PPO的最適pH值在6.0～7.4，PPO在pH<4.0 時，甚至可完全失去活性。此外，羧酸作為螯合劑能與PPO活性位點的Cu2+相結(jié)合影響酶促反應(yīng)[15]。草酸是食品工業(yè)中常用的金屬螯合劑，與Cu2+具有較高的親和性而形成螯合物，能有效抑制酶活性或減弱酶與底物的親和力[16]。YORUK等[13]報道了草酸通過螯合Cu2+抑制梨的PPO活性，且無法通過透析得到恢復(fù)。

利用調(diào)酸降低pH值抑制果蔬褐變，是果蔬加工中最常用的方法。大多數(shù)羧酸是食品行業(yè)中使用范圍極廣的酸化劑，添加到產(chǎn)品中安全健康、口感好，可促進(jìn)食欲。同時由于其水溶性和脂溶性較好，易于均勻地分散于各類食品中，在食品工業(yè)中常與熱水燙漂聯(lián)合使用能較好抑制PPO活性，護(hù)色效果顯著。但羧酸在產(chǎn)品中的添加量十分關(guān)鍵，添加過少抑制效果不強，添加量過大會造成產(chǎn)品酸化嚴(yán)重，影響產(chǎn)品風(fēng)味。

2.2 抗壞血酸及其衍生物

抗壞血酸及其衍生物(ascorbic acid derivatives)是一種天然抗氧化劑，具有酸的性質(zhì)，是近年來研究最多的亞硫酸鹽替代品?？箟难嶙鳛閼?yīng)用最為廣泛的PPO抑制劑之一，對蘋果[17]、李子[18]和菠蘿[19]等不同來源提取的PPO都具有強烈的抑制效果。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的抗壞血酸濃度在低于1 mmol/L就能抑制粗酶液中90%的PPO酶活性，表明抗壞血酸在緩沖體系中對PPO的抑制是非常有效的。同時抗壞血酸在食品體系中也應(yīng)用廣泛，與緩沖液體系相比，食品體系中所用抗壞血酸濃度普通更高?？箟难崽砑拥焦咧械臐舛葹?.7～500 mmol/L，有效濃度在57 mmol/L對PPO即可達(dá)到80%的抑制率；在鮮切果蔬中使用高于100 mmol/L的抗壞血酸對PPO即可達(dá)到80%的抑制率，有效延緩鮮切果蔬的褐變[20]。此外，抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣、磷酸抗壞血酸等抗壞血酸衍生物也能較好地抑制PPO活性，如添加1%的抗壞血酸鈣可有效抑制鮮切鴨梨的褐變發(fā)生[21]。

抗壞血酸作為常用的抑制劑，其抑制作用主要是作為還原劑將酚還原成醌類物質(zhì)，同時作為螯合劑與PPO的輔基Cu2+螯和，從而延緩或消除了褐變過程[17]。此外，還有研究表明抗壞血酸可通過和酚類物質(zhì)競爭氧以減緩反應(yīng)進(jìn)程，其在果汁中可作為抗壞血酸氧化酶的底物在酶的催化作用下把將溶解在果汁中的氧消耗掉，從而抑制褐變[22]。

抗壞血酸是實際生產(chǎn)中較為理想的抑制劑，其安全性高、價格低廉，在工業(yè)生產(chǎn)中可以廣泛的應(yīng)用?？箟难岢艘种坪肿?，作為還原劑可降低護(hù)色液的氧含量，具有漂白色素的作用，而且還能使VC維持在一個較高的水平上，提高了果蔬產(chǎn)品的食用價值和外觀品質(zhì)，具有深遠(yuǎn)的經(jīng)濟意義。然而，在實際生產(chǎn)中抗壞血酸的添加量十分重要，若添加量過少，不僅不能抑制褐變，反而會引起羰氨反應(yīng)造成非酶褐變；若添加量過多，會導(dǎo)致成品在貯存期間因氧化后所形成的酮化合物與氨化合物發(fā)生非酶促褐變反應(yīng)，從而加劇成品的變色[23]。

2.3 含硫氨基酸

含硫氨基酸(suifur-containing amino acids)是指分子式中含有硫元素，且這些硫元素形成的巰基等化學(xué)鍵具有一定的生理功能。L-半胱氨酸是最常用的含硫氨基酸抑制劑，對芒果[10]、李子[18]等提取獲得的PPO具有較好的抑制效果。大部分研究發(fā)現(xiàn)L-半胱氨酸的濃度低于1 mmol/L時就能對PPO粗酶液表現(xiàn)出90%以上的抑制效果，甚至在低于0.1 mmol/L時也具有較好的抑制效果。同樣地，L-半胱氨酸在食品體系中也能較好抑制PPO活性，使用10 mmol/L以上的L-半胱氨酸處理鮮切蘋果、梨汁等可降低80%的PPO活性。此外，使用乙酰基半胱氨酸和谷胱甘肽也能較好抑制鮮切果蔬的PPO活性，其濃度大多在50 mmol/L就能較好抑制PPO活性，有效延緩褐變[24]。

目前，關(guān)于含硫氨基酸抑制PPO酶促褐變機制的研究眾多，但抑制機理仍存在爭議。以L-半胱氨酸為例，一是認(rèn)為其抑制機理主要是因為L-半胱氨酸可以使多酚被氧化后生成的醌不與其他醌類、氨基酸和蛋白質(zhì)等聚合生成絡(luò)合物，而直接與其結(jié)合形成一種新的無色硫氫化合物，從而阻礙了酶促褐變反應(yīng)進(jìn)程；二是認(rèn)為L-半胱氨酸中的SH基團(tuán)對PPO活性區(qū)域的Cu2+具有很強的親和力，能去除活性中心的Cu2+或取代與Cu緊密配合的His殘基，從而改變PPO活性中心的結(jié)構(gòu)使酶活降低；三是認(rèn)為L-半胱氨酸并非阻止PPO氧化酚類，而是阻止酚類的聚合從而抑制褐變發(fā)生[25]。

L-半胱氨酸是PPO良好的抑制劑，尤其是在高濃度下其抑制效果顯著。但高濃度的L-半胱氨酸會產(chǎn)生令人惡心的氣味，同時因其具有漂白作用，能嚴(yán)重破壞食品風(fēng)味和外觀。因此要想有效抑制PPO酶活性，可以考慮采用多種抑制劑聯(lián)合的方法。抑制劑聯(lián)合是果蔬加工中常用的方法之一，多為2種或2種以上復(fù)合使用，且符合食用級標(biāo)準(zhǔn)。近年關(guān)于L-半胱氨酸與其他抑制劑聯(lián)合使用效果的研究越來越多，通常L-半胱氨酸可與抗壞血酸或適量的pH調(diào)節(jié)劑如檸檬酸、蘋果酸、醋酸等既可降低pH值抑制褐變發(fā)生率，又能較好保持產(chǎn)品的產(chǎn)品風(fēng)味和外觀。

2.4 酚酸

酚酸(phenolic acids)是一類含有酚環(huán)的有機酸，水果和蔬菜中含有許多種類的酚酸，其中一部分可作為PPO的底物而引起褐變，另一部分則可對PPO有抑制作用。肉桂酸存在于多種植物中，具有低毒、良好的生理活性等特征，能有效抑制棕櫚[26]、菠蘿[19]等不同來源提取獲得的PPO活性。在上述研究中肉桂酸的濃度低于5 mmol/L可以抑制75%的PPO酶活，表明肉桂酸是一種有效的PPO抑制劑。同時研究發(fā)現(xiàn)肉桂酸衍生物對 PPO也具有抑制效果，如阿魏酸、2-氯肉桂酸等可展現(xiàn)出較強的抑制效果[27]。此外，沒食子酸、咖啡酸、曲酸也是常見的PPO抑制劑。尤其是曲酸在許多研究中發(fā)現(xiàn)其濃度低于1 mmol/L時可使提取獲得的PPO受到強烈抑制，甚至0.1 mmol/L的曲酸就有70%的抑制率。曲酸具有無色無味的優(yōu)點, 加入果蔬汁中不改變其口味，1 mmol/L的曲酸即可較好抑制蘋果汁中PPO活性，是優(yōu)良的護(hù)色劑。

酚酸大多是競爭性抑制劑，具有與酚類底物類似的結(jié)構(gòu)，能夠占據(jù)酶的催化中心，從而阻礙底物的進(jìn)入。肉桂酸及其衍生物主要是通過競爭性地占據(jù)PPO活性中心的位置，與PPO中雙核Cu2+螯合，抑制PPO活性。此外，還有研究認(rèn)為有些肉桂酸衍生物可被催化氧化成醌類物質(zhì)，能與酶和底物的復(fù)合體結(jié)合，從而抑制產(chǎn)物的生成[28]。曲酸、沒食子酸等酚酸可作為螯合劑與雙銅離子強烈結(jié)合，阻礙底物進(jìn)入酶催化中心，抑制PPO活性。KAHN等[29]認(rèn)為曲酸的抑制機理還可能是因為曲酸具有抗氧化性，它的酚羥基可以被還原，通過去除氧以干擾酶促反應(yīng)。

酚酸類抑制劑是PPO的良好抑制劑，但與模擬體系相比，酚酸在食品體系中的研究和應(yīng)用相對較少，這可能是由于酚酸類抑制劑具有不明確的安全性和較低的水溶解度所致，因此在食品工業(yè)中較少使用此類抑制劑。

2.5 其他

除了上述四類抑制劑外，還有一些物質(zhì)對PPO有較好的抑制效果。

蜂蜜是一種甜物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜能通過降低果汁中溶解氧的擴散速率來抑制變色，添加2.0%的蜂蜜可有效抑制PPO活性[30]；據(jù)報道，洋蔥的榨汁液能有效抑制蘋果汁、鮮切蘋果及萵苣的褐變，在這些食品中添加1%的洋蔥榨汁液可降低70%的PPO活力，并且洋蔥榨汁液經(jīng)加熱后會產(chǎn)生許多巰基化合物，巰基化合物可增強洋蔥的抑制效果[31]；4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol,4-HR)由于其無毒、非致突變性和非致癌特性，在食品工業(yè)中具有潛在的用途。GUERRERO等[32]研究發(fā)現(xiàn)4-HR與PPO的底物結(jié)構(gòu)類似，其能優(yōu)先結(jié)合到 PPO的活性部位，從而阻礙酶與底物的接觸，抑制褐變的發(fā)生。因此4-HR作為一種高效的PPO抑制劑，使用0.1%的4-HR就能降低80%的提取獲得的PPO活性[33]。此外，杜仲葉提取物、原花青素、茶葉提取物、桑樹皮和桑樹枝提取物等均能較好抑制PPO活性，但它們的抑制機理還未明確，在食品體系中的研究較少。

3 抑制劑對 PPO 的構(gòu)象影響

酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)主要依靠大量較弱的次級鍵以及弱相互作用共同維持，PPO活性中心和它的三維構(gòu)象有關(guān)，其中任何微小變化都可能導(dǎo)致酶失去活性。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)能對PPO產(chǎn)生強酸作用、螯合作用、還原作用及強結(jié)合作用的化學(xué)抑制劑可以通過影響PPO的構(gòu)象來抑制PPO活性。

目前常采用圓二色光譜儀、紅外光譜儀、熒光光譜儀等儀器來研究酶蛋白三維結(jié)構(gòu)的變化。圓二色(circular dichroism,CD)光譜可以反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈二級結(jié)構(gòu)變化的信息；紅外光譜可以研究分子的結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵，并由此推測分子的立體構(gòu)型；熒光光譜可以分析蛋白質(zhì)分子在不同環(huán)境下的構(gòu)象變化。此外，分子對接技術(shù)可以通過研究復(fù)合物中2個分子正確的結(jié)合位點和最佳取向，明確底物構(gòu)象在形成復(fù)合物過程中的變化來探究抑制劑作用機理。

3.1 強酸作用

PPO對pH的變化敏感，高酸性環(huán)境會使酶蛋白上的Cu2+解離下來，造成PPO變性。檸檬酸、蘋果酸、乳酸等是良好的酸化劑，即使在具有高離子強度的緩沖液中也能導(dǎo)致體系pH的明顯下降，抑制PPO活性。

ZHOU等[34]研究了檸檬酸處理PPO后的構(gòu)象變化，發(fā)現(xiàn)隨著檸檬酸濃度增加，PPO二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋含量逐漸降低，β-折疊含量逐漸增加，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。同樣地，SHI等[35]通過CD光譜分析，發(fā)現(xiàn)在強酸環(huán)境下PPO的α-螺旋和β-折疊含量減少，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量增加。α和β鏈的改變會導(dǎo)致多肽主鏈的部分延伸，從而使PPO的構(gòu)象變得松散，造成構(gòu)象變化。此外，酸性環(huán)境還會導(dǎo)致酶蛋白三級結(jié)構(gòu)的部分破壞。LIU等[36]分析了檸檬酸處理PPO的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)隨著檸檬酸濃度增大，PPO的熒光強度逐漸降低，最大熒光發(fā)射波長出現(xiàn)紅移。強酸環(huán)境引起的PPO變性可使部分內(nèi)埋的氨基酸殘基暴露在更為親水的環(huán)境中，導(dǎo)致熒光強度出現(xiàn)下降。同樣地，方志超等[37]研究了乳酸作用PPO的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)隨著溶液pH的降低，PPO熒光強度也不斷降低，表明乳酸處理能破壞PPO三級結(jié)構(gòu)。靜電相互作用是化學(xué)鍵-離子鍵形成的本質(zhì)，是影響蛋白酶結(jié)構(gòu)、結(jié)合特異性和生物功能的重要因素之一。在酚酶多肽鏈的不同部位，存在著酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基，因而在不同部位的側(cè)鏈基團(tuán)之間存在靜電相互作用。但這種靜電相互作用易受到強酸環(huán)境的影響，強酸可通過質(zhì)子化和去質(zhì)子化效應(yīng)來改變酶的離子化狀態(tài)，從而造成酶構(gòu)象變化[38]。

3.2 螯合作用

螯合作用是將具有供電子基團(tuán)的化合物與金屬離子結(jié)合并形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物。PPO活性中心包含2個Cu2+位點，在氧氣的傳遞和底物的氧化上起到重要作用，Cu2+可作為中心離子參與螯合作用。草酸、檸檬酸、曲酸等是常見的螯合劑，可通過螯合作用抑制PPO活性。

RAPEANU等[39]通過紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)加入草酸后，其紅外光譜強度出現(xiàn)增加，表明酶蛋白的骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。嚴(yán)莉等[40]通過熒光光譜分析，發(fā)現(xiàn)隨著草酸濃度增加，PPO熒光強度不斷下降，并伴隨著熒光猝滅。在正常生理條件下，PPO活性區(qū)域中的多肽鏈氫鍵網(wǎng)絡(luò)排列規(guī)整，PPO始終維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。草酸分子與Cu2+螯合后，可導(dǎo)致酶活性區(qū)域的氫鍵網(wǎng)絡(luò)發(fā)生重排，多肽鏈更為伸展，進(jìn)而引起整體構(gòu)象的改變。NOKTHAI等[41]通過分子對接模擬發(fā)現(xiàn)(圖3)，草酸分子大部分被掩埋進(jìn)入PPO活性位點內(nèi)，進(jìn)入活性位點內(nèi)的草酸通過氫鍵與Cu2+和帶負(fù)電荷的His殘基相互作用，鍵合成具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的配合物，破壞了該區(qū)域的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。同樣地，LIU等[42]通過CD光譜分析，發(fā)現(xiàn)隨著曲酸濃度增加，二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-螺旋出現(xiàn)增加。同時通過熒光光譜，發(fā)現(xiàn)PPO熒光強度不斷下降， Trp殘基周圍微環(huán)境的疏水性逐漸減弱。抑制劑與PPO螯合形成絡(luò)合物的過程，可導(dǎo)致其活性位點中的多肽鏈氫鍵網(wǎng)絡(luò)重排，造成了PPO天然構(gòu)象不穩(wěn)定，再加上活性區(qū)域的疏水性減弱，進(jìn)而導(dǎo)致了酶構(gòu)象的變化。

圖3 PPO與草酸分子對接模擬圖[41]Fig.3 Docking simulation of PPO and oxalic acid

3.3 還原作用

抗壞血酸、L-半胱氨酸等具有還原作用的抑制劑可通過將醌還原成酚或與醌形成無色的硫醇-醌復(fù)合物，阻斷了褐變產(chǎn)物形成抑制PPO酶活。

SI等[43]研究了抗壞血酸作用PPO后的CD光譜，發(fā)現(xiàn)PPO的α-螺旋含量降低，β-折疊和無規(guī)則卷曲的含量增加，PPO二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；通過熒光光譜分析，發(fā)現(xiàn)PPO熒光不斷降低，內(nèi)源熒光遭到猝滅，三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變?？箟难崮軌蜻M(jìn)入PPO活性區(qū)域，引起PPO活性位點氧化還原狀態(tài)的改變，對其產(chǎn)生的還原作用可直接引起酶構(gòu)象的改變。SENOL等[44]通過分子對接技術(shù)研究(圖4)，發(fā)現(xiàn)抗壞血酸進(jìn)入酶活區(qū)域后，與PPO活性位點Phe264、His263、Ser282和Val283的氨基酸殘基相互作用，并與His178和Lys180建立氫鍵，形成酶-抗壞血酸(AA-PPO)復(fù)合物。在AA-PPO配合物結(jié)合位點處存在疏水作用，催化位點的疏水性導(dǎo)致活性位點發(fā)生變化。同樣地，BISWAS等[45]通過測定L-半胱氨酸處理PPO后的內(nèi)源熒光，發(fā)現(xiàn)L-半胱氨酸對內(nèi)源性熒光有一定的親水作用，并隨著濃度增加PPO表面疏水不斷增強，PPO構(gòu)象發(fā)生變化。L-半胱氨酸的還原作用使PPO發(fā)生部分去折疊，能直接誘導(dǎo)疏水表面的暴露，導(dǎo)致PPO三級結(jié)構(gòu)變化[46]。還原類抑制劑與PPO特異性結(jié)合后，能直接引起PPO區(qū)域活性位點上構(gòu)象的變化，即表現(xiàn)為疏水表面的逐漸暴露，活性位點疏水性增強。

圖4 PPO與抗壞血酸對接模擬圖[44]Fig.4 Docking simulation of PPO and ascorbic acid diagram

3.4 強結(jié)合作用

具有強結(jié)合作用的抑制劑會附著在活性位點或非活性位點形成復(fù)合物，通過空間位阻或改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，抑制酶活。這些抑制劑大多是競爭性抑制劑，肉桂酸及其類似物可通過強結(jié)合作用來有效抑制PPO酶活。

ZHOU等[34]研究了肉桂酸對PPO構(gòu)象的影響，通過CD光譜分析，發(fā)現(xiàn)隨著肉桂酸濃度增加，其負(fù)橢圓值逐漸變大，表明PPO的有序結(jié)構(gòu)出現(xiàn)下降；同時PPO中的α-螺旋含量逐漸下降，β-折疊含量略微上升，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；通過熒光光譜分析，發(fā)現(xiàn)PPO熒光強度逐漸降低，最大吸收峰出現(xiàn)紅移，PPO三級結(jié)構(gòu)遭到破壞?？梢?，肉桂酸與PPO的強結(jié)合既能引起 PPO二級結(jié)構(gòu)發(fā)生重排又導(dǎo)致PPO三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。YU等[47]用分子模擬分析PPO與肉桂酸結(jié)合方式(圖5)，發(fā)現(xiàn)肉桂酸能夠嵌入PPO的疏水空腔，其苯環(huán)與His263殘基形成π-π堆積，肉桂酸與PPO結(jié)合后能形成一個牢固的復(fù)合物，破壞了Trp、Tyr與銅離子之間的氫鍵，造成PPO功能損失。同樣地，CUI等[48]研究了4-氯肉桂酸和4-乙氧肉桂酸兩種肉桂酸衍生物對PPO的熒光變化，發(fā)現(xiàn)兩者均能對PPO的內(nèi)源熒光有猝滅作用，最大發(fā)射峰發(fā)生明顯的位移，PPO三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。肉桂酸類抑制劑與PPO多肽鏈結(jié)合后，表現(xiàn)出強黏結(jié)作用，能破壞PPO活性區(qū)域附近的一些氨基酸殘基與Cu2+之間的氫鍵，導(dǎo)致PPO多肽鏈氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)重排，PPO構(gòu)象發(fā)生改變。

圖5 PPO與肉桂酸分子對接模擬圖[47]Fig.5 Docking simulation of PPO and cinnamic acid

4 展望

由于PPO來源廣泛，不同種類之間又存在一定的差異性，導(dǎo)致相同抑制劑對不同PPO產(chǎn)生的抑制效果也會不盡相同。隨著科研工作者對不同果蔬食品中PPO的酶學(xué)研究不斷深入，PPO的性質(zhì)、酶促褐變機理、各種酚類底物與PPO的親和力差異、化學(xué)抑制劑對PPO活性的抑制機理等內(nèi)容將會越來越豐富和清晰。

目前，關(guān)于化學(xué)抑制劑對 PPO 活性影響的研究較多，但是對于化學(xué)抑制劑處理后PPO分子構(gòu)象變化的研究較少。關(guān)于 PPO 的活性位點Cu2+的變化、酶促褐變機理、PPO二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)變化以及構(gòu)象變化與酶促褐變反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)等方面還有待進(jìn)一步研究探討。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)、分子和動力學(xué)模擬等技術(shù)將更多的應(yīng)用于PPO研究，同時加強從分子水平上對PPO的深入研究，可為探明酶促褐變機理提供更多新方法。