許 博，孫夢瑤，吳秋雪，張 輝，湯慶豐

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院老年科，上海 200062；2.上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院中心實驗室，上海 200062；3.上海中醫(yī)藥大學交叉科學研究院，上海 201203)

消化系統(tǒng)由消化道和消化腺兩部分組成，包括口腔、咽、食管、胃、小腸(十二指腸、空腸、回腸)及大腸(盲腸、結腸、直腸)、唾液腺、肝臟、膽胰等。消化系統(tǒng)惡性腫瘤是目前尚未攻克的難治疾病，發(fā)病率位居我國癌癥發(fā)病率的前列，由于其臨床發(fā)病較為復雜隱匿，早期多無明顯的臨床體征和癥狀，常被忽視，發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于疾病進展期，同時有效的治療方法十分有限，故死亡率較高[1-2]。

外泌體(exosome)作為一種細胞外囊泡，具有脂質(zhì)雙層膜結構，可以通過轉運其來源細胞的活性物質(zhì)，發(fā)揮調(diào)控靶細胞的作用[3]。外泌體蛋白質(zhì)介導的腫瘤細胞間的信號轉導在腫瘤的早期發(fā)生和其發(fā)展中起重要的作用[4]。隨著蛋白質(zhì)組學技術的普及，更多的外泌體蛋白質(zhì)的組成和功能相繼被揭示。多項研究表明外泌體攜帶的蛋白質(zhì)在不同腫瘤中存在差異性表達，檢測這些特征性外泌體蛋白質(zhì)可能對各種腫瘤的診斷和治療有非常重要的價值。本文針對外泌體蛋白質(zhì)在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的相關文獻進行總結歸納，對其在生物學特征、作用、機制、診斷及治療中的應用價值進行綜述。

1 外泌體蛋白質(zhì)的基本生物學特性

外泌體蛋白質(zhì)，總的可以分為兩大類：非特異性和特異性。非特異性蛋白質(zhì)是細胞內(nèi)普遍存在的蛋白質(zhì)，包括酶類，如甘油醛3-磷酸脫氫酶、過氧化氫酶；信號轉導相關蛋白質(zhì)，如蛋白質(zhì)激酶、14-3-3蛋白、β-連環(huán)蛋白；膜轉運相關蛋白質(zhì),如CD9、CD35、CD63、CD81、浮艦蛋白；分子伴侶,如熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)；融合相關蛋白質(zhì),如膜聯(lián)蛋白、Rabs蛋白；細胞黏附相關蛋白質(zhì),如整合素、乳凝素；多泡體生成相關蛋白質(zhì)等。特異性蛋白質(zhì)與細胞特殊功能有關,成分與細胞來源密切相關[5]，例如：結腸上皮細胞來源的外泌體常常攜帶多種特異性抗原和代謝酶外泌體蛋白質(zhì)；而腫瘤來源的外泌體常常攜帶腫瘤抗原和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體、死亡誘導因子配體、轉化生長因子-β等外泌體蛋白質(zhì)。

2 外泌體蛋白質(zhì)在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的作用及機制

外泌體蛋白質(zhì)是細胞間交換物質(zhì)、傳遞信息的特別重要的信使，能影響正常的生理過程，在腫瘤等多種疾病發(fā)生發(fā)展中起到非常關鍵的作用[6]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展依賴于腫瘤微環(huán)境(tumor microenvi-ronment,TME)。TME是癌細胞和周圍基質(zhì)細胞的集合，外泌體的含量明顯增多,特別富含P53、磷酸酶和HSP等蛋白質(zhì)[7]，具有組織缺氧、間質(zhì)高壓形成、產(chǎn)生細胞趨化因子和生長因子等,從而具有激發(fā)免疫炎性反應等特點[8]。適宜的TME可直接或間接地影響腫瘤細胞的生長，其機制包括促進腫瘤血管生成、改變腫瘤的生物學表型等。如外泌體蛋白質(zhì)在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的作用及機制見表1。

表1 外泌體蛋白質(zhì)在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的作用及機制Tab.1 The role and mechanism of exosomal proteins in malignant tumors of the digestive system

2.1 外泌體蛋白質(zhì)與腫瘤生長

外泌體蛋白質(zhì)能夠誘導腫瘤的生長，是通過將與腫瘤發(fā)生相關的信息傳遞給正常組織或細胞實現(xiàn)的。

Zhang等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)，是胃癌細胞來源的外泌體蛋白質(zhì)，可以促進轉移性肝癌生長，通過將EGFR遞送至肝臟，并整合至肝基質(zhì)細胞的質(zhì)膜上，來激活肝細胞生長因子(human growth factor,HGF)，上調(diào)的HGF與位于胃癌細胞c-MET受體結合來實現(xiàn)。Li等[10]分別采用胃癌細胞來源的不同濃度外泌體蛋白CD97處理胃癌細胞，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)高表達的CD97可作用于激活絲裂原活化蛋白質(zhì)激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號轉導通路,實現(xiàn)了上調(diào)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular sigal-regulated protein kinase,ERK)，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和MAPKp38，進而有效促進胃癌細胞增殖和侵襲。Liu等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體蛋白CD97在胃癌中的表達增強與明顯的惡性程度相關，CD97高表達的胃癌組織來源的外泌體可發(fā)揮促血管生成作用而使胃癌細胞增殖能力提高20%。

Demory等[12]研究發(fā)現(xiàn),由K-ras基因突變的結腸癌細胞分泌的外泌體中含有K-ras基因突變表達的外泌體蛋白質(zhì)，可以轉移至具有野生型K-ras基因的結腸癌細胞，促進其生長，加速腫瘤細胞的增殖。此外，Tauro等[13]發(fā)現(xiàn)，結腸癌細胞分泌的外泌體含有上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、封閉蛋白7和CD44，這些外泌體蛋白質(zhì)與腫瘤的生長十分相關。

2.2 外泌體蛋白質(zhì)與腫瘤侵襲轉移

腫瘤來源的外泌體蛋白質(zhì)中富含血管相關生長因子，可誘導血管生長相關因子基因高表達，促進內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和出芽[14]，從而有利于腫瘤進展。外泌體蛋白質(zhì)可通過激活腫瘤上皮細胞間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[15]，來獲得更強的遷移和侵襲能力的間質(zhì)表型，與此同時，外泌體蛋白質(zhì)參與腫瘤細胞對宿主免疫的逃避、調(diào)控對宿主細胞與血管的重塑等促進腫瘤侵襲轉移的生物學過程。

Blomme等[16]的研究首次發(fā)現(xiàn)來自胰腺癌細胞系的BxPC-3細胞外泌體蛋白——肌鐵蛋白(myoferlin)明顯高表達，myoferlin的缺失可顯著降低外泌體與人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的融合，進而抑制HUVEC的增殖和遷移。

Mao等[17]發(fā)現(xiàn)在p53基因缺失的小鼠骨髓MSCs來源的外泌體中大量富集外泌體蛋白(ubiquitin protein ligase E3 component n-recogin,UBR2)。將p53基因缺失小鼠骨髓MSCs來源的外泌體作用于小鼠MFC胃癌細胞后，可通過激活β-catenin信號通路,促進胃癌細胞增殖、遷移能力。

Zhong等[18]發(fā)現(xiàn)來自胃癌患者熱處理過的惡性腹腔積液的外泌體在體外能夠促進樹突細胞(dendritic cell,DC)成熟并誘導腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞反應。根據(jù)檢測結果，與未經(jīng)熱處理的胃癌患者腹水制備的外泌體相比，這些過程與外泌體中存在更高水平的HSP70和HSP60蛋白有關。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞經(jīng)過熱激處理后，可以獲得高表達外泌體蛋白HSP70，可以致敏DC，促進抗腫瘤免疫應答,為外泌體蛋白介導腫瘤逃避免疫提供證據(jù)[19-20]。

COSTA-SILVA等[21]提出，胰腺癌外泌體中含有明顯高表達的巨噬細胞遷移抑制因子(macro-phage migration inhibitory factor,MIF)，MIF可與肝臟Kupffer細胞結合，誘導這些細胞產(chǎn)生轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)。TGF-β隨后激活肝星狀細胞，上調(diào)纖連蛋白(fibronection,FN)。骨髓源性細胞(即巨噬細胞)與富含F(xiàn)N的肝臟部位結合，最終導致肝轉移前生態(tài)位的形成，從而支持腫瘤細胞轉移。

研究發(fā)現(xiàn)，通過消減EMSA-SELEX篩選,外泌體血管蛋白VASN在肝癌的血清和組織樣本中高表達，并證實VASN能促進細胞增殖和遷移[22]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，VASN是Ⅰ型跨膜蛋白，在腫瘤的發(fā)展和血管生成中起重要作用并證實VASN可能是腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞之間溝通的關鍵介質(zhì)[23]。XIE等[24]研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞(Hep3B和MHCC97H)來源的外泌體高表達血管生成素2重組蛋白(recombinant angiopoitetin 2,ANGPT2)，并可通過外泌體內(nèi)吞作用將其傳遞到HUVECs，這種傳遞通過Tie2顯著增加血管生成。此外，CRISPR-Cas系統(tǒng)敲除ANGPT2后顯著抑制肝癌細胞(hepatocellular carcinoma,HCC)外泌體蛋白ANGPT2誘導的血管生成，并能明顯抑制HCC中EMT的激活。研究發(fā)現(xiàn)LOXL4升高與腫瘤分化程度、血管浸潤和腫瘤淋巴結轉移(TNM)分期有關，并證實LOXL4在HCC中表達異常，LOXL4通過調(diào)節(jié)FAK/Src通路和肝癌中HUVECs的增殖、遷移等，從而促進腫瘤轉移。

2.3 外泌體蛋白質(zhì)與腫瘤耐藥

由于遺傳或表型變化(內(nèi)在抗性)，腫瘤細胞內(nèi)可能產(chǎn)生治療抗性，或者它可能是與腫瘤微環(huán)境相互作用(外在抗性)的結果。在腫瘤細胞和TME相互作用下導致腫瘤耐藥。

Fan等[26]研究發(fā)現(xiàn)，耐藥的胰腺癌腫瘤細胞外泌體相比于吉西他濱敏感細胞外泌體攜帶明顯高表達的EphA2蛋白，且EphA2蛋白高表達可誘導吉西他濱敏感性胰腺癌細胞化療耐藥，但目前具體機制并不清楚。

研究發(fā)現(xiàn),來自成纖維細胞的外泌體Wnt蛋白可以誘導結腸癌細胞的去分化以促進結直腸癌的化療耐藥，干擾基質(zhì)細胞外泌體Wnt蛋白轉移可以有助于改善結腸癌化療耐藥性和治療效果不佳的問題[27-28]。

3 外泌體蛋白質(zhì)在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的應用價值

3.1 診斷和預后

臨床上對于消化系統(tǒng)惡性腫瘤診斷，通常依靠組織活檢技術，取材要求高，操作難度大。來自體液的外泌體會選擇性富集癌癥病變的特征性蛋白質(zhì)，選擇檢測這些外泌體蛋白質(zhì)可能輔助癌癥等的疾病診斷，因此液體活檢可作為一種當前全新的技術，避免了手術開刀或穿刺對患者造成的創(chuàng)傷，方便，容易實施，安全，可選取血液、唾液、胸腹水、尿液等體液[29]。而外泌體蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)受體細胞生命活動的功能，并可以釋放到外周血循環(huán)系統(tǒng)中，故外泌體蛋白質(zhì)可作為一種新的無創(chuàng)診斷和評價療效的潛在生物標志物[30]。Guo等[31]開發(fā)出紙基等速電泳技術，能夠快速選擇與目標外體相關的蛋白質(zhì)生物標志物，代表了將腫瘤衍生的外泌體的檢測轉化為醫(yī)療保健的重要步驟。外泌體蛋白質(zhì)在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的判斷和預后見表2。

表2 外泌體蛋白質(zhì)與消化系統(tǒng)惡性腫瘤的診斷和預后Tab.2 Diagnosis and prognosis of exosomal protein in digestive system malignant tumors

Loei等[32]研究發(fā)現(xiàn)將胃癌細胞來源的外泌體蛋白質(zhì)譜經(jīng)相對和絕對定量放射性核素標記技術(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)聯(lián)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析后，外泌體蛋白血清顆粒體蛋白(granulin,GRN)在胃腫瘤組織尤其是早期胃癌中的表達水平顯著高于正常胃組織，故將血清GRN作為診斷胃癌的生物學標記物。相關研究[33-34]通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測胃癌患者血清中外泌體蛋白質(zhì)組學特征，發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清血中外泌體蛋白TRIM3的水平明顯低于健康人，TRIM3可以作為胃癌診斷的生物標志物。Yoon等[35]發(fā)現(xiàn)，胃癌患者中外泌體蛋白胃動蛋白1(gastro-kine 1,GKN1)的表達水平顯著低于正常對照人群，晚期胃癌患者中GKN1的表達水平低于早期胃癌患者，在正常對照、萎縮性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化生和胃癌患者中呈逐漸降低的趨勢，提示GKN1可以較好地區(qū)分正常和胃良惡性疾??；并且GKN1可鑒別胃癌與結腸癌和肝癌。這一研究提示,外泌體蛋白GKN1可能是胃癌早期診斷和鑒別診斷的潛在指標。

Melo等[36]發(fā)現(xiàn)硫酸乙酰肝素蛋白多糖家庭的一種細胞表面蛋白(glypican-1,GPC1)在胰腺來源的外泌體富集，GPC1能夠區(qū)分不同程度的胰腺疾病患者，如健康受試者、良性胰腺疾病患者及早、晚期胰腺癌患者,特別如果結合影像學檢查，可以及時的對早期胰腺癌患者進行手術治療，是治療的檢測指標和預后指標。Adamczyk等[37]發(fā)現(xiàn),胰腺癌細胞分泌不同形式的EGFR，不同形式的外泌體蛋白EGFR在體內(nèi)可能承擔著不同的功能，可以作為血清生物標志物輔助診斷和治療靶點。

Santasusagna等[38]發(fā)現(xiàn)，結腸癌患者外周血中的外泌體蛋白細胞外基質(zhì)(extracelluar matrix 1,ECM1)的高表達與結腸癌復發(fā)、肝轉移有關。

Atay等[39]對胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)衍生的外泌體首次高通量蛋白質(zhì)組學研究，鑒定了構成其核心蛋白質(zhì)組的1060 種蛋白如KIT、SPRY4，提供了對GIST衍生的癌體蛋白質(zhì)組的首次見解，并進一步了解其促癌作用和耐藥性的致癌成分胃腸道間質(zhì)腫瘤衍生的外來體蛋白質(zhì)組的見解揭示了新的潛在診斷生物標志物。

Li等[40]研究發(fā)現(xiàn)大腸癌患者手術前腫瘤組織和血漿中GPC1+外泌體的百分率和GPC1蛋白表達均明顯高于正常對照組，血漿外泌體蛋白GPC1升高是大腸癌診斷的特異性標志物,也是大腸癌治療的靶點。

隨著快速大規(guī)模生產(chǎn)、純化、提取和篩選外泌體內(nèi)容物的發(fā)展，可以探索外泌體蛋白質(zhì)的應用，以用于早期癌癥診斷,監(jiān)測和預后評估[41]。

3.2 治療價值

外泌體蛋白質(zhì)可介導腫瘤發(fā)生、生長、轉移等，因此干預外泌體蛋白質(zhì)的發(fā)生、釋放、細胞攝取等生物學過程的干預有助于腫瘤治療。外泌體蛋白質(zhì)在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的治療見表3。

表3 外泌體蛋白質(zhì)與消化系統(tǒng)惡性腫瘤的治療Tab.3 Exosomal protein in the treatment of malignant tumors of the digestive system

Fu等[33]發(fā)現(xiàn)將攜帶豐富TRIM3蛋白的外泌體作用于胃癌細胞,具有抑制胃癌生長和轉移的效果，表明采用外泌體轉運抑癌蛋白質(zhì)是一種潛在的胃癌生物治療方法。

Gobbo等[19]提出，抑制腫瘤源性外泌體表面的熱休克蛋白質(zhì)70活性可提高腫瘤免疫療法的療效。

Chen等[42]在小鼠肝癌模型中阻斷外泌體蛋白質(zhì)Rab27a，可減少外泌體的分泌，繼而減少外泌體中多泡體生成相關蛋白，抑制原發(fā)性腫瘤生長。

Xie等[24]研究發(fā)現(xiàn)，由HCC細胞分泌的外泌體蛋白血管生成素樣蛋白2(angiopoietin like protein 2,ANGPT2)誘導的腫瘤血管生成的新途徑，不同于經(jīng)典的ANGPT2/Tie2途徑。這種方式可能是抗血管生成治療的潛在治療靶標。

Gai等[43]研究發(fā)現(xiàn)，高爾基體膜蛋白1(Golgi membrane protein 1,GOLM1)是HCC的血清標志物，而miR-145通過靶向GOLM1基因的編碼序列抑制GOLM1表達。富含GOLM1的肝癌細胞外泌體可激活受體細胞的GSK-3β/MMPs信號軸，加速細胞增殖和遷移。因此靶向mTOR/miR-145/GOLM1信號通路可用于HCC治療。

腫瘤細胞分泌的外泌體蛋白質(zhì)既能夠促進腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉移等生物學過程，抑制機體的免疫反應，還可以增加腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性，因而對腫瘤的治療有重要價值，可能成為攻克腫瘤耐藥的重要靶點[44]。

3.3 外泌體載藥系統(tǒng)

外泌體可作為基因治療藥物的載體或基因治療藥物載體。有研究表明，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)的樹突供體細胞是構建有效外泌體藥物遞送的重要前提，特別是未成熟樹突供體細胞很可能是外泌體的一個理想供體細胞[44]。

Zhong等[18]將分離獲得的胃癌患者的惡性腹腔積液細胞，經(jīng)熱處理后提取外泌體攜載更多熱休克蛋白，免疫原性增強，從而促進樹突狀細胞成熟和功能有關，提示熱應激條件下惡性腹腔積液來源的外泌體熱休克蛋白具有作為新型腫瘤疫苗的潛能。

生物工程外泌體已被用于以細胞特異性方式向癌細胞輸送抗癌藥物。通過外來體靶向腫瘤干細胞是開發(fā)癌癥療法的有前途的方法之一。為了制造修飾的外泌體，對供體細胞進行改造，使其在外泌體的膜上產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)，例如外泌體蛋白質(zhì)CD44、CD24、CD133和CD200，用作外泌體的靶標[45]。

4 展 望

外泌體蛋白質(zhì)參與了消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移,為消化系統(tǒng)腫瘤的診治提供了新的線索。外泌體起著細胞間通信的作用，它們廣泛存在于細胞外環(huán)境中，并具有獨特的功能[6]。在像腫瘤這樣的異常狀態(tài)下，外泌體蛋白質(zhì)參與了消化系統(tǒng)腫瘤的耐藥，可通過抗凋亡信號，增加DNA修復或將ABC轉運蛋白傳遞到藥物敏感性細胞來轉移治療耐藥性，同時可促進環(huán)境介導的治療耐藥性，可利用其傳遞功能用于抗癌治療。

外泌體蛋白質(zhì)可作為消化系統(tǒng)腫瘤新的生物標志物，可用于開發(fā)基于液體的活檢，對消化系統(tǒng)腫瘤的診斷及治療效果進行監(jiān)測[29]。由于外泌體蛋白質(zhì)的結構獨特，在機體內(nèi)部具有良好的生物穩(wěn)定性、低毒性，其用于生物標志物研究的潛力巨大。

但是由于缺乏分析平臺和可用的技術，外泌體蛋白質(zhì)異質(zhì)性的起源和生物學的意義在很大的程度上仍不清楚，對外泌體蛋白質(zhì)參與消化系統(tǒng)腫瘤機制的研究還不夠深入。另外,現(xiàn)在對外泌體分離蛋白質(zhì)提取技術質(zhì)量和安全性要求極高，是一個需要長期攻克的生物學難題。

隨著對外泌體蛋白質(zhì)作為生物標志物的深入探索和研究，期待發(fā)現(xiàn)越來越多的特異、靈敏外泌體蛋白標志物，利用這些外泌體蛋白質(zhì)較好的細胞生物化學相容性、穩(wěn)定性與生物靶向性，應用于載藥系統(tǒng)或接種無細胞惡性腫瘤疫苗，有助于提高腫瘤的臨床診療水平。