核黃素超聲結(jié)晶工藝優(yōu)化

陳亮，田飛豹，辛秀蘭，蘭蓉，于然，吳志明，梁浩，3

（1 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京100176；2 北京化工大學(xué)化工資源有效利用國家重點實驗室，北京100029；3 北京化工大學(xué)秦皇島環(huán)渤海生物產(chǎn)業(yè)研究院，河北秦皇島066000）

核黃素，別名維生素B2，是維生素B族的重要組成部分，其前身為維生素G，分子式為C17H20N4O6，分子量376.37，CAS 號為83-88-5，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)對其命名為7,8-二甲基-10(1’-D-核糖醇基)-異咯嗪[1]，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 核黃素結(jié)構(gòu)式

核黃素是生物體內(nèi)黃素的主要來源，其衍生物黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是大多數(shù)黃素輔酶不可或缺的活性基團。這些黃素輔酶在體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)、蛋白折疊、DNA 修復(fù)、脂肪酸β-氧化、氨基酸氧化和膽堿代謝等生理功能方面發(fā)揮著重要的作用[2-7]。研究發(fā)現(xiàn)，核黃素可以改善不同疾病常規(guī)治療的效率[8-10]、發(fā)揮保護組織免受氧化損傷[11-13]等輔助功效。美國食品營養(yǎng)委員會推薦成人每日攝取核黃素的劑量是0.9～1.3mg。其不僅被廣泛應(yīng)用于臨床中，而且由于其無毒害并顏色呈黃色，也經(jīng)常作為營養(yǎng)添加劑和色素應(yīng)用在食品工業(yè)中[14]。核黃素是進入國際市場上較早的幾個維生素之一，國內(nèi)外臨床應(yīng)用、保健、抗衰老類制劑超過二百多種，由于食品工業(yè)、保健品及營養(yǎng)添加劑工業(yè)的快速發(fā)展，市場對核黃素的需求也將不斷上升。

核黃素的晶習(xí)一般分為三種，即針狀、粉末狀和塊狀。目前大多數(shù)是針狀的結(jié)晶體，但是其堆密度小，流動性能差，加工性能差，處理難度大，最終會影響壓片等加工性能。Saprykin 等[15]研究表明可以通過使用膠黏劑來提高核黃素的加工性能，然后使用硫化床進行噴霧干燥從而提高流動性能，但是這種方法過程繁雜，成本也會增高。溶液結(jié)晶經(jīng)常被用于有機可溶性物質(zhì)以及無機鹽的分離純化，溶液結(jié)晶不僅可以把溶質(zhì)轉(zhuǎn)變成固體從溶液中分離，而且還被廣泛應(yīng)用于晶體物質(zhì)的純化。當超聲波被施加到溶液中的介質(zhì)時，不僅可以使介質(zhì)的運動速度加快，而且還能產(chǎn)生聲空化作用。液體溶液在超聲波的作用下會形成局部的負壓區(qū)，在負壓區(qū)中介質(zhì)分子比較稀疏、離散，密度減少從而形成空化氣泡，經(jīng)過超聲波的正負交變，也會產(chǎn)生正壓區(qū)，在正壓區(qū)會使介質(zhì)密度增大。當超聲波作用足夠強大時，就會使氣泡被壓縮，從而使氣泡體積減小，當超過氣泡的承受能力后，空化氣泡就變得不穩(wěn)定，從而潰陷并逐步消失。超聲結(jié)晶方法被認為是作為實現(xiàn)更快及均勻形成初級成核，并能在較低的過飽和水平下相對容易成核，來減少晶體結(jié)塊的一個有效途徑，能夠顯著地改善產(chǎn)品的工藝和物理特性[16]。因此，本文對核黃素超聲輔助結(jié)晶進行研究，包括結(jié)晶方法的篩選、超聲輔助條件的優(yōu)化并進行產(chǎn)品表征。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

核黃素標準品（純度＞98%）和核黃素粗品（飼料級，80%），赤峰制藥廠；鹽酸、乙酸鈉、冰乙酸、無水乙醇、氫氧化鈉，均為分析純，北京試劑廠；去離子水，實驗室自制。

紫外分光光度計，UV-2450，日本島津公司；電子天平，Sartorius-BT25s，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；超聲波細胞破碎儀，Biosafer 3D，寧波生物科技有限公司；光學(xué)顯微鏡，BME，LEICA；電子顯微鏡，H-800，日本日立公司。

1.2 核黃素含量測定

1.2.1 核黃素的光譜掃描[17]

稱取核黃素標準品15.0mg，加入5mL 0.25%冰乙酸溶液，加熱攪拌使核黃素充分溶解。隨后轉(zhuǎn)入100mL 容量瓶定容。取10mL 上述溶液，再用5mL 0.25%冰乙酸溶液定容至100mL，用蒸餾水作為空白，用紫外分光光度計進行光譜掃描，選擇444nm作為測量核黃素的波長。

1.2.2 核黃素標準曲線的繪制

取10mg 核黃素，加入0.25%冰乙酸溶液，加熱溶解后用去離子水定容到100mL。取上述標準液0、2.5mL、5mL、7.5mL、10mL、12.5mL、15mL，分別用0.25% 冰乙酸溶液定容到50mL，并在444nm處測定其吸光度值，記錄數(shù)據(jù)，繪制標準曲線，根據(jù)吸光度值Y 與濃度x 建立回歸方程Y=28.354x+0.0138，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，其在0.005～0.03mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

1.2.3 核黃素純度測定

準確稱量核黃素樣品少許，加入0.25%冰乙酸溶液稀釋，在444nm處測定吸光度值，根據(jù)核黃素標準曲線計算出核黃素純度（%）。

1.3 結(jié)晶方法的篩選[18-20]

1.3.1 溶劑析出法

稱取2.0g 核黃素粗品，加入10mL 36%（質(zhì)量分數(shù)）濃鹽酸溶解，在50℃條件下以300r/min的轉(zhuǎn)速加熱攪拌30min，然后加入200mL 90℃水，95℃繼續(xù)加熱2h，自然冷卻至室溫，抽濾，記錄濾液體積并測量濾液中的核黃素濃度，固體物質(zhì)烘干得到樣品。

1.3.2 溶劑析出結(jié)合酸溶法

稱取2.0g 核黃素粗品，加入16mL 23.8%（質(zhì)量分數(shù)）鹽酸溶液溶解，在30℃條件下以300r/min的轉(zhuǎn)速攪拌30min，加入40mL 水，抽濾，記錄濾液體積并測量濾液中的核黃素濃度，固體物質(zhì)烘干得到樣品。

1.3.3 控制結(jié)晶法

稱取核黃素粗品2.0g，用120mL 水溶解，在80℃條件下加熱回流30min，然后升溫至100℃加熱回流1h，降溫至30℃，抽濾，用40mL 40℃水沖洗，再用40mL 甲醇沖洗，記錄濾液體積并測量濾液中核黃素的濃度，固體物質(zhì)烘干得到樣品。

1.3.4 酸溶法

稱取核黃素粗品2.0g，加入60mL 0.3%（質(zhì)量分數(shù)）鹽酸溶液，在80℃條件下加熱回流30min，迅速冷卻至室溫，抽濾，記錄濾液體積并測量濾液中的核黃素濃度，固體物質(zhì)烘干得到樣品。

1.3.5 堿溶法

稱取核黃素粗品2.0g，加入40mL pH 為12 的氫氧化鈉溶液進行溶解，過濾，濾液邊攪拌邊加入0.2%～0.25%（質(zhì)量分數(shù)）雙氧水20mL，攪拌1h，然后加酸調(diào)節(jié)pH 至4，抽濾，記錄濾液體積并測量濾液中的核黃素濃度，固體物質(zhì)烘干得到樣品。

經(jīng)上述方法處理后，樣品稱重，測定收率（%）和純度（%），計算出綜合效益（%）。綜合效益（%）=收率×純度×100%。

1.4 結(jié)晶影響因素的探討

采用對比5種不同結(jié)晶純化方法，根據(jù)綜合效益篩選出最好的方法是酸溶法，在此基礎(chǔ)上加入超聲波作用，進一步探討超聲時間、功率和溫度對核黃素的純度、收率以及結(jié)晶度和晶習(xí)等方面的影響。

分別稱取核黃素粗品2.0g，加入60mL 0.3%（質(zhì)量分數(shù)）鹽酸溶液，80℃條件下加熱回流30min，迅速冷卻至室溫，接著分別在不同時間（15min、 25min、 40min）、 不 同 功 率（200W、400W、500W）以及不同溫度（30℃、40℃、50℃）這3 個參數(shù)變量條件下進行超聲處理，冷卻至30℃，抽濾，水洗，甲醇洗，記錄濾液體積并測量核黃素濃度，固體物質(zhì)烘干得到樣品，計算收率、純度和綜合效益。

1.5 核黃素超聲結(jié)晶后的表征分析

分別采用光學(xué)顯微鏡、投射電子顯微鏡及X射線衍射（XRD）對超聲輔助結(jié)晶純化的核黃素以及未進行超聲輔助的核黃素進行結(jié)構(gòu)分析。

1.5.1 光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察結(jié)構(gòu)

分別取超聲輔助結(jié)晶及未超聲輔助結(jié)晶的核黃素樣品各10mg溶于1mL鹽酸-乙醇溶液中，混合均勻，各取1滴于載玻片及300 目銅網(wǎng)上，在載玻片上覆蓋潔凈的蓋玻片，編號標記，使用光學(xué)顯微鏡及電鏡觀察結(jié)構(gòu)。

1.5.2 XRD分析晶型

分別取超聲輔助結(jié)晶及未超聲輔助結(jié)晶的核黃素樣品于80℃下干燥2h，研成粉末，各取少許于XRD 載物臺上進行檢測，計算結(jié)晶度（%）。結(jié)晶度（%）=非晶峰的積分強度/（非晶峰的積分強度+結(jié)晶部分的積分強度）×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)晶方法的篩選

表1 列出了5 種核黃素結(jié)晶方法純化后的結(jié)果，溶劑析出法是基于被分離組分與溶劑分子間相互作用力的差異，本實驗中以鹽酸作為溶劑，以水作為析出劑，結(jié)晶時間長，影響因素較多不易控制；溶劑析出結(jié)合酸溶法綜合效益相對溶劑析出法好；控制結(jié)晶法是以水作為溶劑，操作復(fù)雜，用時較長；酸溶法以鹽酸為溶劑，溶解核黃素，最后結(jié)晶，操作簡便，用時較短；堿溶法利用核黃素在堿性條件下溶解度大，但核黃素在堿溶液中易分解，同時需要經(jīng)雙氧水氧化，操作復(fù)雜且用時較長。因此，在5種結(jié)晶純化方法中，酸溶法耗時短、操作簡便、綜合效益最高，故后續(xù)實驗采用酸溶法進行研究。

2.2 結(jié)晶影響因素的探討

傳統(tǒng)的結(jié)晶方法中由于晶體生長過程的復(fù)雜性，在晶體成形的過程中伴隨著溶液過飽和、成核、晶體生長和集聚，因此產(chǎn)品工業(yè)中試放大面臨著極大的挑戰(zhàn)。但是當超聲引入溶液結(jié)晶，可以極大地改進結(jié)晶過程，改善核黃素晶體形狀，使粒度分布均勻[16,21-23]，故實驗通過在核黃素酸溶法結(jié)晶的基礎(chǔ)上添加超聲波，探索其對于結(jié)晶效果的影響。

表1 5種核黃素結(jié)晶方法的收率和純度

2.2.1 超聲時間對超聲結(jié)晶純度與收率的影響

在結(jié)晶純化方法中加入超聲輔助作用，在不用超聲時間條件下，所得到的實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲作用時間對結(jié)晶純度和收率的影響

由圖2所知，功率一定時，其純度隨著超聲時間的延長有所增長，但增幅不大，綜合效益隨超聲時間的增加而增加，故選擇超聲時間為40min。核黃素成核結(jié)晶需要一個誘導(dǎo)成核達平衡的過程，40min 結(jié)晶達到平衡穩(wěn)定，故結(jié)晶的綜合效益最高。同時，超聲波可以降低溶液的過飽和濃度，晶體的成核生長速率也會隨著溶液過飽和濃度的降低隨之增加。因此，超聲作用也加速了溶質(zhì)分子從溶液到晶體表面的傳遞速率，縮短誘導(dǎo)期，提升了結(jié)晶的速度[24]。

2.2.2 超聲功率對超聲結(jié)晶純度與收率的影響

在結(jié)晶純化方法中加入超聲輔助作用，在不用超聲功率下，得到的實驗結(jié)果如圖3所示。

由圖3 所知，隨著超聲功率的增大，其純度有先增大后減小的趨勢?？傮w來看，在功率為400W 時，超聲輔助酸溶結(jié)晶的綜合效益最高。溶質(zhì)分子從溶液擴散到晶體表面，然后進入晶格，超聲作用促進了擴散速率，使得成核時間降低，并增加了晶核的數(shù)量。杭方學(xué)等[25]采用超聲處理研究溶析晶體時發(fā)現(xiàn)，在超聲功率400W 以下時，超聲波的功率越大，擴散系數(shù)越大，促進了分子間的混合，增強了不同相間的熱質(zhì)傳遞，結(jié)晶成核速率也越高。但是在高功率400W 以上，超聲功率過大，導(dǎo)致產(chǎn)生晶體粒度過小，容易聚結(jié)，雜質(zhì)進入結(jié)晶體里面，造成純度下降，純化的綜合效益降低[26]。

圖3 超聲功率對結(jié)晶純度和收率的影響

2.2.3 超聲溫度對超聲結(jié)晶純度與收率的影響

通過改變超聲溫度，得到的實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲溫度對結(jié)晶純度和收率的影響

由圖4 得知，當超聲功率和時間一定時，隨著超聲溫度的升高，收率呈下降趨勢，這可能是由于隨著超聲溫度的升高，核黃素的溶解度增加，使得析出的晶體減少，故收率有所下降；而對于純度來說，隨著超聲溫度升高，溶質(zhì)分子運動加快，結(jié)晶速度減慢，雜質(zhì)不易進入晶體中，同時“空化”作用產(chǎn)生的氣泡能將雜質(zhì)從晶體外表面趕走，減少雜質(zhì)進入晶體造成各向生長異性，晶體析出雜質(zhì)分子隨之減少，因此純度有所提升[26]，其綜合效益總體趨勢有所提高，50℃條件下綜合效益最高。

通過超聲輔助工藝的優(yōu)化，相較于傳統(tǒng)的種子結(jié)晶方法，超聲輔助結(jié)晶能夠降低誘導(dǎo)時間、過飽和濃度和亞穩(wěn)態(tài)區(qū)域?qū)挾龋行У卮龠M混合控制結(jié)晶過程[27-28]。

綜上所述。超聲結(jié)晶的最佳實驗條件為超聲功率400W、超聲時間40min、超聲溫度50℃，此時核黃素的收率可達到95%，純度超過96%。

2.3 核黃素超聲結(jié)晶后的表征分析

2.3.1 在光學(xué)顯微鏡下觀察超聲對核黃素結(jié)構(gòu)的影響

未超聲輔助結(jié)晶和超聲輔助結(jié)晶后的核黃素光學(xué)顯微圖（40倍）如圖5所示。

圖5 未超聲輔助結(jié)晶和超聲輔助結(jié)晶后核黃素的光學(xué)顯微圖（40倍）

從圖5可以很明顯地看出，未經(jīng)過超聲得到的核黃素其形狀呈針狀，且有集聚情況。而經(jīng)過超聲處理后的核黃素形狀發(fā)生了較大改變，晶習(xí)變短，且比較均勻。這是由于超聲作用的引入，由于超聲波的輻射、微射流以及局部高溫高壓提升了溶質(zhì)分子混合的速率，降低了局部成核的數(shù)量，影響了晶體集聚的情況，解決了傳統(tǒng)種子結(jié)晶方法工業(yè)放大過程中結(jié)晶后晶體集聚的問題[29-30]。為了進一步明確核黃素的晶體形狀，通過電子顯微鏡確認。

2.3.2 在電子顯微鏡下觀察超聲對核黃素結(jié)構(gòu)的影響

未超聲輔助結(jié)晶和超聲輔助結(jié)晶后核黃素的透射電鏡圖如圖6所示。

圖6 未超聲輔助結(jié)晶和超聲輔助結(jié)晶后核黃素的電鏡透射圖

通過透射電鏡觀察到，經(jīng)過超聲后的晶型發(fā)生了明顯的變化，由原來的針狀晶型轉(zhuǎn)變?yōu)榻凭匦危移鋬?nèi)徑變小，長度變短，長寬比變小，且相對均勻。超聲作用下，由于超聲的空化作用，溶質(zhì)分子因其獲得了充分的速度及能量，溫度和濃度梯度減小，分子間的碰撞及相互加強，增加了穿過晶體表面靜止液層的可能性，其更易于進入晶格，整齊排列，顯著地增加了溶液傳質(zhì)速率和傳質(zhì)推動力[31]。

2.3.3 核黃素的XRD分析

核黃素的XRD 譜圖如圖7 所示。從圖7 可見，經(jīng)過超聲作用后，隨著超聲時間的加長其峰強度有所增強。未超聲核黃素的結(jié)晶度是79.56%，通過最優(yōu)條件的超聲處理后，結(jié)晶度提升至84.21%，結(jié)果表明，在超聲作用下其結(jié)晶度有所改善。超聲波引入到溶液結(jié)晶過程中，利用超聲波的空化效應(yīng)，能使過飽和溶液的成核誘導(dǎo)期縮短，大大減少結(jié)晶時間，當超聲波頻率增加時，晶體成核速度也會加快，成核誘導(dǎo)期變短。超聲結(jié)晶能夠簡單有效地控制晶體成核數(shù)目及成核速度，形成的晶體晶形好、粒度分布均勻、晶體結(jié)構(gòu)也完整。優(yōu)化的超聲輔助工藝條件可以有效地控制晶體大小、純度、收率、結(jié)晶度和晶習(xí)[32]。

圖7 超聲功率為400W、不同超聲時間下核黃素結(jié)晶的XRD譜圖

3 結(jié)論

本文比較研究了溶劑析出法、溶劑析出結(jié)合酸溶法、控制結(jié)晶法、酸溶法和堿溶法等5種傳統(tǒng)的結(jié)晶純化方法的效果，其中酸溶法在收率和純度指標上綜合效益最佳。在此基礎(chǔ)上添加超聲輔助處理，其最佳的實驗條件為超聲功率為400W、超聲時間為40min、超聲溫度為50℃，核黃素的收率可達到95%，純度超過96%。超聲輔助酸溶結(jié)晶進一步提高了核黃素的結(jié)晶度，易于成核，晶習(xí)更短，近似于矩形，晶體穩(wěn)定，分散性能更好，易于壓片成型，改善了應(yīng)用加工和工業(yè)放大特性。