果樹脫毒技術(shù)研究進(jìn)展

陳沖 曹貴壽 王國平 劉偉 樊新平 霍辰思 史華平

摘?要：果樹病毒病是無藥可治的系統(tǒng)性病害，嚴(yán)重威脅果樹的生長(zhǎng)發(fā)育和果業(yè)生產(chǎn)。綜述了果樹病毒的種類，并將脫毒方法總結(jié)為五大類進(jìn)行闡釋：物理脫毒法，化學(xué)脫毒法，生物組織脫毒法，變溫、抗病毒劑、超低溫與莖尖組培結(jié)合脫毒法和抗病毒基因工程脫毒法。并對(duì)果樹脫毒的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了分析。

關(guān)鍵詞：果樹;脫毒技術(shù);進(jìn)展

文章編號(hào)：2096-8108（2021）01-0072-04?中圖分類號(hào)：S66?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：Fruit tree virus disease is a systemic disease that can not be treated by medicine， which seriously threatens the growth and development of fruit trees and the production of fruit industry. the types of virus in fruit trees were summarized， and the virus-free methods were summarized into five categories： physical virus-free method， chemical virus-free method， biological tissue virus-free method， variable temperature， anti-virus agent， combination of ultra-low temperature and shoot tip tissue culture， and virus-free genetic engineering method. Finally， the development trend of virus-free fruit trees was analyzed.

Keywords：fruit tree;virus free technique;progress

1?概述

病毒病是果樹的重要病害種類之一，是影響果樹產(chǎn)量和品質(zhì)的重要原因。目前已發(fā)現(xiàn)的高等植物病毒病害已超過700種，每種果樹病毒危害都有幾種甚至十幾種[1]（見表1）。果樹是多年生營(yíng)養(yǎng)繁殖為主的植物，寄生病毒侵染后全身發(fā)病且終生帶毒，而且，隨著營(yíng)養(yǎng)繁殖系數(shù)增大而傳播速率加快。病毒破壞樹體的生理機(jī)能，導(dǎo)致樹勢(shì)、產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)全株衰退枯死，尤其是一些潛隱性病毒危害更大。

目前，果樹病毒病無藥可治。在實(shí)際防治中，除了嚴(yán)格檢疫、消除傳毒源、防治傳播蟲媒外，最有效的措施是使用脫毒繁殖材料。應(yīng)該注意的是：這里所說的脫毒，是指不具有經(jīng)濟(jì)重要性的、按要求應(yīng)脫除的病毒，而非不帶任何病毒[2]。

2?果樹脫毒技術(shù)

2.1?物理脫毒法

2.1.1?熱處理法

熱處理法也叫溫?zé)岑煼ǎ煞譃楹銣靥幚砗妥儨靥幚?，其原理是利用病毒和寄主植物?duì)高溫（35～38 ℃的熱水或熱氣）忍耐性的差異，病毒部分或全部鈍化失活，失去侵染的能力而逐漸消亡，從而得到一小部分不含病毒的植物分生組織，然后進(jìn)行組織復(fù)壯培育。值得注意的是：在高溫處理過程中，溫度選擇應(yīng)當(dāng)處在植物最高耐受溫度和殺死病毒溫度的之間的區(qū)域，并且這個(gè)區(qū)域越大，越有利于脫毒。

張尊平等[3]（2013）用熱處理脫毒技術(shù)研究了8個(gè)葡萄品種5種葡萄病毒（葡萄斑點(diǎn)病毒、葡萄扇葉病毒、沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒、葡萄卷葉相關(guān)病毒-1、葡萄卷葉相關(guān)病毒-2）的試管苗，研究結(jié)果表明：62個(gè)莖尖中29個(gè)莖尖脫除了上述5種病毒?？禃杂萚4]（2016）等研究發(fā)現(xiàn)：相同熱處理?xiàng)l件下，不同的蘋果基因型脫毒率存在差異。王林脫毒效率最高，脫除率100%;金矮生ACLSV（蘋果褪綠葉斑病毒）和ASPV（蘋果莖痘病毒）兩種病毒的同時(shí)脫除率為100%;ASGV（蘋果莖溝病毒）的脫除率也在80%以上;首紅、株美海棠、天汪1號(hào)、L-6的脫除率較低。

熱處理脫毒法要求的設(shè)備條件簡(jiǎn)單，操作也比較容易，是被世界多個(gè)國家應(yīng)用最廣的技術(shù)。但是，熱處理法僅對(duì)球狀和類似紋狀的病毒導(dǎo)致的病害才有效，對(duì)桿狀和線狀病毒就不能用這種方法脫除，因而具有一定的局限性，須與別的方法配合使用。

2.1.2?超低溫脫毒

近幾年，超低溫脫毒是研究的熱點(diǎn)，它是建立在超低溫保存基礎(chǔ)上的一門新型高效脫毒技術(shù)。原理主要是利用莖尖分生組織細(xì)胞與分化細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的差異，選擇只允許有限數(shù)量外植體存活的條件，從而消除一大批感染病毒的組織，莖尖超低溫的脫毒率很高[5]。

盛宏亞、王紅清等[6]（2016）以草莓為材料，通過優(yōu)化玻璃化超低溫脫毒技術(shù)的程序，建立了草莓莖尖（1～2 mm）玻璃化超低溫脫毒體系，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)草莓斑駁病毒的脫毒率為100%。李百荃等[7]（2016）采用蘋果莖尖超低溫療法研究表明：1.5 mm和0.5 mm兩種大小莖尖均不能脫除 ASGV，ASPV 的脫毒率均為80%～85%;0.5 mm的莖尖不能再生，1.5 mm莖尖再生率明顯高于1.0 mm的莖尖。

2.2?化學(xué)脫毒法

抗病毒藥劑的主要作用是抑制病毒增殖和移動(dòng)，在三磷酸狀態(tài)下阻止病毒RNA帽子結(jié)構(gòu)形成，或使病毒暫時(shí)處于無活性狀態(tài)。常用的抗病毒化學(xué)藥物有三氮唑核苷（病毒唑）、雙乙酰二氫-5-氮尿嘧啶（DA-DHT）、5-二氫尿嘧啶（DHT）、8-氮鳥嘌呤、放線菌素D等。這些抗病毒劑常常通過直接注射或噴施到帶病毒的植株上，或者加到植株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上[8]。

晏娜等[9]（2009）用 RT-PCR 技術(shù)探討 3 種化學(xué)藥劑處理對(duì)蘋果繼代苗脫毒效率。結(jié)果表明：阿昔洛韋和病毒靈作用下蘋果褪綠葉斑病毒和蘋果莖痘病毒的脫除率均達(dá)到 100%，而蘋果莖溝病毒的脫除率分別為 63%和 62%。病毒醚的作用下3種病毒的脫除率均達(dá)到 100%。

2.3?生物組織脫毒法

2.3.1?莖尖培養(yǎng)脫毒法

莖尖培養(yǎng)是指對(duì)植物頂端的原分生組織和它衍生的分生組織的培養(yǎng)。莖尖培養(yǎng)的材料可以是10～100 μm的莖尖分生組織，也可以是幾十毫米的莖尖或更大的芽。莖尖培養(yǎng)繁育無病毒苗是生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的一種方法。

高慶玉等[10]（1993）研究認(rèn)為：1～3 mm的莖尖起不到培育脫毒苗的效果，只有小于0.5 mm的莖尖才能獲得無病毒母株;但從成活率和接種時(shí)間上看，大于0.3 mm草莓莖尖比0.3 mm好。因此，一般以切取0.3～0.5 mm生長(zhǎng)點(diǎn)（帶1～2個(gè)葉原基）為宜。董淑英等[11]（2001）利用莖尖培養(yǎng)對(duì)蘋果進(jìn)行脫毒技術(shù)研究也證實(shí)了上述的結(jié)論。

2.3.2?微體嫁接脫毒法

木本植物莖尖培養(yǎng)生根困難、生長(zhǎng)緩慢。Murashige等在莖尖培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，提出了微體嫁接技術(shù)，即將莖尖分生組織嫁接在試管中經(jīng)脫毒培養(yǎng)的實(shí)生苗砧木切斷面上而得到完整植株。Murashige等用這種方法脫除了柑橘的兩種病毒[12]。

祁鵬志等[13]（2007）采集帶有典型衰退病癥狀的新余蜜柑莖尖進(jìn)行了莖尖微芽嫁接，黃龍病和衰退病脫毒率100%。目前微嫁接成功的植物有杏、釀酒葡萄、桃、蘋果和柑橘。

2.3.3?珠心組織脫毒法

此法在柑橘類上應(yīng)用廣泛[14]。植物受精產(chǎn)生的種子絕大多數(shù)只形成一個(gè)胚，而柑橘的種子常形成多胚。多胚中只有一個(gè)胚是受精后產(chǎn)生的有性胚，而其余是珠心細(xì)胞形成的無性胚，一般稱珠心胚。通過珠心胚培養(yǎng)可以得到無病毒的珠心胚苗。由于珠心與維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)系，因此，用此技術(shù)對(duì)柑橘的主要病毒與類病毒病原體，包括不能被熱處理除去的病毒均十分有效。

2.3.4?花藥或花粉培養(yǎng)脫毒

這種方法一般適于自交親合或自交不親合植物優(yōu)良無病毒育種原始材料。由花粉培育出愈傷組織再分化出的完整植株，含有的病毒很少或幾乎不含病毒。大澤勝次（1974）等利用草莓花藥培養(yǎng)法獲得了脫毒苗[15]。高慶玉[10]等（1993）用草莓花藥組培，其脫毒率高于用幼葉和莖尖產(chǎn)生的脫毒苗。所以，花藥培養(yǎng)的植株脫毒率高，可靠性強(qiáng)。

花藥培養(yǎng)脫毒法中，選擇合適大小的花蕾非常關(guān)鍵，盡量選取處于密封狀態(tài)的小花蕾，此時(shí)的花粉發(fā)育期為單核靠邊期[16]。利用花藥培養(yǎng)脫毒苗，不僅可以省去病毒鑒定工作，還可快速繁殖出大量脫毒植株。

2.4?變溫、抗病毒劑、超低溫與莖尖組培結(jié)合脫毒法

莖尖脫毒培養(yǎng)法具有脫毒率高，脫毒速度快的優(yōu)勢(shì)，但這種方法技術(shù)要求較高、植物的存活率低。目前，通常將莖尖培養(yǎng)與其他脫毒方法配合使用，如與熱處理、抗病毒劑、超低溫與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合脫毒。

董雅鳳等[17]（1998）對(duì)蘋果莖溝病毒的研究中發(fā)現(xiàn)：梨莖尖培養(yǎng)成活率僅為28%，且脫毒效果差。熱處理后進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，脫毒率和成活率分別增加11.7%和54.3%。因?yàn)椴《玖Ｗ油ǔＴ?4～60 ℃下處理一段時(shí)間，則會(huì)發(fā)生鈍化，這樣莖尖外植體大小可在較大的范圍內(nèi)，提高了培養(yǎng)的成功率。馮超紅等[18]（2014）用蘋果莖尖（≥0.5 mm）結(jié)合超低溫處理和熱處理分別脫除了蘋果莖痘病毒和蘋果莖溝病毒。顧沛雯[19]（2008）在脫毒處理中，將熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合，使成活率和脫毒率較單純莖尖培養(yǎng)提高7.5%和8.5%，其中變溫比恒溫處理成活率提高15.6%，而脫毒率相差不大;病毒劑處理與微莖尖相結(jié)合培養(yǎng)結(jié)果表明，病毒劑對(duì)葡萄病毒具有良好的抑制作用，但對(duì)莖尖的生長(zhǎng)發(fā)育有影響。胡國君等[20]（2012）以蘋果莖溝病毒和蘋果褪綠葉斑病毒離體砂梨植株為研究材料，比較分析了熱處理、化學(xué)處理（病毒醚）及二者相結(jié)合對(duì)脫除病毒的效果，結(jié)果顯示化學(xué)處理與熱處理相結(jié)合可明顯提高病毒脫除效果。

2.5?抗病毒基因工程

隨著分子生物學(xué)和基因工程的飛速發(fā)展，特別是1986年首次將煙草花葉病毒（TMV）外殼蛋白基因成功導(dǎo)入煙草，防治病毒病產(chǎn)生了新的途徑，目前已有多種病毒基因被導(dǎo)入到植物的基因組中而產(chǎn)生不同程度的抗病毒效果，這些病毒基因分屬于編碼序列和非編碼列兩大類型。前者有病毒運(yùn)動(dòng)蛋白、病毒外殼蛋白、核酶、復(fù)制酶等，后者有衛(wèi)星RNA、缺陷RNA和超敏RNA，目前果樹上采用的抗病毒策略主要有外殼蛋白基因、運(yùn)動(dòng)蛋白基因和病毒衛(wèi)星RNA [1]。

田莉莉等[21]（2013）為創(chuàng)制抗病毒植物新材料，采用 Gateway 技術(shù)構(gòu)建了含 3種蘋果潛隱性病毒 CP 基因片段的 RNAi 植物表達(dá)載體，用凍融法將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，并用葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng) PCR 鑒定，結(jié)果表明目的基因片段已成功轉(zhuǎn)入煙草中。

3?展望

果樹脫毒技術(shù)（表2）不僅可有效地防治病毒病的危害，而且可以脫除其他細(xì)菌和真菌病害，可顯著地提高果品產(chǎn)量和質(zhì)量。無病毒果樹可大幅度提高產(chǎn)量，優(yōu)質(zhì)果率增加30%～50%。無病毒苗木抗逆性強(qiáng)，適合25℃以下的山坡瘠薄土地栽培[22]，而且減少化肥農(nóng)藥用量，符合生態(tài)農(nóng)業(yè)要求。因此，實(shí)行無病毒栽培已成為當(dāng)今世界果樹生產(chǎn)發(fā)展的方向。

我國這方面起步較晚，脫毒技術(shù)體系、病毒檢測(cè)和脫毒栽培尚處于試驗(yàn)、示范階段。我國果樹無病毒栽培面積面積比例低，為了適應(yīng)當(dāng)今經(jīng)濟(jì)發(fā)展和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的需要，建立適合我國國情的無病毒果樹生產(chǎn)體系，并在全國范圍內(nèi)邊試驗(yàn)、邊示范、邊推廣，使我國果樹傳統(tǒng)的栽培技術(shù)有一個(gè)新的變革，推動(dòng)果樹生產(chǎn)向優(yōu)質(zhì)增效方向發(fā)展。

研究過程中，不僅要注重脫毒各個(gè)操作環(huán)節(jié)的影響因素，更要注重脫毒機(jī)理性的研究，形成系統(tǒng)化的理論體系。同時(shí)，須加強(qiáng)科研單位與企業(yè)合作，使技術(shù)應(yīng)用商業(yè)化，在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)更多的問題并解決科研資金不足的問題，這是發(fā)展脫毒技術(shù)最快捷有效的途徑。再者，加強(qiáng)國際交流，可以適當(dāng)引進(jìn)適合我國實(shí)際情況的技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行深入的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]王國平，洪?霓.果樹病毒檢測(cè)與脫除技術(shù)的研究進(jìn)展[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004（6）：685-691.

[2]楊俊玲，侯義龍，李?雄.果樹脫毒及病毒檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國水土保持，2004（3）：21-23+32+47.

[4]康曉育，李幗英，趙新紅.4個(gè)蘋果品種和2種砧木試管苗對(duì)熱處理脫毒效應(yīng)的研究[J].山西果樹，2016（4）：1-4.

[3]張尊平，范旭東，胡國君，等.葡萄試管苗熱處理脫毒技術(shù)研究[J].中國果樹，2013（1）：39-41.

[5]劉文斌.梨病毒超低溫脫除技術(shù)的改進(jìn)及帶病毒與脫毒梨離體植株生長(zhǎng)特性比較[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[6]盛宏亞，萬繼花，徐?川，等.利用玻璃化超低溫技術(shù)脫除草莓斑駁病毒（SMoV）的初步研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào)，2016（3）：53-57.

[7]李百荃.蘋果屬（Malus）試管苗植株再生、莖尖超低溫保存和脫毒技術(shù)研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

[8]邱?靜，湯浩茹，曹會(huì)娟，等.園藝植物莖尖冷凍療法脫毒的技術(shù)研究[J].植物生理學(xué)報(bào)，2014（1）：1-6.

[9]晏?娜.化學(xué)處理和熱處理脫除蘋果潛隱性病毒的研究[D].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[10]高慶玉，李光裕，周?恩.關(guān)于草莓脫毒技術(shù)研究[J].東北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1993（3）：231-236.

[11]董淑英，孫?靜，潘忠強(qiáng)，等.蘋果莖尖脫毒技術(shù)研究[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（2）：30-35.

[12]馬鳳桐，T.Murashige.柑桔屬莖尖嫁接脫毒的研究[J].Journal of Integrative Plant Biology，1989（7）：565-568.

[13]祁鵬志.柑橘莖尖微芽嫁接脫毒及黃龍病和衰退病分子檢測(cè)的研究[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[14]楊?莉，張家銀，郭?琛，等.柑橘無毒化技術(shù)研究進(jìn)展[A].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).中國柑橘科技創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略論壇暨中國柑橘學(xué)會(huì)2007年年會(huì)論文集[C].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007：5.

[15]洪燕萍，林順權(quán).草莓離體培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999（2）：37-44.

[16]肖君澤，黃益鴻，姜放軍，等.章姬草莓花藥組織培養(yǎng)脫毒快速繁殖技術(shù)的研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011（10）：49-50+54.

[17]董雅鳳，于濟(jì)民，洪霓，等.梨樹蘋果莖溝病毒的脫毒技術(shù)研究[J].中國果樹，1998（4）：10-12.

[18]馮超紅.蘋果莖尖超低溫保存技術(shù)及脫毒效率的研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

[19]顧沛雯.葡萄卷葉病毒的脫毒技術(shù)研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008（5）：85-91.

[20]胡國君.熱處理結(jié)合化學(xué)處理脫除梨病毒研究及熱處理植株中病毒siRNAs鑒定[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[21]田莉莉，牛?良.蘋果抗病毒RNAi表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草研究[J].分子植物育種，2013（6）：783-789.

[22]邵礫群.中國蘋果矮化密植集約栽培模式技術(shù)經(jīng)濟(jì)評(píng)價(jià)研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2015.