王 鑫，許曉東

(西北農林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

桿狀病毒(baculoviruses)是一類具有囊膜包被的DNA病毒，編碼90～180個基因，是目前研究發(fā)現(xiàn)的最大一類節(jié)肢動物特異性病毒[1]。同其他大型DNA病毒一樣，桿狀病毒基因表達也具有時序性[2]。根據(jù)表達時間的先后，將桿狀病毒基因分為早期基因、晚期基因和極晚期基因3種。其中早期基因表達依賴于宿主的RNA聚合酶Ⅱ轉錄，晚期基因表達依賴于桿狀病毒自身編碼的RNA聚合酶轉錄[3]。

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是桿狀病毒的模式種，編碼154個基因。20世紀90年代，科學家通過瞬時表達試驗鑒定出能夠參與AcMNPV晚期表達調控的基因。到目前為止，已經(jīng)鑒定出19個晚期表達因子(late expression factor，LEF)[4-5]。其中，LEF-1[6]、LEF-2[7]、LEF-3[8-9]、lef-7[10]、LEF-11[11]、IE1[12]、ie2[13]、p35[14]、P143[8]、dnapol[14]與DNA復制相關，lef-4[15]、LEF-5[16]、LEF-6[17]、lef-8[15]、lef-9[15]、LEF-10[18]、lef-12[19]、p47[15]和pp31[20]與晚期基因轉錄相關。

所有Group Ⅰ組和大部分Group Ⅱ的nuclear polyhedroviruses(NPVs)和granulosis viruses(GVs)基因組中均鑒定出LEF-10的同源基因[5]。AcMNPV編碼的LEF-10由78個氨基酸組成，分子質量為8.6 ku。在AcMNPV bacmid和家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinuclear polyhydrosis virus，BmNPV) bacmid中，敲除lef-10基因后病毒無法存活[21-22]，表明lef-10是病毒復制的必需基因。研究發(fā)現(xiàn)LEF-10具有朊病毒特性，其保守的第21位氨基酸殘基突變成丙氨酸殘基時能降低LEF-10蛋白的聚集傾向，并最終影響晚期報告基因的表達[23]。即以高感染復數(shù)(MOI)感染宿主細胞時，晚期報告基因的表達效率大大提高。

研究發(fā)現(xiàn)，LEF-10蛋白的氨基末端是必需的[24]，而其第21位氨基酸殘基突變?yōu)楸彼釟埢鶗r影響LEF-10蛋白的聚集狀態(tài)[23]。為了探究LEF-10第21位不同氨基酸殘基對AcMNPV活性的影響，本研究對該位點進行飽和突變，并通過異位回補和原位突變兩種方式構建重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒，檢測重組病毒的活性，為深入研究LEF-10的朊病毒特性及其在病毒復制周期中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株、質粒、細胞系 大腸桿菌HS996(EscherichiacoliHS996)(含有AcMNPV bacmid和pSC101重組酶質粒)，由英國雷丁大學(University of Reading)Prof. Ian Jones實驗室饋贈；pTriEx-p(lef-10)-LEF-10-GFP-p(p10)-dsRed質粒、BacmidΔlef-10、prpsL-AMP質粒、pTriEx-p(p10)-dsRed質粒、大腸桿菌Top10(EscherichiacoliTop10)和草地貪夜蛾Sf9細胞系，均由西北農林科技大學生命科學學院分子病毒學實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，購于上海生工生物工程有限公司；2×EsTaqMaster Mix，購于康維世紀公司；T4 DNA連接酶、BamH Ⅰ、PshA Ⅰ、Bsu36 Ⅰ、RNaseA酶，購于美國紐英倫生物技術公司(NEB)；DL5000 DNA Marker，購于北京擎科生物科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉，購于北京奧博星生物技術有限公司；瓊脂粉、DNA抽提試劑(體積比苯酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1,pH>7.8)，購于北京索萊寶科技有限公司；L-阿拉伯糖，購于Wolsen公司；SFX-INSECT培養(yǎng)基、胎牛血清，購于Thermo Fisher公司；FuGENE HD轉染試劑，購于Promega公司。

1.1.3 引物的設計與合成 本試驗所用引物(表1)均用SnapGene軟件設計，由蘇州金維智生物科技有限公司和北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 研究所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

表1(續(xù)) Continued table 1

1.2 構建異位回補lef-10L21X的重組病毒(X代表19種不同的氨基酸殘基)

為了檢測LEF-10第21位對AcMNPV活性的影響，本試驗將pTriEx-p(lef-10)-LEF-10-GFP-p(p10)-dsRed質粒上LEF-10的第21位亮氨酸殘基飽和突變?yōu)槠渌?9種氨基酸殘基，再與敲除了lef-10的Bacmid(BacmidΔlef-10)進行共轉染，得到重組病毒lef-10L21XBacmid，檢測第21位上不同氨基酸殘基能否回補缺陷的BacmidΔlef-10。

1.2.1 19種lef-10L21X片段的PCR擴增 LEF-10第21位的點突變通過PCR引物引入。以pTriEx-p(lef-10)-LEF-10-GFP-p(p10)-dsRed質粒為模板，分別用上游引物(PshAI_G、PshAI_I、PshAI_P、PshAI_V、PshAI_F、PshAI_W、PshAI_Y、PshAI_D、PshAI_E、PshAI_R、PshAI_H、PshAI_K、PshAI_S、PshAI_T、PshAI_C、PshAI_M、PshAI_N、PshAI_Q、PshAI_A)和下游引物(BamHI-lef10-R)進行PCR擴增。PCR擴增體系為：2×EsTaqMaster Mix 10 μL，10 μmol/L的上游引物1 μL，10 μmol/L的下游引物1 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對PCR產物進行回收，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段，將回收后的PCR產物置于-20 ℃保存。

1.2.2 pTriEx-p(lef-10)-LEF-10L21X-GFP-p(p10)-dsRed質粒的構建 使用限制性內切酶PshA Ⅰ、BamH Ⅰ對1.2.1節(jié)中回收的PCR產物和pTriEx-p(lef-10)-LEF-10-GFP-p(p10)-dsRed質粒進行雙酶切，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對酶切產物進行回收。使用T4 DNA連接酶將適宜濃度的片段與載體進行連接，將連接產物用熱激法轉入大腸桿菌Top10感受態(tài)并進行復蘇。復蘇完成后，將細胞涂布于含有氨芐青霉素(終質量濃度為50 μg/mL)的平板，倒置,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。因點突變不會改變基因片段的大小，故無法通過雙酶切驗證。使用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒，將提取好的質粒送北京擎科生物科技有限公司進行測序鑒定，構建正確的質粒命名為pTriEx-p(lef-10)-LEF-10L21X-GFP-p(p10)-dsRed。

1.2.3 異位回補重組病毒的構建 將構建好的pTriEx-p(lef-10)-LEF-10L21X-GFP-p(p10)-dsRed質粒與線性化的BacmidΔlef-10共轉染草地貪夜蛾Sf9細胞，獲得重組病毒。轉染步驟為：將Sf9細胞鋪入12孔板中，細胞匯合度約為70%。分別向兩個無菌的1.5 mL離心管加入70 μL ddH2O，再向其中一管中加入5 μL的轉染試劑，向另一管中加入5 μL線性化BacmidΔlef-10和2 μL pTriEx-p(lef-10)-LEF-10L21X-GFP-p(p10)-dsRed質粒。將兩管分別混勻后，再將前管混合物加入后管再次混勻，室溫靜置15～20 min后逐滴加入到細胞培養(yǎng)皿中，28 ℃靜置培養(yǎng)5～7 d。使用熒光倒置顯微鏡進行觀察并拍照，收集病毒上清，傳代2次，得到P2代重組病毒，于-4 ℃保存。

1.3 原位突變lef-10L21X重組病毒的構建

為避免異位回補產生位置效應，本試驗直接在Bacmid上進行原位突變，構建重組病毒(Bacmidlef-10L21X)，檢測LEF-10第21位氨基酸殘基對AcMNPV活性的影響。

1.3.1 含lef-10兩側同源臂的rpsL-AMP DNA片段的PCR擴增 以prpsL-AMP質粒為模板，用上游引物Bac-lef10-F和下游引物Bac-lef10-R進行PCR擴增，擴增體系和反應條件同1.2.1節(jié)(延伸時間改為60 s)。用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對PCR產物進行回收，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段，置于-20 ℃保存。

1.3.2 AcMNPV中l(wèi)ef-10基因的敲除 將-80 ℃凍存的大腸桿菌HS996(含有AcMNPV bacmid和pSC101重組質粒)菌液在含有四環(huán)素(3 μg/mL)和卡那霉素(15 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上進行劃線，30 ℃避光過夜培養(yǎng)。挑取單克隆至含四環(huán)素(3 μg/mL)和卡那霉素(15 μg/mL)的5 mL LB液體培養(yǎng)基，于30 ℃、250 r/min避光過夜培養(yǎng)。以體積比1∶100將菌液轉接到含卡那霉素和四環(huán)素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min避光培養(yǎng)至OD600值為0.2～0.3時，向離心管中加入50 μL質量分數(shù)為10%的L-阿拉伯糖誘導表達重組酶，繼續(xù)于37 ℃、250 r/min避光培養(yǎng)45 min。根據(jù)Counter-Selection BAC Modification Kit手冊制備EscherichiacoliHS996感受態(tài)[25]。吸取1 μL 1.3.1節(jié)中所得PCR片段與E.coliHS996感受態(tài)混勻后，加入預冷的電轉杯中進行轉化，電壓設置為1 300 V。電擊后向電轉杯中加入1 mL LB液體培養(yǎng)基重懸菌液進行復蘇，于37 ℃、220 r/min避光培養(yǎng)60 min。最后涂布于含有氨芐青霉素(50 μg/mL)、卡那霉素(15 μg/mL)和四環(huán)素(3 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，倒置,于30 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)36～48 h。

1.3.3 敲除lef-10基因菌落的篩選 挑取單克隆進行菌落PCR篩選。以UT-LEF10和1stUT作為篩選引物。PCR反應體系與條件同1.2.1節(jié)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性菌落接種于5 mL含氨芐青霉素(50 μg/mL)、卡那霉素(15 μg/mL)和四環(huán)素(3 μg/mL)的液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min避光過夜培養(yǎng)，將菌液在終體積分數(shù)為25%的甘油中，于-80 ℃保存。

1.3.4 含有同源臂lef-10L21X片段的PCR擴增 以不同的pTriEx-p(lef-10)-LEF-10L21X-GFP-p(p10)-dsRed質粒為模板，用上游引物FS-L21-F和下游引物FS-L21-R進行PCR擴增。PCR反應體系與條件同1.2.1節(jié)。用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對PCR產物進行回收，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段，于-20 ℃保存。

1.3.5 將lef-10L21X片段反篩回AcMNPV 將1.3.3 節(jié)中得到的陽性菌落與1.3.4節(jié)中得到的lef-10L21X片段進行同源重組，搖菌時使用含有氨芐青霉素(50 μg/mL)、卡那霉素(15 μg/mL)和四環(huán)素(3 μg/mL)的液體培養(yǎng)基，最后涂布于含有卡那霉素(15 μg/mL)、四環(huán)素(3 μg/mL)和鏈霉素(50 μg/mL)的平板上，其他步驟同1.3.2節(jié)。

1.3.6 反篩lef-10L21XAcMNPV的篩選 挑取菌苔上的單克隆進行菌落PCR篩選。以PshAI-G和BamHⅠ-lef10-R作為篩選引物。PCR反應體系與條件同1.2.1節(jié)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將PCR產物送北京擎科生物科技有限公司進行測序，以確定插入片段的序列。將測序正確的陽性菌落接種于5 mL含卡那霉素(15 μg/mL)、四環(huán)素(3 μg/mL)和鏈霉素(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min避光過夜培養(yǎng)，將菌液在終體積分數(shù)為25%的甘油中，于-80 ℃保存。

1.3.7 原位突變重組病毒的構建 提取20種Bacmidlef-10L21X桿粒，用Bsu36 Ⅰ酶切線性化并用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，分別與pTriEx-p(p10)-dsRed質粒共轉染草地貪夜蛾Sf9細胞。轉染步驟同1.2.3節(jié)。傳代2次，得到P2代重組病毒，于4 ℃保存。

1.4 病毒滴度測定

采用極限稀釋法[26]測定重組病毒的滴度。將Sf9細胞鋪入96孔板，每孔100 μL培養(yǎng)基。將1.3.7節(jié)中的重組病毒依次10倍稀釋至10-9稀釋度。將10 μL重組病毒稀釋液加入96孔板中，每種病毒3個技術重復和3個生物學重復。28 ℃培養(yǎng)7 d，通過熒光顯微鏡觀察96孔板中細胞產生熒光孔的數(shù)目，并根據(jù)Reed-Muench兩氏法計算病毒的滴度TCID50。

1.5 重組病毒對外源蛋白表達影響的檢測

將Sf9細胞鋪入12孔板，將1.3.7節(jié)中的重組病毒P2分別以MOI=1和MOI=10感染草地貪夜蛾Sf9細胞，28 ℃培養(yǎng)3 d后收集細胞，通過流式細胞儀檢測dsRed熒光蛋白的表達情況，并用NovoExpress軟件分析數(shù)據(jù)和作圖。

2 結果與分析

2.1 lef-10L21X Bacmid轉染和感染Sf9細胞

將構建好的pTriEx-p(lef-10)-LEF-10L21X-GFP-p(p10)-dsRed質粒與線性化的BacmidΔlef-10共轉染Sf9細胞，通過同源重組產生重組病毒。其中綠色熒光蛋白(GFP)由lef-10啟動子啟動(信號弱)，紅色熒光蛋白(dsRed)由p10啟動子啟動(信號強),故本試驗利用紅色熒光蛋白的表達及病毒能否傳代,檢測判斷LEF-10第21位上突變的不同氨基酸殘基對AcMNPV活性的影響,結果如圖1所示。從圖1可以看出，lef-10 Bacmid、lef-10L21IBacmid、lef-10L21ABacmid、lef-10L21FBacmid、lef-10L21CBacmid、lef-10L21MBacmid、lef-10L21VBacmid 7種異位突變型重組病毒出現(xiàn)二次感染。

圖1 20種異位回補重組病毒轉染Sf9細胞熒光顯微觀察Fig.1 Fluorescence microscopic observation of Sf9 cells transfected by 20 ectopic backfilling recombinant viruses

用20種重組病毒感染Sf9細胞時，與預期一致，只有上述7種重組病毒產生熒光信號，即成功感染Sf9細胞(圖2)。

圖2 異位回補重組病毒感染Sf9細胞熒光顯微觀察Fig.2 Fluorescence microscopic observation of Sf9 cells infected by ectopic backfilling recombinant viruses

2.2 rpsL-AMP DNA片段的擴增

以prpsL-AMP質粒為模板，通過PCR擴增含有l(wèi)ef-10基因兩側同源臂的rpsL-AMP DNA片段，得到1 493 bp的特異性片段(圖3)，與預期結果一致。

M.DNA Marker；1.rpsL-AMP DNA片段M.DNA Marker;1.rpsL-AMP DNA fragment圖3 rpsL-AMP DNA片段的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of rpsL-AMP DNA fragment

2.3 敲除lef-10基因的AcMNPV陽性菌落鑒定

通過菌落PCR篩選在氨芐青霉素抗性平板上的陽性菌落，引物設計原則為2條引物分別結合敲除位點的上游/下游和插入基因，因此如無擴增條帶則說明敲除失敗，如擴增出與預期大小一致的條帶則說明敲除成功。PCR擴增得到的DNA片段大小為328 bp(圖4)，與預期相符，證明篩選結果為陽性的菌落中，lef-10基因已被rpsL-AMP DNA片段成功替換。

M.DNA Marker；1～2.敲除lef-10基因的陽性菌落M.DNA Marker;1-2.Positive colonyof knock-out lef-10 gene圖4 敲除lef-10基因的陽性菌落PCR鑒定Fig.4 Identification of positive colonies knock-out lef-10 gene by PCR

2.4 反篩AcMNPV lef-10L21X陽性菌落的鑒定

通過菌落PCR篩選在鏈霉素抗性平板中的陽性菌落。引物設計原則同2.3節(jié)。PCR擴增的DNA片段大小為216 bp,符合預期大小(圖5)，且PCR產物測序結果也符合預期，表明rpsL-AMP DNA片段成功被lef-10L21X片段替換。

M.DNA Marker；1～19.依次為lef-10L21G、lef-10L21I、lef-10L21P、lef-10L21V、lef-10L21F、lef-10L21W、lef-10L21Y、lef-10L21D、lef-10L21E、lef-10L21R、lef-10L21H、lef-10L21K、lef-10L21S、lef-10L21T、lef-10L21C、lef-10L21M、lef-10L21N、lef-10L21Q、lef-10L21A的陽性菌落M.DNA Marker;1-19.In order of lef-10L21G,lef-10L21I,lef-10L21P,lef-10L21V,lef-10L21F,lef-10L21W,lef-10L21Y,lef-10L21D,lef-10L21E,lef-10L21R,lef-10L21H,lef-10L21K,lef-10L21S,lef-10L21T,lef-10L21C,lef-10L21M,lef-10L21N,lef-10L21Q,lef-10L21A positive colony,respectively圖5 lef-10L21X反篩陽性菌落的PCR鑒定Fig.5 Identification of lef-10L21X reverse sieving positive colony

2.5 Bacmid lef-10L21X重組病毒的檢測

將Bacmidlef-10L21X與pTriEx-p(p10)-dsRed質粒共轉染Sf9細胞，通過同源重組產生重組桿狀病毒，利用紅色熒光蛋白(dsRed)的表達和病毒能否傳代來判斷LEF-10第21位不同氨基酸殘基原位突變是否會影響AcMNPV的活性。從圖6和圖7可以看出，Bacmidlef-10、Bacmidlef-10L21I、Bacmidlef-10L21A、Bacmidlef-10L21F、Bacmidlef-10L21C、Bacmidlef-10L21M、Bacmidlef-10L21V7種原位突變型重組病毒能產生有感染活性的子代病毒。這與2.1節(jié)中異位突變型重組病毒的結果一致，說明當LEF-10第21位突變?yōu)槌鲜?種氨基酸殘基外的其他氨基酸殘基時，無法獲得重組病毒，即為致死突變。同時說明第21位不同氨基酸殘基對LEF-10活性的影響無位置效應。

圖6 20種原位突變重組病毒轉染Sf9細胞熒光顯微觀察Fig.6 Fluorescence microscopic observation of Sf9 cells transfected by 20 situ mutant recombinant viruses

圖7 原位突變重組病毒感染Sf9細胞熒光顯微觀察Fig.7 Fluorescence microscopic observation of Sf9 cells infected by situ mutant recombinant viruses

2.6 Bacmid lef-10L21X重組病毒對外源蛋白表達的影響

利用極限稀釋法測定7種原位突變重組病毒的病毒滴度，結果如下：

Bacmidlef-10(TCID50)=1.2×108/mL-1；

Bacmidlef-10L21A(TCID50)=8×107/mL-1；

Bacmidlef-10L21F(TCID50)=1.1×108/mL-1；

Bacmidlef-10L21M(TCID50)=8.8×107/mL-1；

Bacmidlef-10L21V(TCID50)=9.7×107/mL-1；

Bacmidlef-10L21C(TCID50)=7×107/mL-1；

Bacmidlef-10L21I(TCID50)=8.4×107/mL-1。

將7種原位突變重組病毒分別以MOI=1和MOI=10感染Sf9細胞，并通過流式細胞儀檢測dsRed熒光蛋白的表達量，檢測結果(圖8)表明：將7種重組病毒以低MOI(MOI=1)感染Sf9細胞時，晚期基因的表達量差異較??；將7種重組病毒以高MOI(MOI=10)感染Sf9細胞時，Bacmidlef-10、Bacmidlef-10L21M、Bacmidlef-10L21V的外源蛋白表達量明顯低于其他4種重組病毒；其中Bacmidlef-10L21A重組病毒的外源蛋白表達量維持在較高水平上。上述結果表明，Bacmidlef-10L21A重組病毒可能在表達外源蛋白時具有優(yōu)勢。

A.以MOI=1感染Sf9細胞；B.以MOI=10感染Sf9細胞SF9為未感染的Sf9細胞；L21～L21I分別為7種重組病毒感染的Sf9細胞A.Infect Sf9 cells with MOI=1;B.Infect Sf9 cells with MOI=10 SF9 is uninfected Sf9 cells;L21-L21I are Sf9 cells infected by 7 recombinant viruses,respectively圖8 Bacmid lef-10L21X重組病毒表達外源蛋白的流式細胞儀檢測結果Fig.8 Flow cytometry results of foreign proteins expression of Bacmid lef-10L21X recombinant viruses

3 討 論

作為最小的桿狀病毒晚期表達因子，LEF-10與桿狀病毒晚期基因的轉錄有關[24]。但目前為止對于LEF-10的研究較少，對LEF-10調節(jié)病毒晚期基因表達的機制尚不清楚。敲除AcMNPV中的lef-10不能獲得重組病毒，這一現(xiàn)象在BmNPV中也同樣存在[18]，這暗示著lef-10是一個必需基因。已有研究表明，LEF-10是第一個被發(fā)現(xiàn)的由病毒編碼的朊病毒，具有朊病毒特性。當LEF-10高表達時會誘導自身聚集，這種聚集會導致部分LEF-10功能的喪失，進而影響病毒晚期基因的表達[23]。序列分析表明，LEF-10序列中，47%的氨基酸殘基是疏水性氨基酸殘基，且保守氨基酸殘基多為疏水性氨基酸殘基[24]，這可能與其聚集現(xiàn)象有關。當?shù)鞍踪|發(fā)生聚集時，其疏水氨基酸會呈現(xiàn)在聚集體表面，加劇蛋白質聚集，故改變蛋白質的疏水性也許能調節(jié)蛋白質的聚集傾向。針對28種LEF-10的同源基因進行序列比對后得知，LEF-10第21位的亮氨酸(疏水氨基酸)殘基為完全保守的位點，將其突變?yōu)楸彼?疏水氨基酸)殘基時，LEF-10的聚集傾向降低，但這只是疏水氨基酸之間的替換，所以對第21位氨基酸殘基進行飽和突變將更具說服力。本研究發(fā)現(xiàn)，當將LEF-10第21位氨基酸殘基進行飽和突變后外源過表達回補缺陷型病毒時，大多數(shù)突變體對AcMNPV來說是致死的，只有野生型及突變?yōu)镮、V、F、C、M和A的6種氨基酸殘基能夠獲得有活性的重組病毒。為了避免異位回補引入的位置效應，筆者還對lef-10進行內源原位回補突變，且得到一致的結論。值得注意的是，7種氨基酸中除半胱氨酸為親水氨基酸外其他均為疏水氨基酸。這個結果證實第21位氨基酸殘基位對LEF-10的功能起著至關重要的作用，且從活性上講該位點可能需要一個疏水氨基酸殘基，雖然該位點為半胱氨酸殘基時也能拯救病毒，但具體機制尚不清楚。

LEF-10作為晚期表達因子，能夠調控其他晚期基因的表達，因此以LEF-10突變體作為研究對象對LEF-10功能的研究具有重要意義。本研究構建原位突變重組病毒后通過p10啟動子啟動報告基因的表達，以此檢測不同LEF-10突變體對晚期基因表達的影響。當將病毒以1 MOI感染Sf9細胞時，7種不同氨基酸殘基對晚期基因表達的影響無顯著差異；當將病毒以10 MOI感染Sf9細胞時，報告基因的表達量均有不同程度下降，但6個突變型病毒的活性均明顯高于野生型病毒，其中突變成丙氨酸殘基的重組病毒(Bacmidlef-10L21A)報告基因表達量仍維持在較高水平，這與之前報道相符[23]。這可能是因為丙氨酸短側鏈降低了蛋白質的聚集傾向，進而提高了報告基因的表達量。桿狀病毒表達系統(tǒng)存在一個不可忽視的局限，即在一定的MOI范圍內，外源蛋白的產量隨著MOI的提高而增加，但當MOI提高到一定程度后，外源蛋白的產量反而會隨MOI的提高而下降。LEF-10L21A聚集傾向的降低，很可能是突破高MOI下桿狀病毒表達系統(tǒng)限制的有效方法。通過研究LEF-10第21位點突變對AcMNPV活性的影響，為進一步探究LEF-10的朊病毒特性及其在病毒復制中的作用奠定了基礎，并可為優(yōu)化桿狀病毒表達載體提供參考。