Pt-Pd合金納米顆粒標(biāo)記口蹄疫A型病毒抗體檢測的免疫層析方法

孫燕燕，李昕，林密，李峰松，包艷芳，陳夏輝，楊光，曾巧英，蔣韜

Pt-Pd合金納米顆粒標(biāo)記口蹄疫A型病毒抗體檢測的免疫層析方法

孫燕燕1,2，李昕2，林密2，李峰松1,2，包艷芳2，陳夏輝2，楊光2，曾巧英1，蔣韜2

1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室/口蹄疫國家參考實驗室，蘭州 730046

【】為建立一種新型、高靈敏度，可直觀與定量分析的快速檢測方法，本研究創(chuàng)新使用具有氧化還原酶活性的合金納米材料，將其作為標(biāo)記物制備免疫層析試紙。待反應(yīng)結(jié)束，使用TMB顯色劑對免疫反應(yīng)進(jìn)行級聯(lián)放大，可以顯著提高檢測的靈敏度，不僅可直觀判斷，也可精確定量分析，這為免疫層析技術(shù)標(biāo)志物篩選與敏感性提高開拓了新的思路與方法。采用超聲水浴法，通過抗壞血酸（AA）還原K2PtCl4和Na2PdCl4成功出制備Pt-Pd合金納米顆粒，將其用于標(biāo)記口蹄疫A型純化抗原FMDV-146S，作為捕獲抗原納米標(biāo)記物，再將純化的A型表達(dá)抗原及其抗體（FMDV-146S-Ab）包被在硝酸纖維素膜（NC）上，分別作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），經(jīng)條件優(yōu)化，建立口蹄疫A型病毒抗體Pt-Pd合金納米顆粒試紙條檢測方法。對該免疫層析檢測技術(shù)進(jìn)行方法學(xué)考核，檢測結(jié)果定量分析并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時與LPB-ELISA進(jìn)行結(jié)果比對。該試紙條可在10 min內(nèi)完成定性和定量檢測，定量檢測靈敏度為1:28/test，線性范圍 1:26/test—1:29/test；檢測A型FMDV陽性血清，敏感性為98%，檢測FMDV陰性血清、O型和Asia 1型的FMDV陽性血清以及其他動物常見病毒病陽性血清，特異性為94.8%；該試紙條重復(fù)檢測效果良好；與OIE推薦LPB-ELISA法比較，相關(guān)性好，相關(guān)系數(shù)為0.9112。本研究開拓采用Pt-Pd合金納米顆粒為標(biāo)記物建立免疫層析方法，并首次應(yīng)用于口蹄疫病毒抗體檢測，結(jié)果證實其具備較高靈敏度，相比膠體金靈敏度可提高24倍，同時具備可操作性與重現(xiàn)性。該研究是快速免疫層析技術(shù)的新嘗試，為合金類納米材料應(yīng)用提供新的思路，未來具有實踐應(yīng)用前景。

免疫層析法；Pt-Pd合金納米顆粒；過氧化物酶；口蹄疫A型病毒

0 引言

【研究意義】近年來，隨著納米材料的發(fā)展，其催化性能已被廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)和生物等領(lǐng)域[1]。納米顆粒還可以通過與熒光分子或酶分子等相結(jié)合作為生物探針或免疫標(biāo)記物[2-3]。區(qū)別于傳統(tǒng)膠體金的不穩(wěn)定性、與抗體結(jié)合不牢固、只能定性等缺點，本研究創(chuàng)新的將具有氧化還原酶活性的Pt-Pd合金納米顆粒作為標(biāo)記物建立免疫層析方法[4]，取代傳統(tǒng)的金顆粒標(biāo)記物，使得快速檢測具有高靈敏度，精確定量的效果，為免疫層析技術(shù)標(biāo)志物的篩選以及納米材料的應(yīng)用方向提供新的思路。【前人研究進(jìn)展】免疫層析技術(shù)作為一項快速診斷技術(shù)，已被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、檢驗檢疫等領(lǐng)域[5-7]。免疫層析法中最常用的標(biāo)記物為膠體金和單分散乳膠[8-9]。以膠體金或者乳膠微球為標(biāo)記物的光學(xué)定量免疫層析檢測技術(shù)，是通過檢測硝酸纖維素膜表面標(biāo)記物光反射信號的密度來實現(xiàn)定量檢測，因此其靈敏度較低[10-12]。而隨著對納米材料研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)納米合金材料在光、電、磁、抗蝕性、催化等方面表現(xiàn)出非常優(yōu)良獨特的性質(zhì)[13-15]，并且與相應(yīng)的單金屬納米顆粒相比，雙金屬納米顆粒具有更好的類酶催化性能[16-18]。納米材料模擬酶區(qū)別于天然酶和傳統(tǒng)模擬酶，它們更加穩(wěn)定，且在寬的溫度范圍仍能具有同樣高效的催化活性[19-21]。近年來，由于納米科學(xué)技術(shù)的巨大發(fā)展，納米科技在環(huán)境保護(hù)、生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)工藝等領(lǐng)域中起到了根本性變革作用。新型納米材料標(biāo)記物的研制也日新月異，將其應(yīng)用于免疫層析技術(shù)亦朝著高靈敏度、多元化、實現(xiàn)定量或半定量的檢測方向發(fā)展[22-23]。目前一些新型的納米材料標(biāo)志物在研究領(lǐng)域被廣為知曉，如納米磁珠、鑭系元素、上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒、納米乳球及量子點等[24-25]?！颈狙芯壳腥朦c】具有催化活性的納米材料多應(yīng)用于電化學(xué)檢測，將其創(chuàng)造性應(yīng)用于免疫層析技術(shù)由蔣韜等[4]于2016年提出。以具有類酶活性的合金納米材料為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)不存在膠體金需大量聚集才能顯色的缺點，在反應(yīng)完成后通過使用TMB顯色劑對免疫反應(yīng)進(jìn)行級聯(lián)放大，可以提高檢測靈敏度，減少樣品本底的干擾。另外，因合金納米顆粒性能穩(wěn)定，故將其作為標(biāo)記物便于定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，擁有傳統(tǒng)標(biāo)記物所無法比擬的優(yōu)勢。到目前為止，在國內(nèi)制備出良好酶學(xué)活性的Pt-Pd合金納米材料并應(yīng)用于動物疫病診斷屬首次。【擬解決的關(guān)鍵問題】在前期研究的基礎(chǔ)上，首次建立以具有類酶活性的合金納米顆粒為新型標(biāo)記物的免疫層析定量檢測方法，根據(jù)文獻(xiàn)[26-28]，制備出性能穩(wěn)定的Pt-Pd合金納米顆粒，用于口蹄疫病毒抗體檢測，并對該方法的性能進(jìn)行鑒定評價。證實本方法靈敏度高，可操作性強(qiáng)，重現(xiàn)性良好。該方法的建立突破傳統(tǒng)免疫層析方法標(biāo)記物的應(yīng)用思路，開拓性地將酶級聯(lián)放大方法引入試紙條顯色判斷。為未來免疫層析技術(shù)高靈敏度的可視化方法提供新的手段。

1 材料與方法

本試驗于2018年5月至2019年12月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所完成。

1.1 毒種、血清樣品

牛源口蹄疫A型疫苗株由中農(nóng)威特生物科技股份有限公司提供；口蹄疫A型感染血清12份（豬、牛和羊各4份），A型免疫血清28份（其中陽性血清18份，包括豬、牛和羊各6份；弱陽性血清10份，包括豬血清4份、牛和羊各3份），口蹄疫O型免疫血清18份（豬、牛各7份、羊4份），口蹄疫Asia1型免疫血清12份（牛7份，羊5份），健康血清22份（豬血清8份、牛和羊各7份）,豬呼吸與繁殖綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、塞內(nèi)卡谷病毒（SVV）抗體陽性豬血清，羊小反芻獸疫（PPRV）抗體陽性羊血清，牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）抗體陽性牛血清各1份，均由口蹄疫國家參考實驗室收集保存。兔抗口蹄疫A型病毒純化抗體由口蹄疫國家參考實驗室制備。

1.2 主要試劑和儀器

K2PtCl4、Na2PdCl4、抗壞血酸、普朗尼克-F127均購自Sigma公司；Bechman optimal XP100超速離心機(jī)購自美國Beckmen公司；XY3000噴膜機(jī)、CM3000切條機(jī)，購自美國Bio-Dot公司；TU-1900紫外可見分光光度計，購自北京普析公司。

1.3 FMDV標(biāo)記抗原與檢測抗原的制備

將滅活好的牛源口蹄疫A型疫苗株進(jìn)行差速、超速離心，將離心后的一部分抗原進(jìn)行分裝，置于-20℃凍存，作為標(biāo)記抗原。另一部分抗原用于150—450 g·L-1蔗糖密度梯度離心后，再用紫外分光光度計測定其OD259nm值，取OD259nm大于0.4的部分合并，作為檢測抗原，抗原定量公式為146S（μg·ml-1）=128.7× OD259nm。

1.4 Pt-Pd合金納米顆粒的制備

分別取900 μL K2Ptcl4（20 mmol·L-1）、100 μL Na2Pdcl4（22 mmol·L-1）、22 μL HCl（6 mol·L-1）、1 mL抗壞血酸（100 mmol·L-1）加入10 mg普朗尼克-F127中，充分混勻，30℃水浴加熱超聲處理5 h。將處理后的液體用丙酮和純水交替洗5次，每次洗完均離心 3 000 r/min，5 min，棄去上清，收集沉淀，4℃?zhèn)溆谩２捎猛干潆娮语@微鏡對Pt-Pd合金納米顆粒的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描，觀察其聚集狀態(tài)及粒徑分布[29]。

1.5 最適標(biāo)記條件的選擇與抗原標(biāo)記量的優(yōu)化

1.5.2 Pt-Pd合金納米顆粒標(biāo)記抗原量的優(yōu)化 選擇最適條件的Pt-Pd合金納米顆粒溶液。將FMDV抗原超離部分稀釋為38.69 μg·mL-1后，分別取適量在緩慢攬拌條件下加入到Pt-Pd合金納米顆粒溶液中，控制最終抗原量分別為0.774、0.387和0.193 μg·mL-1，組裝試紙條，比較試紙條跑條結(jié)果，以確定Pt-Pd合金納米顆粒標(biāo)記抗原時的最佳抗體量。

1.6 Pt-Pd合金納米顆粒試紙條的制備

將最佳標(biāo)記量的FMDV抗原超離部分加入Pt-Pd合金納米顆粒溶液中，磁力攪拌10—15 min，加入100 g·L-1BSA至終濃度為10 g·L-1，繼續(xù)磁力攪拌10—15 min。之后6 000 r/min離心10 min，將沉淀用相應(yīng)緩沖液重懸噴涂于玻璃纖維制成合金標(biāo)記墊。

將純化好的FMDV-146S與FMDV-146S-Ab倍比稀釋后確定最佳包被量并分別標(biāo)記于NC膜的T線與C線，按順序裝配，即制成口蹄疫A型病毒抗體檢測試紙條（圖1）。

1.7 樣品檢測及結(jié)果判定

1.7.1 定性檢測 向試紙卡的樣品孔中加入35 μL待檢血清，之后再加入等體積稀釋液，反應(yīng)10 min后向NC膜反應(yīng)區(qū)加入TMB顯色劑，隨即進(jìn)行結(jié)果判定。

1.7.2 定量檢測

1.7.1 有效性評價指標(biāo) ①腹痛發(fā)作天數(shù)，②腹痛程度，③伴隨癥狀，以上均于基線、治療后第1、2周記錄，治療結(jié)束評價；④中醫(yī)證候療效，基線、治療結(jié)束記錄，治療結(jié)束評價；⑤腹痛復(fù)發(fā)情況，治療結(jié)束后4周評價。以腹痛發(fā)作天數(shù)為主要評價指標(biāo)。

1.7.2.1 判定值(CUT-OFF)的確定 液相阻斷ELISA方法（LPB-ELISA）為OIE推薦的用于檢測血清中口蹄疫抗體效價的經(jīng)典方法。分別取已知LPB-ELISA抗體效價為1:64、1:128、1:256和1:512的口蹄疫A型陽性血清各1份，用本試驗制備的試紙條進(jìn)行檢測，每份血清重復(fù)檢測10次，用金標(biāo)免疫分析儀掃描讀取信號T/C比值。將T/C比值的平均值作為CUT-OFF值，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.2.2 定量檢測判定 將顯色后的試紙條放入金標(biāo)免疫分析儀掃描，讀取信號T/C比值，并以此在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)該份血清的抗體效價。

圖1 免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)

1.7.2.3 定量檢測的重復(fù)性 取口蹄疫A型陽性血清（LPB-ELISA抗體效價1:1024）進(jìn)行1:2—1:25稀釋，每個稀釋度重復(fù)檢測20次，并用金標(biāo)分析儀掃描讀取信號T/C值。將20次檢測的T/C值的標(biāo)準(zhǔn)差與平均值的比值定為變異系數(shù)。

1.8 敏感性與特異性試驗

分別用Pt-Pd合金納米顆粒檢測試紙條和膠體金試紙條檢測本課題組保存的FMDV O型、A型和Asia I型抗體陽性血清，F(xiàn)MDV陰性血清以及豬、牛、羊常見病毒病感染陽性血清，比較兩種試紙條的陰、陽性檢出率，確定納米材料試紙條對不同性質(zhì)樣本的敏感性和特異性。

將口蹄疫A型陽性血清樣品（LPB-ELISA抗體效價1:2048）從1﹕4開始進(jìn)行4倍稀釋，分別用Pt-Pd合金納米顆粒試紙條和膠體金試紙條進(jìn)行檢測，靜置10 min觀察結(jié)果，評估試紙條的靈敏度。

1.9 新納米材料試紙條與LPB-ELISA抗體效價相關(guān)性分析

將本課題組保存的背景清晰的102份口蹄疫A型陽性血清、O型、Asia1型陽性血清與陰性血清分別使用Pt-Pd合金納米顆粒試紙條和LPB-ELISA進(jìn)行平行對比試驗，并進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 FMDV標(biāo)記抗原與檢測抗原含量的確定

紫外分光光度計檢測，收集OD260 nm≥0.4的抗原，計算可得標(biāo)記抗原病毒含量為386.9 μg·mL-1，檢測抗原病毒含量為275.3 μg·mL-1，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 Pt-Pd合金納米顆粒的形態(tài)與大小

制備好的Pt-Pd合金納米顆粒的透射電鏡掃描圖如圖2所示。從圖中可以看出，Pt-Pd合金納米顆粒近似于球體的膠體聚集體形式存在，由多個顆粒相互穿插，形成鏈枝狀的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，其基本顆粒尺寸在50 nm左右。

圖2 Pt-Pd合金納米顆粒透射電鏡圖

2.3 最適標(biāo)記條件的確定

靜置20 min后，溶解于pH 7.5磷酸鹽緩沖液和pH 8.5硼酸鹽緩沖液中的捕獲抗原納米標(biāo)記物出現(xiàn)肉眼可見的顆粒性沉淀；而在pH 9.5的碳酸鹽緩沖液中則分散狀態(tài)穩(wěn)定，未出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。最終確定pH 9.5 0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液為Pt-Pd合金納米顆粒溶解與標(biāo)記的最適緩沖體系。

當(dāng)檢測線標(biāo)記量為0.774 μg·mL-1，加入TMB后試紙條背景整體顯色較深，且出現(xiàn)非特異性反應(yīng)；標(biāo)記量為0.193 μg·mL-1時，試紙條檢測線顯色變淺；為保證試紙條顯色和靈敏度，最終確定A型口蹄疫抗原最適標(biāo)記量為0.387 μg·mL-1。

2.4 檢測線與質(zhì)控線最佳包被量的確定

檢測口蹄疫病毒A型陽性血清（LPB-ELISA抗體效價1:128），能明顯觀察到T線顯示黑色條帶；檢測口蹄疫病毒O型、Asia1型血清和陰性血清時，T線不顯色，檢測線包被抗原最適濃度為55.1 μg·mL-1。

將兔抗IgG用PB溶液稀釋不同濃度，檢測口蹄疫病毒A型陽性血清，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行至C線時，C線立即顯色，且C線顏色和T線一致，質(zhì)控線包被兔抗最適濃度為0.67 mg·mL-1。

2.5 試紙條結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

2.5.1 定性檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 陽性：C線和T線均顯色；陰性：C線顯色，T線不顯色；可疑：C線顯色，T線若隱若現(xiàn)，顏色很淺；無效：C線不顯色。

2.5.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 在最優(yōu)試驗條件下，依據(jù)檢測體系中待測物濃度與金標(biāo)分析儀讀值T/C比值在一定條件下呈線性關(guān)系的原理，以A型陽性血清樣品的LPB-ELISA抗體效價為橫坐標(biāo)，金標(biāo)分析儀讀值T/C比值為縱坐標(biāo)作圖，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)LPB-ELISA抗體效價為1:64—1:512時，與其金標(biāo)分析儀讀值T/C比值之間呈良好的線性關(guān)系（圖3），線性回歸方程為y=0.2056x-0.2155，相關(guān)系數(shù)2= 0.9692，線性良好。

圖3 Pt-Pd合金納米顆粒試紙條定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.3 定量檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 將待檢血清的T/C值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可對應(yīng)獲得該份血清的抗體效價（表1）。

2.5.4 重復(fù)性試驗 重復(fù)檢測稀釋度1:2—1:25的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，每個濃度檢測20次，變異系數(shù)介于3.4%—14.3%，證實該檢測技術(shù)具有較好的精密度（表2）。

2.6 敏感性與特異性分析

如圖4所示，對于50份A型陽性血清，Pt-Pd合金納米顆粒試紙條可檢測出陽性結(jié)果49份，膠體金試紙條可檢測出陽性結(jié)果48份，敏感性分別為98%和96%。對于22份陰性血清，Pt-Pd合金納米顆粒試紙條和膠體金試紙條均可檢測出陰性結(jié)果22份，特異性均為100%；對于36份特異性血清（包括30份口蹄疫O、亞I型病毒血清和6份其他病毒感染動物陽性血清），Pt-Pd合金納米顆粒試紙條可檢測出陰性結(jié)果34份，膠體金試紙條可檢測出陰性結(jié)果31份，特異性分別為94%和86%；綜合以上分析，兩種試紙條特異性分別為94.8 %和91.4%。結(jié)果表明，Pt-Pd合金納米顆粒試紙條有更高的敏感性和特異性。

表1 定量檢測結(jié)果判定

表2 Pt-Pd合金納米顆粒免疫層析試紙條檢測系統(tǒng)的變異系數(shù)

2.7 靈敏度最低檢測限試驗

Pt-Pd合金納米顆粒試紙條能檢出稀釋度為1:28/test；而膠體金試紙條只能檢測出稀釋度1:24/test。因此，Pt-Pd合金納米顆粒試紙條靈敏度更高（圖5、表3）。

2.8 Pt-Pd合金納米顆粒試紙條與LPB-ELISA比對試驗相關(guān)性分析

對背景清晰的102份血清樣品分別用Pt-Pd合金納米顆粒試紙條和LPB-ELISA方法進(jìn)行檢測，并將二者抗體效價（Log10）進(jìn)行比對（圖6）。Pt-Pd納米顆粒試紙條的檢測結(jié)果與LPB-ELISA的檢測結(jié)果具有良好的一致性，線性回歸方程為：y = 0.8969x + 0.2346，相關(guān)系數(shù)2=0.9112。比對結(jié)果說明，本研究建立的Pt-Pd合金納米顆粒免疫層析方法可靠，適合于血清中口蹄疫病毒抗體的快速檢測。

圖4 Pt-Pd合金納米顆粒試紙條與膠體金試紙條敏感性、特異性結(jié)果比較

（A）為膠體金試紙條靈敏度檢測結(jié)果；（B）為Pt-Pd合金納米顆粒試紙條檢測結(jié)果

表3 標(biāo)準(zhǔn)品血清不同稀釋度下兩種試紙條最低檢測限

3 討論

目前市場上主打的免疫層析產(chǎn)品大部分基于膠體金為標(biāo)記物[30]。隨著檢測方法的不斷成熟以及多種標(biāo)記物不斷發(fā)展，逐漸出現(xiàn)脂質(zhì)體、膠態(tài)碳、熒光微球、量子點、磷光發(fā)光粉和生物發(fā)光物等[30]標(biāo)記物。高靈敏度和精準(zhǔn)定量已成為免疫層析技術(shù)發(fā)展的新需求。納米材料用于生物分析標(biāo)記物質(zhì)，可大大改善標(biāo)記物的性能，顯著提升現(xiàn)有分析方法的靈敏度及特異性，其在抗原抗體的標(biāo)記上具有很大的應(yīng)用潛能[31]。近年來，酶學(xué)性質(zhì)合金納米材料常規(guī)多應(yīng)用于電化學(xué)領(lǐng)域，因為它的微量酶學(xué)反應(yīng)活性，可以被電信號的變化捕捉，成為電化學(xué)診斷的首選標(biāo)記物。但因合金材料無色，無發(fā)射光譜，所以在免疫層析技術(shù)發(fā)展近四十年歷程中，它從來沒有作為可選的標(biāo)記物。本研究在有關(guān)類酶材料免疫層析應(yīng)用的基礎(chǔ)上，通過自制具有氧化還原酶活性的納米材料，首次應(yīng)用于口蹄疫免疫抗體檢測。建立的新型免疫層析方法靈敏度相比膠體金試紙條可提高24倍。同時為了實現(xiàn)抗體效價精確判定，對TMB顯色級聯(lián)放大后的免疫反應(yīng)建立定量曲線，根據(jù)T/C值可比對得到相應(yīng)的經(jīng)典LPB-ELISA 抗體效價。

圖6 Pt-Pd合金納米顆粒試紙條與LPB-ELISA相關(guān)性分析

為制備適宜標(biāo)記的合金材料，研究初期通過多步驟探索性試驗反復(fù)摸索，最終確定采用金屬離子還原法[29]制備合金納米材料。該方法是利用穩(wěn)定劑（普朗尼克F127）聚合物膠束在強(qiáng)酸性介質(zhì)中緩慢還原兩種金屬物質(zhì)，實現(xiàn)了合金納米顆粒的快速液相合成。相對傳統(tǒng)晶種生長法[31]、模板法[29]和電化學(xué)法[32]解決了高溫、高壓等復(fù)雜的試驗操作程序。制備過程由于加入化學(xué)試劑，可能會給納米顆粒的催化性能造成影響，但通過反復(fù)多步丙酮和水交替洗滌、離心循環(huán)，即可去除未沉積的金屬微粒和表面活性劑。最終收集到的納米顆粒為分散良好、無沉淀、高質(zhì)量的膠體溶液。在合金材料的選擇上，初期階段共制備出Pt-Au和Pt-Pd兩種納米材料作為備選的免疫層析標(biāo)記物，但最終確定使用Pt-Pd合金納米顆粒，是因為Pt-Pd與Pt-Au相比，其催化活性更強(qiáng)，在最適緩沖體系中能更好地捕獲FMDV抗原，反應(yīng)結(jié)束后加入TMB顯色劑級聯(lián)放大作用更明顯。因此，本研究將Pt-Pd合金納米顆粒作為檢測的最佳免疫層析標(biāo)記物。

本研究在對合金納米顆粒緩沖體系選擇的過程中發(fā)現(xiàn)，溶液的pH和離子強(qiáng)度是影響納米材料標(biāo)記物穩(wěn)定性最為關(guān)鍵的指標(biāo)，最終確定pH 9.5，濃度0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液是最佳的工作環(huán)境。分析在該環(huán)境下，一方面溶液的pH與標(biāo)記蛋白本身等電點接近，使得納米顆粒能夠更好地與標(biāo)記抗原結(jié)合，不易發(fā)生聚沉。另一方面使用適宜的低離子強(qiáng)度溶液，可以保證Pt-Pd合金納米顆粒呈穩(wěn)定的分散狀態(tài)。因為納米顆粒具有膠體的多種特性，對電解質(zhì)較為敏感，若溶液中離子強(qiáng)度過高，則游離的電解質(zhì)會破壞顆粒外圍的永水化層，從而打破其穩(wěn)定狀態(tài)，使分散的單一顆粒凝聚成大顆粒，進(jìn)而從液體中沉淀下來。

通過使用Pt-Pd合金納米顆粒試紙條檢測方法以及OIE推薦用于檢測血清中口蹄疫抗體效價經(jīng)典液相阻斷ELISA方法同時對口蹄疫A型陽性血清、O型、Asia1型陽性血清與陰性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，Pt-Pd合金納米顆粒試紙條敏感性高，與LPB- ELISA方法相同，雖然特異性略低于LPB-ELISA，但試紙條檢測方法的優(yōu)勢在于檢測速度快，10 min左右即可得到檢測結(jié)果；無需特殊儀器設(shè)備；操作簡單，便于基層臨床檢測。本方法的建立打破傳統(tǒng)膠體金試紙條的模式，開創(chuàng)了免疫層析標(biāo)記物選擇新方向，也使免疫層析試紙條的應(yīng)用模式有了跨越式的發(fā)展。將具有類酶活性的合金納米材料應(yīng)用于免疫層析技術(shù)與傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)相比，具有獨特的優(yōu)勢，特別是在定量化方面的前景，非常符合近些年來快速診斷技術(shù)發(fā)展的新要求。但由于目前在合金納米材料制備的過程中均使用進(jìn)口化學(xué)試劑，導(dǎo)致制備成本較高，下一步需要進(jìn)行國產(chǎn)試劑替代的嘗試，同時擴(kuò)大檢測樣本，確定該方法在產(chǎn)業(yè)化、市場化的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究成功制備具有類酶活性且適用于標(biāo)記的Pt-Pd合金納米顆粒，于國內(nèi)屬于首次，并開創(chuàng)性地將其作為標(biāo)記物建立免疫層析定量檢測方法，用于動物病毒抗體的檢測。通過各種評價性試驗證實該方法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性良好，可為免疫層析檢測方法提供有效的技術(shù)支撐。

[1] WANG G L, XU X F, QIU L, DONG Y M, LI Z J, ZHANG C. Dual responsive enzyme mimicking activity of AgX (X = Cl, Br, I) nanoparticles and its application for cancer cell detection. ACS Applied Materials & Interfaces, 2014, 6(9): 6434-6442.

[2] MU J S, WANG Y, ZHAO M, ZHANG L. Intrinsic peroxidase–like activity and catalase–like activity of Co3O4 nanoparticles. Chemical Communications, 2012, 48(19): 2540-2542.

[3] MUHAMMAD S, ABDEL-NASSER K, MUHAMMAD D. Designs, formats and applications of lateral flow assay: A literature review. Journal of Saudi Chemical Society, 2015, 19(6): 689.

[4] JIANG T, SONG Y, WEI T, LI H, DU D, ZHU M J, LIN Y. Sensitive detection of Escherichia coli O157: H7 using Pt-Au bimetalnanoparticles with peroxidase-like amplification. Biosensors and Bioelectronics, 2016, 77: 687-694.

[5] QUESADA-GONZáLEZ D, MERKO?I A. Nanoparticle-based lateral flow biosensors. Biosensors & Bioelectronics, 2015, 73: 47.

[6] GE X X, ASIRI A M, DU D, WEN W, WANG S F, LIN Y H. Nanomaterial-enhanced paper-based biosensors. Trends in Analytical Chemistry, 2014, 58: 31.

[7] YAN X, LI H X, HU T Y, SU X G. A novel fluorimetric sensing platform for highly sensitive detection of organophosphorus pesticides by using egg white-encapsulated gold nanoclusters. Biosensors and Bioelectronics, 2017, 91: 232.

[8] ZHOU W L, KONG W J, DOU X W, ZHAO M, OUYANG Z, YANG M H. An aptamer based lateral flow strip for on-site rapid detection of ochratoxin A in Astragalusmembranaceus. Journal of Chromatography B, 2016, 1022: 102.

[9] KIM G, MOON J H, MOH C Y, LIM J G. A microfluidic nano-biosensor for the detection of pathogenic Salmonella. Biosensors & Bioelectronics, 2015, 67: 243-247.

[10] 孫建斌, 雷小英, 包晗, 汪欽, 劉永蘭, 郭晏海, 顏真, 楊靜華. 納米磁性顆粒標(biāo)記的免疫層析法定量檢測人絨毛膜促性腺激素. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2011, 11(S2): 5001-5004.

SUN J B, LEI X Y, BAO H, WANG Q, LIU Y L, GUO Y H, YAN Z, YANG J H. Application of magnetic nanoparticles in rapid quantitative immunochromatography detection of human chorionic gonadotrophin. Progress in Modern Biomedicine, 2011, 11(S2): 5001-5004. (in Chinese)

[11] 李向梅, 王戰(zhàn)輝, 肖希龍, 王照鵬, 溫凱, 吳小平, 夏曦, 武晉孝, 江海洋. 同時檢測牛奶中喹諾酮類和慶大霉素殘留的膠體金免疫層析方法研究. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(19): 3883-3889.

LI X M, WANG Z H, XIAO X L, WANG Z P, WEN K, WU X P, XIA X, WU J X, JIANG H Y. Development of a colloidal gold immunochromatographic technique for simultaneous detection of quinolones and gentamicin in milk. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(19): 3883-3889. (in Chinese)

[12] 孫園園, 王云龍, 李玉林, 王繼創(chuàng), 程蕾, 鄧?yán)枥? pH 值對膠體金標(biāo)記單克隆抗體性能的影響. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2014, 30(11): 1170-1173.

SUN Y Y, WANG Y L, LI Y L, WANG J C, CHENG L, DENG L L.Effects of pH on the properties of colloidal gold labeling monoclonal antibody. Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology, 2014, 30(11): 1170-1173. (in Chinese)

[13] 張鑫宇, 左偉勇, 朱善元, 夏曉莉, 孫懷昌. 非洲豬瘟病毒p54抗體膠體金試紙檢測方法的建立. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2014, 36(4): 281-285.

ZHANG X Y, ZUO W Y, ZHU S Y, XIA X L, SUN H C. Establishment of colloidal gold strip for detecting antibody against African swine fever virus. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2014, 36(4): 281-285. (in Chinese)

[14] 劉復(fù)新, 豆小文, 楊志欣, 李倩, 駱驕陽, 范卓文, 楊美華. 納米顆粒標(biāo)記可視化試紙條在農(nóng)藥殘留篩查中的研究進(jìn)展. 中國中藥雜志, 2017, 42(16): 3056-3064.

LIU F X, DOU X W, YANG Z X, LI Q, LUO J Y, FAN Z W, YANG M H. Advances on nanoparticles-tagged visual test strips for the rapid detection of pesticides. China Journal of Chinese Materia Medica, 2017, 42(16): 3056-3064. (in Chinese)

[15] 宋秀玲. 多酸基熒光檢測微球的制備及布魯氏菌檢測方法的研究[D]. 長春: 吉林大學(xué), 2013.

SONG X L. Preparation of POMs-based fluorescent detection microspheres and study on the detection method of Brucella. Changchun: Jilin University, 2013. (in Chinese)

[16] XIE Q Y, WU Y H, XIONG Q R, XU H Y, XIONG Y H, LIU K, JIN Y, LAI W H. Advantages of fluorescent microspheres compared with colloidal gold as a label in immunochromatographic lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics, 2014, 54: 262-265.

[17] ZHOU J, ZHU K, XU F, WANG W J, JIANG H Y, WANG Z H, DING S Y. Development of a microsphere-based fluorescence immunochromatographic assay for monitoring lincomycin in milk, honey, beef, and swine urine. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2014, 62(49): 12061-12066.

[18] 董香梅. 單核細(xì)胞增生李斯特菌單克隆抗體制備及熒光微球免疫層析試紙條的研制[D].南昌: 南昌大學(xué), 2013.

DONG X M. Preparation of monoclonal antibodiesand fluorescent beads based immnochroniatographic strip for detection of Listeria monocytogenes [D]. Nanchang: Nanchang University, 2013. (in Chinese)

[19] 王妍入, 李培武, 張奇, 丁小霞, 張文. 噬菌體展示納米抗體模擬黃曲霉毒素抗原的活性表征.中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(4): 685-692.

WANG Y R, LI P W, ZHANG Q, DING X X, ZHANG W. Characterization of a phage-displayed nanobody imitating aflatoxin antigen. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(4): 685-692. (in Chinese)

[20] LI P W, ZHANG Z W, HU X F, ZHANG Q. Advanced hyphenated chromatographic-mass spectrometry in mycotoxin determination: Current status and prospects. Mass Spectrometry Reviews, 2013, 32(6): 420-452.

[21] 王桂芳, 劉美辰, 曹陽, 李培真. 膠體金測試條法對糧食中黃曲霉毒素B1快速定量測定的研究. 糧食科技與經(jīng)濟(jì), 2013, 38(6): 17-18.

WANG G F, LIU M C, CAO Y, LI P Z. Study on aflatoxin B1 in grain using colloidal test strip. Grain Science and Technology and Economy, 2013, 38(6): 17-18. (in Chinese)

[22] HU L M, LUO K, XIA J, XU G M, WU C H, HAN J J, ZHANG G G, LIU M, LAI W H. Advantages of time-resolved fluorescent nanobeads compared with fluorescent submicrospheres, quantum dots, and colloidal gold as label in lateral flow assays for detection of ractopamine. Biosensors and Bioelectronics, 2017, 91: 95-103.

[23] LUO K, HU L, GUO Q, WU C H, WU S S, LIU D F, XIONG Y H, LAI W H. Comparison of 4 label-based immunochromatographic assays for the detection ofO157: H7 in milk. Journal of Dairy Science, 2017, 100(7): 5176-5187.

[24] LI M, BO X J, ZHANG Y F, HAN C, GUO L P. One-pot ionic liquid-assisted synthesis of highly dispersed Pt-Pd nanoparticles reduced graphene oxide composites for nonenzymatic glucose detection. Biosensors and Bioelectronics, 2014(56): 223-230.

[25] YE J S, HONG B D, WU Y S, CHEN H R, LEE C L. Heterostructured palladium-platinum core-shell nanocubes for use in a nonenzymatic amperometric glucose sensor. Microchimica Acta, 2016 (183): 3311-3320.

[26] WANG C, SUN Y L, YU X H, MA D Q, ZHENG J, DOU P, CAO Z Z, XU X H. Ag-Pt hollow nanoparticles anchored reduced graphene oxide composites for non-enzymatic glucose biosensor. Mater Electron, 2016(27): 9370-9378.

[27] ZHAO Y, FAN L Z, HONG B, REN J L, ZHANG M S, QUE Q M, JI J Y. Nonenzymatic detection of glucose using three-dimensional PtNi nanoclusters electrodeposited on the multiwalled carbon nanotubes. Sensors and Actuators B, 2016(231): 800-810.

[28] BO X J, BAI J, YANG L, GUO L P. The nanocomposite of PtPd nanoparticles/onion-like mesoporous carbon vesicle for nonenzymatic amperometric sensing of glucose. Sensors and Actuators BChemical, 2011(157): 662- 668.

[29] 馬玉婷. 電化學(xué)法直接制備金鉑合金納米粒子及其性質(zhì)[D]. 蘇州: 蘇州大學(xué), 2009.

MA Y T. Direct electrodeposition of Au-Pt bimetallic nanoparticles and its properties [D]. Suzhou: Suzhou University, 2009. (in Chinese)

[30] 謝艷君, 楊英, 孔維軍, 楊世海, 楊美華. 基于不同納米材料的側(cè)流免疫層析技術(shù)在真菌毒素檢測中的應(yīng)用. 分析化學(xué), 2015, 43(4): 618-628.

XIE Y J, YANG Y, KONG W J, YANG S H, YANG M H. Application of nanoparticle probe-based lateral flow immunochromatography technology in mycotoxins detection. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2015, 43(4): 618-628. (in Chinese)

[31] HAMED A E, MASATAKA I, AND YUSUKE Y. All-metal mesoporous nanocolloids: solution-phase synthesis of core-shell Pd@Pt nanoparticles with a designed concave surface. Angewandte Chemie International Edition, 2013, 52: 13611-13615.

[32] 郭婷婷.金鉑鈀及合金納米線的制備和對甲醇的電催化性能研究[D]. 長沙: 湖南大學(xué), 2017.

GUO T T. Research on the synthesis of Au, Pt, Pd and alloy nanowires as well as the electrocatalytic performance for methanol[D]. Changsha: Hunan University, 2017. (in Chinese)

Establishment of a Novel Immunochromatographic Assay Based on Foot-and-Mouth Disease Virus Serotype A Labeled by Pt-Pd Bimetal Nanoparticles

SUN YanYan1,2, LI Xin2, LIN Mi2, LI FengSong1,2, Bao YanFang2, CHEN XiaHui2, YANG Guang2, ZENG QiaoYing1, JIANG Tao2

1College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070;2Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/National Foot-and Mouth Disease Reference Laboratory/ Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046

【】A novel immunochromatographic test strip with peroxidase-like activity of Pt-Pd bimetal nanoparticles (NPs) as a marker (shortened as NPs test strip) was developed. The signal amplification was based on Pt-Pd bimetal NPspossessing high peroxidase-like activity toward 3, 3, 5, 5＇-tetramethylbenzidine, which could produce characteristic colored bands. It could not only improve the sensitivity of detection, but also completed a quantitative analysis of results with reader. This method provided a rapid and effective screening means for monitoring.【】Pt-Pd bimetal NPs were prepared by K2Ptcl4and Na2Pdcl4,which were reduced by ascorbic acid (AA). The mixture was continuously sonicated in water bath. The purified antigen of FMDV serotype A was coupled with Pt-Pd bimetal NPs. The purified 146S particles of FMDV serotype A (FMDV-146S) and the antibodies against FMDV-146S (FMDV-146S-Ab) were blotted on nitrocellulose membrane as test line and control line, respectively. The sensitivity, specificity and stability of this NPs test strip were assessed by testing known positive and negative FMDV serum and positive serum against other animals’ disease. Parallel tests of the positive FMDV serum by LPB-ELISA were performed.【】This established method could be accomplished qualitatively as well as semi-quantitative detection in 10 minutes, the sensitivity was up to 1:28/test, and the linear range was from 1:26/test-1:29/test. The detection sensitivity for the serum positive for FMDV type A was 98%, and the detection sensitivity for FMDV-negative serum, serum positive for FMDV type O and type Asia 1 as well as sera positive for other common viral diseases in animals was 94.8%. The differences between batches were small. Test serum samples showed that the strip results were coincident with LPB-ELISA,2=0.9112. 【】An immunochromatographic assay based on Pt-Pd bimetal nanoparticles was established innovatively and applied to the detection of FMDV antibodies. The results demonstrated its high sensitivity, which was a 24-fold increase as compared with the colloidal gold. In addition, this novel assay also displayed excellent maneuverability and reproducibility. The established method represented a new attempt in fast immunochromatographic assay and probably predicted an alternative and highly promising application of the alloy nanoparticles.

immunochromatographic assay; Pt-Pd nanoparticles; peroxidase; foot-and-mouth disease virus (FMDV) type A

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.03.018

2020-02-23；

2020-12-18

國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0500702-2）

孫燕燕，Tel：0931-8342038；E-mail：Sabrina9029@163.com。通信作者曾巧英，Tel：0931-7631783；E-mail：zengqy@gsau.edu.cn。通信作者蔣韜，Tel：0931-8342038；E-mail：jiangtao@caas.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）