許凌峰，李卓蔚，周 濃，郭冬琴，趙晶晶

(重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120)

滇重樓作為中藥材重樓的基原植物之一被《中國藥典》收載，其根莖中主要含黃酮類、甾體皂苷、多糖類和氨基酸類活性成分。滇重樓多糖主要是由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖組成，具有顯著的免疫增強功能和抗氧化作用[1]；中藥材中的總氨基酸是藥效的輔助成分或主要成分，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和酶活性以及提高免疫力等藥理活性[2]，多糖和總氨基酸作為中成藥的主要成分極具研究開發(fā)價值。叢枝菌根真菌(AMF)作為土壤真菌和植物根系之間的共生聯(lián)系，外源接種AMF在提高藥用植物的移栽成活率[3]、增強藥用植物抵抗病蟲害的能力、增加藥用植物根的營養(yǎng)吸收功能[4]、改善藥用植物的產(chǎn)量和品質(zhì)等[5-6]方面發(fā)揮著重要的作用。王騫等[2]通過測定不同產(chǎn)地的野生和移栽滇重樓發(fā)現(xiàn)，其在單糖組成方面無明顯差異，故認為移栽滇重樓可代替野生滇重樓入藥。楊芳等[4]采用日立L-8800氨基酸自動分析儀測定出滇重樓葉、莖、花和根莖中富含17種蛋白類氨基酸和1種特殊藥效氨基酸—γ-氨基丁酸。雖然滇重樓根莖中的氨基酸含量較低，但十分易于被人體吸收，只要混配合理可對藥效起到輔助作用。本課題組前期對28種不同AMF接種滇重樓進行了初步調(diào)查[7-8]，但接種AMF對滇重樓根莖內(nèi)多糖和總氨基酸含量的影響鮮見報道。本研究以滇重樓為試驗材料，通過外源接種不同的AMF進行處理，在果熟期和衰老期測定根莖內(nèi)多糖、總氨基酸以及碳氮比，分析了AMF對滇重樓根莖品質(zhì)的影響，以期為滇重樓高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DZF-型電熱恒溫真空干燥箱(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；UV-2450型紫外可見分光光度計(日本島津集團)；CP225D型分析天平(德國Sartorius公司)。D-無水葡萄糖對照品、薯蕷皂苷元對照品(批號：111590-200402、111591-200402，中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用)；蘆丁對照品(批號：100080-200707，中國食品藥品檢定研究院，供UV法含量測定)。試驗所用的試劑均為分析純。

1.2 試驗設(shè)計

28種AMF購買自美國國際叢枝菌根真菌種質(zhì)資源保藏中心(INVAM)，詳情見表1，以不接種AMF為對照(CK)；滇重樓新鮮根莖取自大理州農(nóng)科院的同一批樣品，經(jīng)重慶三峽學(xué)院周濃教授鑒定為百合科植物云南重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)。栽培基質(zhì)為菜園土與河沙按3: 1(V: V)混合，過2 mm篩，121℃高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌2 h。2013年2月24日采用室溫盆栽方法，菌劑均勻?qū)邮┯诒硗料碌嶂貥歉?，接種劑量為每株1 mL，每盆播種5株幼苗，生長期間按常規(guī)管理，定期澆Hoagland營養(yǎng)液。分別于2013年8月(果熟期)和2013年11月(衰老期)收獲滇重樓植株的根莖，45℃條件下烘干粉碎過篩(40目)，備用。

表1 接種叢植菌根真菌的不同處理組Table 1 Different treatment groups inoculated AMF

1.3 測定方法

1.3.1 滇重樓多糖提取和測定

采用蒽酮硫酸比色法[9]。稱取1.0 g滇重樓根莖洗凈后烘干粉碎，使用石油醚回流脫脂，濾渣按一定比例加入蒸餾水，采用超聲輔助提取法進行提取，80%乙醇靜置24 h后離心15 min，過濾、沉淀加蒸餾水定容至50 mL備用。精確量取2.0 mL供試溶液于10 mL具塞刻度試管中，快速加入6.0 mL蒽酮溶液(0.8 g蒽酮溶解于400 mL 80%濃硫酸中，現(xiàn)用現(xiàn)配)，搖勻，于沸水浴顯色15 min，冷卻后定容至10 mL，在625 nm波長下測定吸光度(A)，然后從標準曲線上查得供試溶液中多糖的濃度，按照公式計算出待測樣品的多糖含量(mg·g-1)。

1.3.2 總氨基酸含量的測定

使用色譜分析法進行根莖內(nèi)總氨基酸含量的測定[4]。準確稱取 200 mg 的試樣置于水解管中，加入10 mL 6.0 mol/L 鹽酸溶液 ，抽真空后密封。將水解管置于恒溫干燥箱(110 ± 2℃)中水解 22 h，冷卻過濾備用。濾液使用6.0 mol/L NaOH 溶液調(diào)至中性，定容至 25 mL。吸取1.0 mL樣品溶液與1.0 mL 0.02 mol/L HCl 溶液混合均勻后用水系濾膜過濾后進樣，每次樣品進樣量控制在20 μL，反應(yīng)器溫度控制在 136.0℃，反應(yīng)柱溫度控制在57.0℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013進行數(shù)據(jù)的錄入、整理，用 SPSS 19.0做方差分析，用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢枝菌根對滇重樓總多糖含量的影響

由圖1分析可知，與對照相比，接種不同的AMF對滇重樓根莖內(nèi)多糖含量均有一定的影響，隨著生育進程的推進，滇重樓根莖內(nèi)的多糖含量逐漸升高，從整體趨勢上看，AMF對果熟期內(nèi)多糖含量的調(diào)控效果要好于衰老期。其中，接種Gg(巨大巨孢囊霉)、Gr(玫瑰紅巨孢囊霉 )、Dh(異配盾孢囊霉)、Rfu(亮色盾巨孢囊霉)和Cc(近明球囊霉)均促進了根莖內(nèi)的多糖含量，在果熟期時，其增長率依次為94.96%、135.63%、42.03%、35.37%和11.82%；在衰老期時，其增長率依次為16.41%、87.07%、42.16%、31.98%和42.21%， 方差分析可知，Gg、Gr、Dh、Rfu和Cc處理與CK間差異顯著，這說明接種Gg、Gr、Dh、Rfu和Cc五種AMF有利于滇重樓根莖內(nèi)多糖的積累。

2.2 叢枝菌根對滇重樓總氨基酸含量的影響

從圖2中可以看出，與對照相比，接種不同的AMF對滇重樓根莖內(nèi)總氨基酸含量均有一定的影響，隨著生育進程的推進，滇重樓根莖內(nèi)的總氨基酸含量逐漸降低。在果熟期和衰老期接種Sca(美麗盾巨孢囊霉)、Sdi(雙紫盾巨孢囊霉)、Spe(透明盾巨孢囊霉)、Dh(異配盾孢囊霉)、Sde(沙荒球囊霉)、Rin(根內(nèi)球囊霉)、Ako(何氏無梗囊霉)、Asp(刺無梗囊霉)、De(象牙白多孢囊霉)、Ds(沾屑多孢囊霉)、Po(隱類球囊霉)、Ale(薄壁兩性囊霉)和Atr(崔氏原囊霉)均增加了滇重樓根莖內(nèi)的總氨基酸含量，在果熟期，其增長了依次為14.61%、18.97%、24.47%、26.13%、51.12%、20.07%、90.58%、82.66%、37.00%、218.43%、65.65%、99.09%和109.28%； 在果熟期，其增長了依次為83.36%、78.90%、52.05%、99.03%、165.77%、48.35%、156.12%、47.56%、82.31%、166.22%、56.81%、26.55%和69.69%，方差分析可知，上述AMF處理與CK間差異達到了顯著水平，植物體內(nèi)的氨基酸主要來源于氮素的同化以及蛋白質(zhì)等含氮化合物的降解，在植株器官形成初期其含量的增加有利于器官的形成，這說明接種上述AMF可以促進滇重樓根莖的形成，為其藥用價值的改善奠定了基礎(chǔ)。

圖1 接種不同AMF對滇重樓總多糖含量的影響Fig.1 Effects of different AMF on polysaccharide content in P.polyphylla var.yunnanensis注：圖中同一指標上不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)，下同。

圖2 接種不同AMF對滇重樓總氨基酸含量的影響Fig.2 Effects of different AMF on total amino acids content in P.polyphylla var.yunnanensis

2.3 叢枝菌根對滇重樓碳氮比的影響

碳氮比可以體現(xiàn)植物的營養(yǎng)利用效率，是衡量植物體內(nèi)碳和氮養(yǎng)分平衡狀況的指標，也是植物生命過程的重要調(diào)節(jié)者和維持者，通常會趨向固定的比值，而環(huán)境條件的干擾會改變這一比值。由圖3分析可知，隨著生育進程的推進，滇重樓根莖內(nèi)的碳氮比明顯升高，在滇重樓根莖衰老期，根莖內(nèi)的碳氮比值迅速升高，這說明經(jīng)初級代謝提供給植物的有效成分所有增加，這有利于根莖的分化和形成。在果熟期和衰老期接種Gd(易誤巨孢囊霉)、Gm(球狀巨孢囊霉)、Gr(玫瑰紅巨孢囊霉)、Cc(近明球囊霉)和Afo(孔窩無梗囊霉)均增加了滇重樓根莖內(nèi)的碳氮比，方差分析可知，Gd、Gm、Gr、Cc和Afo處理與與CK間差異顯著。

圖3 接種不同AMF對滇重樓碳氮比的影響Fig.3 Effects of different AMF on C/N in P.polyphylla var.yunnanensis

3 討論

多糖作為高等植物的光合產(chǎn)物以及碳水化合物代謝和暫時貯藏的形式，在植物體內(nèi)碳代謝中占有重要的位置，鐵皮石斛培苗組接種菌根真菌Mycenasp.移栽19個月后，其莖內(nèi)的多糖積累和多糖化學(xué)性質(zhì)形成的時間有所延長，隨著生育進程的推進，菌根組的多糖含量始終低于對照組[10]；于5.0 mg·L-1硝酸鑭水平下接種菌根真菌能促進鐵皮石斛幼苗多糖的合成[11]，提高石斛根莖內(nèi)的多糖含量[12]，Mycenasp.與金釵石斛無菌苗共生培養(yǎng)能夠提高其多糖含量[13]；本研究發(fā)現(xiàn)，滇重樓接種AMF后，只有5個AMF(Gg、Gr、Dh、Rfu和Cc)可以顯著提高滇重樓根莖內(nèi)的多糖含量，從整體趨勢上看，上述5個AMF對果熟期內(nèi)多糖含量的調(diào)控效果要好于衰老期，這與前人的研究結(jié)果既有相同之處也有不同之處，這說明AMF對藥用植物的調(diào)控效果主要受其自身的遺傳特性和生育期的影響。

氨基酸作為蛋白質(zhì)等含氮化合物分解與合成過程的中介物質(zhì)，其含量變化可以反映植物體內(nèi)的氮素代謝變化情況，因此可用氨基酸來反映植株體內(nèi)氮代謝狀況。Dixon等[14]認為接種菌根會導(dǎo)致植物根系對土壤中氨基酸吸收的減少，進而降低植物體內(nèi)的氨基酸含量，但Azaizeh等[15]卻認為接種菌根不會對根分泌物的質(zhì)與量產(chǎn)生任何影響，外源接種AMF可以促進玉米根部所有氨基酸和總氨基酸含量的增加[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在果熟期和衰老期接種Sca、Sdi、Spe、Dh、Ale和At 等13種AMF均不同程度地增加了根莖內(nèi)的總氨基酸含量，這說明接種上述AMF有利于滇重樓根莖內(nèi)總氨基酸的積累?？梢?，并非所有的AMF都能促進藥用植物體內(nèi)多糖和總氨基酸的積累，而多糖和總氨基酸作為藥用植物的主要活性成分，其含量的增加有利于改善藥用價值[17]，故可以使用多糖和總氨基酸來作為篩選AMF的依據(jù)之一。碳氮代謝作為植物體內(nèi)的兩大主要代謝過程，其代謝強度以及二者的協(xié)調(diào)程度變化情況不僅會影響植物生長發(fā)育進程，而且還會影響植物產(chǎn)量的高低和品質(zhì)的優(yōu)劣。本研究結(jié)果表明，隨著生育進程的推進，滇重樓根莖內(nèi)的碳氮比明顯升高，植物體內(nèi)碳氮比的增加說明植物的初生和次生代謝產(chǎn)物的資源分配發(fā)生了改變，進而使植物葉片的營養(yǎng)物質(zhì)及次生抗性物質(zhì)含量等發(fā)生變化。在滇重樓根莖衰老期，根莖內(nèi)的碳氮比值迅速升高，這說明經(jīng)初級代謝提供給植物的有效成分所有增加有利于根莖的分化和形成，以及藥用價值的改善。

4 結(jié)論

外源接種AMF可以不同程度地影響滇重樓根莖內(nèi)的多糖和總氨基酸含量，隨著生育進程的推進，滇重樓根莖內(nèi)的多糖含量逐漸升高，而總氨基酸含量逐漸降低，其中，雙紫盾巨孢囊霉(Sdi)和異配盾孢囊霉(Dh)均顯著促進了滇重樓根莖內(nèi)的多糖和總氨基酸含量，故建議滇重樓種子共生萌發(fā)時接種Sdi和Dh較為適宜。