相孟達(dá)，嚴(yán) 潔，李 玉，鄧 偉，聶雪婷，湯曉辛

(1.貴州師范大學(xué) 西南喀斯特山地生物多樣性保護(hù)國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)550001；2.貴州師范大學(xué) 貴州省植物生理與發(fā)育調(diào)控實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)550001；3.貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550001)

日本蛇根草(Ophiorrhizajaponica)，茜草科蛇根草屬植物，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較低，廣泛分布于廣西、貴州、云南等地[1]。通過(guò)超聲波提取技術(shù)、超臨界流體萃取等中藥提取新技術(shù)[2]，可有效地從中提取出喜樹堿等抗癌物質(zhì)[3]，具有較高的開發(fā)價(jià)值。探索影響日本蛇根草繁殖方式的因素，有利于合理開發(fā)該種植物。

野生植物的進(jìn)化過(guò)程是不斷適應(yīng)環(huán)境，完成生存繁衍的過(guò)程，被子植物長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的花多樣性[4]，其不同的結(jié)構(gòu)與功能在對(duì)植物生殖過(guò)程不同階段產(chǎn)生不同程度的影響，被認(rèn)為是被子植物進(jìn)化成功的原因之一[5]。

某些植物在長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中形成特殊花部結(jié)構(gòu)或附屬物[6-7]，通過(guò)特化的結(jié)構(gòu)提供新的機(jī)會(huì)[5]，從而提高繁殖成功率。一些植物會(huì)使用“傘”或表面疏水性結(jié)構(gòu)保護(hù)花粉不被打濕[8]。在武漢地區(qū)進(jìn)行的植物花粉保護(hù)結(jié)構(gòu)對(duì)植物生殖影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，具有花粉保護(hù)結(jié)構(gòu)的植物通過(guò)隔離花粉與外部雨水影響花粉活力[9]；松香科植物花瓣上伴有附屬物，能分泌油脂，散發(fā)氣味吸引傳粉者[10]；眉蘭屬唇瓣形態(tài)與雌性泥蜂相似，具長(zhǎng)紅毛，能分泌特殊氣味吸引雄蜂進(jìn)行假交配而達(dá)到傳粉目的[11]；毛茛科植物二唇形花瓣使蜜腺隱藏更深，增加傳粉者取食難度，延長(zhǎng)傳粉者的停留時(shí)間從而提高傳粉效率[12]。

在前期進(jìn)行日本蛇根草傳粉實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)柱型花筒內(nèi)具有橫生較長(zhǎng)的白色絨毛覆于花藥上方，短柱花則無(wú)。對(duì)于這種附屬于花瓣的特殊結(jié)構(gòu)對(duì)植物生殖過(guò)程的影響，目前國(guó)內(nèi)外研究較少。為進(jìn)一步探究該絨毛結(jié)構(gòu)在日本蛇根草繁殖過(guò)程中發(fā)揮的作用，我們進(jìn)行了針對(duì)性的試驗(yàn)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 研究物種與試驗(yàn)地點(diǎn)

日本蛇根草是一種多年生草本植物，常生于常綠闊葉林下的溝谷沃土，花期冬春，花二型，花柱異長(zhǎng)(圖1)。其中長(zhǎng)柱型花筒內(nèi)部有一圈橫生且較長(zhǎng)的白色絨毛，且絨毛恰好覆于雄蕊上方，而短柱型則無(wú)白色絨毛(圖2)。試驗(yàn)時(shí)間為2020年1月，地點(diǎn)位于中國(guó)西南部施秉縣黑沖地區(qū)施秉云臺(tái)山(108°7′E，27°9′N)。

圖1 日本蛇根草不同柱型花朵A為長(zhǎng)柱型，B為短柱型Fig.1 Flowers of different style types in O.japonica.A is long style type,B is short style type

圖2 日本蛇根草長(zhǎng)柱型、短柱型花及結(jié)構(gòu)Fig.2 Long style and short style flowers of O.japonica and their structures注：A、B為長(zhǎng)柱型；C、D為短柱型

2 試驗(yàn)方法

2.1 前期處理

在實(shí)驗(yàn)開始前選擇大量即將開放的長(zhǎng)短柱型花苞，套袋后用掛牌做上標(biāo)記，記錄日期等，以備后期各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 植物性狀測(cè)量

采用卷尺和游標(biāo)卡尺測(cè)定了蛇根草兩種不同柱型的主要植物性狀，例如株高、葉片長(zhǎng)寬、花筒深度、花筒直徑、花朵長(zhǎng)寬、花朵開口長(zhǎng)和寬、花瓣長(zhǎng)和寬、雄蕊長(zhǎng)度、雌蕊長(zhǎng)度，花藥的長(zhǎng)、寬、厚，柱頭的長(zhǎng)、寬、厚等。測(cè)定樣本為60個(gè)(長(zhǎng)柱型和短柱型各30個(gè))。

2.3 不同柱型花朵對(duì)自然溫度變化響應(yīng)

先將部分長(zhǎng)柱型花筒中的長(zhǎng)絨毛利用解剖針小心去除，做上標(biāo)記，再將同區(qū)域未做處理的長(zhǎng)柱型和短柱型做上標(biāo)記(圖3)。然后利用熱成像儀(FLIR T650sc)連續(xù)5天于上午11～12時(shí)左右，分別對(duì)去除絨毛長(zhǎng)柱型花、未處理長(zhǎng)柱型花、短柱型花進(jìn)行熱成像拍攝。拍攝得到的照片用FLIR Tools處理。

圖3 A為未處理長(zhǎng)柱型，B為去除絨毛后長(zhǎng)柱型Fig.3 A is the untreated long style type,B is the long style type after removing the pubescence

2.4 不同柱型繁育系統(tǒng)研究

2.4.1 花粉活力測(cè)定

采用TTC染色法進(jìn)行花粉活力的測(cè)定[13]。(1)配制磷酸緩沖液：取0.78025 g的NaH2PO4·2H2O溶于50 ml雙蒸水中配成溶液甲；取1.791 g的Na2HPO4·12H2O溶于50 ml雙蒸水中配成溶液乙。取19.5 ml溶液甲和30.5 ml溶液乙混合即成。(2)不同濃度TTC溶液配制。0.1%TTC溶液：稱取0.01 g氯化四唑粉劑溶解于10 ml磷酸緩沖溶液，其他濃度TTC溶液均按此法根據(jù)不同比例配制。選用0.5%的TTC溶液對(duì)開放第一天至第六天的不同柱型的花粉進(jìn)行染色。不同開放天數(shù)每種柱型均采取10～15個(gè)樣本，取下花藥，常溫下遮光染色12 h，并置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察(染上紅色的花粉即為有活力花粉)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中紅色花粉比例，每個(gè)樣本統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野。

2.4.2 柱頭可授性檢測(cè)

做花粉活力測(cè)定的同時(shí)，用鑷子取下柱頭，通過(guò)聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法進(jìn)行不同柱型的柱頭可授性檢測(cè)[14]。從之前標(biāo)記的花苞中選取不同開放天數(shù)的花朵，從開放第一天至開放第六天的長(zhǎng)短柱型花中均選取15～20朵，取下新鮮柱頭，置于載玻片，滴上一定量聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫溶液，置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察，有氣泡連續(xù)冒出，則視為柱頭有活性。

2.4.3 浸水不同時(shí)長(zhǎng)花粉活力測(cè)定

采同開放時(shí)期的長(zhǎng)短柱型花，取花藥，分別在蒸餾水中浸泡2 h、3 h、4 h，再分別用0.5%TTC溶液進(jìn)行染色(樣本量及染色方法、統(tǒng)計(jì)方法與上文同)。

2.4.4 不同柱型自交親和性

2018年冬至2019年春，曾在同區(qū)域進(jìn)行日本蛇根草的傳粉生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)不同柱型的日本蛇根草進(jìn)行過(guò)人工授粉，包括自然(除吊牌標(biāo)記外，不做其他處理)，自交(用之前標(biāo)記的套袋里的花做自交授粉處理，再將套袋套回，掛上吊牌)等。

2.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)均用IBM SPSS Statistics 22進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤的差異性比較分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 植物性狀

如表1所示，長(zhǎng)柱花和短柱花的花筒直徑呈顯著性差異，雄蕊長(zhǎng)度、雌蕊長(zhǎng)度呈顯著性差異，花藥長(zhǎng)、寬、厚，柱頭長(zhǎng)、寬、厚呈顯著性差異，其余各項(xiàng)植物性狀差異不顯著(表1)。

表1 日本蛇根草植物性狀Table 1 plant traits of O.japonica

3.2 不同柱型花冠筒區(qū)域溫度變化

連續(xù)5天在同區(qū)域同時(shí)段對(duì)長(zhǎng)柱花朵、短柱花朵、去絨毛長(zhǎng)柱花朵進(jìn)行熱成像拍攝，同時(shí)對(duì)長(zhǎng)柱花、短柱花、去除絨毛后長(zhǎng)柱花的溫度進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果表明，長(zhǎng)柱花花筒區(qū)域溫度連續(xù)5天內(nèi)均高于去除絨毛后長(zhǎng)柱花花筒區(qū)域溫度，且差異性顯著；長(zhǎng)柱花與短柱花相比，在第3天，短柱型花筒區(qū)域溫度高于長(zhǎng)柱型，差異顯著，第4天，短柱型稍高于長(zhǎng)柱型，差異不顯著，其余時(shí)間則為長(zhǎng)柱型高于短柱型且差異顯著(圖4)。

圖4 長(zhǎng)短柱型及去絨毛長(zhǎng)柱型花筒區(qū)域熱成像溫度變化圖(僅組內(nèi)比較分析)Fig.4 Thermal imaging temperature variation of long and short style and Long style with pubescence removed(intra group comparison analysis only)

3.3 兩種柱型花粉活力

研究結(jié)果表明，長(zhǎng)柱型和短柱型花粉均在花朵開放第2天時(shí)活力最強(qiáng)，但無(wú)顯著性差異。長(zhǎng)柱型從花朵開放第5天往后，花粉活力急劇下降，而短柱型則從第3天開始花粉活力就急劇下降。長(zhǎng)柱型花粉活力整體趨勢(shì)高于短柱型，從第3天開始兩者花粉活力呈現(xiàn)顯著性差異(圖5)。

3.4 兩種柱型柱頭可授性變化

結(jié)果顯示，從開放第1天至第3天長(zhǎng)短柱花的所有柱頭均具有可授性，但從第3天起，長(zhǎng)短柱型的柱頭可授性均開始下降(圖6)。

3.5 浸水不同時(shí)長(zhǎng)花粉活力變化

結(jié)果顯示，浸水2 h后長(zhǎng)短柱型花粉活力相近，無(wú)顯著性差異；浸水3 h后，長(zhǎng)柱型花粉活力仍較強(qiáng)，短柱花花粉活力則急劇下降，呈現(xiàn)顯著性差異；浸水4 h后，長(zhǎng)短柱型花粉活力均較弱，下降至20%以下，呈現(xiàn)顯著性差異(圖7)。

3.6 兩種柱型不同授粉處理結(jié)果

根據(jù)日本蛇根草傳粉生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在自然狀態(tài)下和人工控制進(jìn)行自交情況下，長(zhǎng)柱型的自然和自交處理所得種子數(shù)均顯著高于短柱型(圖8)。

圖5 長(zhǎng)柱型、短柱型花粉活力變化Fig.5 Changes of pollen vitality of long and short style type

圖6 不同柱型日本蛇根草柱頭可授性變化Fig.6 Changes in stigma receptivity of O.japonica with different style types

圖7 不同柱型花粉浸水不同時(shí)長(zhǎng)后花粉活力變化Fig.7 Changes of pollen viability of different style types pollen after soaking for different time

圖8 不同柱型日本蛇根草不同授粉處理種子數(shù)Fig.8 The number of seeds obtained by different pollination treatments with different style types

4 討論

植物特殊花部結(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)植物生殖過(guò)程產(chǎn)生影響[10]。研究表明日本蛇根草花柱異長(zhǎng)，長(zhǎng)短柱兩種類型的花筒直徑，柱頭和花藥長(zhǎng)、寬、厚有顯著性差異，長(zhǎng)柱型花筒內(nèi)具白色絨毛，短柱型無(wú)，其余花部形態(tài)特征均無(wú)顯著性差異，能對(duì)日本蛇根草生殖過(guò)程產(chǎn)生影響的花部特征，可能為花柱長(zhǎng)短和特殊絨毛的有無(wú)。

生長(zhǎng)溫度對(duì)花粉活力產(chǎn)生較大的影響[15],生長(zhǎng)在適溫下的花粉活力高[16-17]。這在進(jìn)行花粉活力測(cè)定時(shí)得到證實(shí)，長(zhǎng)柱型花粉活力總體較高，短柱型活力較低，而且長(zhǎng)柱型的較高的花粉活力能維持相當(dāng)一段時(shí)間。熱成像儀檢測(cè)溫度變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)柱型的絨毛結(jié)構(gòu)具有保溫作用，結(jié)合試驗(yàn)的時(shí)間是在1月份，溫度較低，這一結(jié)果也說(shuō)明絨毛保溫作用對(duì)花粉的保護(hù)。

花粉浸水實(shí)驗(yàn)顯示出長(zhǎng)柱型花粉具有較強(qiáng)的耐水性，該現(xiàn)象似乎與前人研究中關(guān)于“具有保護(hù)結(jié)構(gòu)的花粉耐水性較弱”的結(jié)論相反[9]，然而這是可以解釋的，在成功授粉前許多因素會(huì)影響花粉命運(yùn)[18]：首先是花粉的移出，長(zhǎng)柱型花藥包裹在花筒中，一定程度上影響了花粉被傳粉者移出，降低了繁殖成功概率，因此長(zhǎng)柱型耐水性較高可減小此結(jié)構(gòu)負(fù)面效應(yīng)；其次是花粉的落置和花粉管的萌發(fā)，大多數(shù)的自交不親和機(jī)制不能防止植物的花粉落到自己的柱頭上[19]。有多項(xiàng)研究表明，自花粉在堵塞柱頭或以其他方式干擾異交花粉時(shí)，會(huì)對(duì)適應(yīng)度產(chǎn)生負(fù)面影響[20-22]，植物防止自交的一種常見方式是在同一朵花中通過(guò)時(shí)間和空間分離花粉和柱頭[19]。在自交親和性實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)柱型自交親和性顯著高于短柱型。日本蛇根草開放第一天即具有較高的花粉活力和柱頭可授性，在時(shí)間上的分離不太明顯，而長(zhǎng)柱型的絨毛結(jié)構(gòu)則在空間上實(shí)現(xiàn)了分離(圖5和圖6)，因此也可以看出長(zhǎng)柱型抵消自交親和性高的負(fù)面效應(yīng)的進(jìn)化特征，短柱型無(wú)此結(jié)構(gòu)則花粉更容易落至自己柱頭(圖2)，所以短柱型具有自交親和性較低的進(jìn)化特征。

試驗(yàn)在驗(yàn)證日本蛇根草(長(zhǎng)柱型)絨毛結(jié)構(gòu)對(duì)其生殖方面影響的同時(shí)，也為探索花部特征進(jìn)化的動(dòng)力提供了一些證據(jù)?；ú刻卣鞯乃茉煊缮锖头巧镆蛩毓餐瓿?，在前人進(jìn)行的研究中認(rèn)為傳粉者介導(dǎo)的選擇，推動(dòng)了花部特征多樣化和相關(guān)特征共同進(jìn)化[23-28]，特化的植物中，這種作用表現(xiàn)的更加明顯。但傳粉者介導(dǎo)的特征選擇不能解釋所有的花部特征分化[29]，植物對(duì)一些非生物因素的適應(yīng)，如干旱[30]、溫度[31]、水[32]等，同樣介導(dǎo)了花部特征的分化。而花部特征的分化，特別是一些較為特殊的花部結(jié)構(gòu)，又通過(guò)在植物生殖過(guò)程的不同階段或不同方面發(fā)揮作用，影響植物的繁殖以及演化方向。從試驗(yàn)結(jié)果看，長(zhǎng)柱型日本蛇根草的絨毛結(jié)構(gòu)具保溫作用，從而影響植物花粉活力，使長(zhǎng)柱型蛇根草的花粉活力高于短柱型；長(zhǎng)柱型花粉的耐水性強(qiáng)于短柱型；而且其自然、自交的繁殖成功率也顯著高于短柱型。這些證據(jù)不僅有助于植物繁殖與進(jìn)化的研究，也為日本蛇根草的保護(hù)與開發(fā)提供了重要的理論參考。