周 瑞,陳舜勝

(上海海洋大學食品學院,上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海201306)

膠原蛋白又稱膠原(Collagen),是很多動物體內含量最豐富、分布最廣的一種糖蛋白[1],約占體內蛋白質總量的25%—30%,作為一種緊密有序的細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)[2],它是由三個多肽鏈扭曲在一起形成三螺旋結構[3](圖1)。目前,已知的膠原蛋白類型達到了29 種[4],其中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型是最主要類型[5]。Ⅰ型主要在骨骼、真皮、肌腱、韌帶、角膜中,占全部膠原蛋白含量的90%左右,在日常生活中最為常見[6];II 型主要在軟骨組織中;III 型在肺、肝、脾臟中,目前在水產品中尚未發(fā)現(xiàn)。

豬、牛皮骨中提取的膠原蛋白因為瘋牛病(BSE)、口蹄疫(FMD)等牲畜疾病的暴發(fā),引起了人們對膠原蛋白來源的擔憂,從魚皮、魚鱗等水產品副產物提取的膠原蛋白成為一個很好的代替來源[7]。研究魚皮膠原蛋白并加工利用,可以提高魚類加工的附加值,同時達到保護環(huán)境的效果。

圖1 膠原蛋白的三螺旋結構[3]Fig.1 Triple-helical structure of collagen[3]

1 魚皮膠原蛋白的制備

魚皮膠原蛋白的制備過程包括除雜、除脂、除雜蛋白,膠原蛋白析出、純化等。

1.1 魚皮的預處理

魚皮中的其他物質會影響膠原提取率和膠原純度,需對魚皮進行預處理。步驟一般為:去除雜質、蒸餾水沖洗→將魚皮剪成一定規(guī)格→加入0.1 mol∕L NaOH 或NaCl 溶液攪拌浸泡24 h(除去魚皮的色素、肌原纖維等非膠原蛋白,同時使魚皮軟化)→加入10%有機試劑攪拌浸泡24 h(除去脂肪)[1]。使用NaOH浸泡還可達到殺菌除酶,精制膠原蛋白的效果[8]。

1.2 魚皮膠原蛋白的提取

提取膠原蛋白的原理是把膠原蛋白從其他成分中分離出來。通常是依據(jù)膠原蛋白的特性,采用物理-機械方法或加入某種化學試劑來改變魚皮膠原蛋白的存在環(huán)境,使膠原蛋白與其他成分分離并進行提純達到提取效果。根據(jù)提取介質的不同分為以下幾種。

1.2.1 熱水提取法

熱水提取法可提取水溶性膠原蛋白(Hot water-soluble collagen,HEC)。魚皮預處理后,用熱水直接提取膠原蛋白,溫度過高時膠原蛋白沒有明顯的網狀結構、發(fā)生變性和交聯(lián);溫度過低則提取速率慢[9],常使用的溫度有100 ℃、60—70 ℃、40—42 ℃、45 ℃,熱水法得到的膠原蛋白被稱為明膠(Gelatin)[10]。明膠不具備膠原蛋白初始功能,分子量遍布范圍廣,雜亂難確定,在食品領域制作膠凍食品價值較高。

郝淑賢等[11]用3 種提取方法提取羅非魚皮膠原蛋白,并比較不同方法提取的膠原蛋白理化特性,研究發(fā)現(xiàn)熱水提取法得到膠原凝膠強度較大。因此,可以根據(jù)需要,選用熱水法提取,使用試劑少,且凝膠強度大,為制作膠凍食品提供參考;Supatra 等[12]研究了不同提取溫度(45—75 ℃)對明膠的特性和凝膠性能的影響,發(fā)現(xiàn)55 ℃時提取的明膠凝膠強度最大,同時還發(fā)現(xiàn)溫度升高時,明膠的顏色逐漸變淡,不同溫度得到的產物在掃描電子顯微鏡下顯示有所不同。溫度對于提取膠原蛋白的影響,通常是破壞膠原蛋白三螺旋結構,進而影響性質。

1.2.2 酸提取法

酸提取法是提取酸溶性膠原蛋白(Acid-soluble collagen,ASC),利用低濃度酸溶液破壞Schiff 鍵和離子鍵,使沒有交聯(lián)的膠原蛋白和含有醛胺類交聯(lián)鍵的膠原蛋白溶出。該方法對膠原蛋白的交聯(lián)鍵破壞程度小,保持膠原蛋白的結構的完整,因此膠原蛋白中的β 和γ 大分子鏈較多,交聯(lián)程度高的成分較多。酸提取中使用的酸有甲酸、乙酸、乳酸和檸檬酸等,其中最常使用的為乙酸[13]。

劉焱等[14]用4 種方法從魚皮中提取膠原蛋白,提取率為酸法＞酶法＞堿法＞水法,其中傅里葉紅外光譜顯示除了堿法提取的膠原外均符合膠原特征吸收峰。陳麗麗等[15]用乙酸、乳酸、檸檬酸研究鮰魚皮膠原的提取工藝,顯示膠原蛋白提取率影響程度依次為乙酸＞乳酸＞檸檬酸,乙酸提取鮰魚皮膠原提取率達38.44%。Tan 等[16]用三種酸法提取膠原蛋白,顯示酸法提取和均質化輔助酸法提取的凝膠性高于酸輔酶提取,均質化輔助酸法提取可以應用于工業(yè)上提高膠原蛋白得率。淑英等[17]以鱈魚魚皮作為研究材料,考察不同酸類型、酸濃度、提取時間及料液比對膠原蛋白提取率的影響,應用響應面法得到優(yōu)化提取工藝。總的來說,酸的濃度、種類、提取時間和料液比均是提取過程中影響提取率的因素。

1.2.3 堿提取法

堿提取法是利用強堿或強堿鹽將膠原蛋白肽鍵水解,最終得到膠原蛋白。膠原蛋白三股螺旋結構被破壞,酰胺鍵水解斷裂,會徹底破壞含硫和含羥基的半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸,甚至會產生有致癌、致畸和致突變作用的D 型氨基酸。

Yoshimura 等[18]提取堿溶性膠原蛋白,用含有10% NaCl 的0.5 mol∕L NaOH 在4 ℃下提取20—30 d,提取的膠原大部分由α1 和α2 鏈組成。顧楊娟[19]提取魚膠原蛋白,采用酸法、堿法、酶法3 種方法,得出采用酶法提取出的膠原蛋白提取率最高,而堿法提取膠原蛋白的提取率低、凍力小。

1.2.4 酶提取法

酶提法從魚皮中提取酶溶性膠原蛋白(Pepsin-solubilized collagen,PSC),是利用蛋白酶選擇性的切除非螺旋的肽端而不影響三螺旋結構的情況下分離出膠原蛋白,常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、堿性蛋白酶和復合蛋白酶等[13]。

Liu 等[20]、Kaewdang 等[21]證明用蛋白酶提取的膠原蛋白三螺旋結構是完整的;Woo 等[22]對黃鰭金槍魚背皮提取膠原的條件進行優(yōu)化,確定了最佳酶解條件為加入0.98%(W∕V)胃蛋白酶浸提23.5 h;Tao等[23]用響應面法優(yōu)化金槍魚皮膠原蛋白提取,提取條件影響程度依次為料液比＞酶量＞提取時間;張培等[24]研究了從金槍魚內臟中提取的酶提取羅非魚魚鱗膠原蛋白的提取率小于使用胃蛋白酶的提取率,表明影響提取率的因素還包括酶的種類。廖偉等[25]采用酶法提取尖吻鱸魚鱗和魚皮的膠原蛋白,每100 g魚皮和魚鱗的膠原蛋白提取量分別為47.3 g、2.3 g,結果顯示魚皮相對魚鱗是更好的膠原蛋白來源。酶的作用受溫度影響,當溫度過低時提取速率慢,過高時酶失活或膠原變性[8],有研究顯示多種酶的使用也會提高提取效果?？偟膩碚f,影響提取效果的因素不僅與膠原蛋白來源有關,也與所使酶的種類、料液比、酶量、提取時間有關。

1.2.5 復合提取法

許多學者在實際提取膠原蛋白時,為了提高膠原蛋白提取率、提高提取速度或者保留膠原的某種特性同時簡化提取過程等,采用多種方法復合提取,如酸酶復合法、酶與熱水復合法、酶酶復合法等,也會加入超聲波輔助提取(Ultrasonic-assisted extraction,UAE)、均質化輔助提取(Homogenization)、擠壓等處理方法(表1)。

表1 魚皮膠原蛋白常用的復合提取技術Table 1 Commonly used composite extraction technology for fish skin collagen

1.2.6 常規(guī)提取方法的比較

表2 對比分析了魚皮膠原蛋白4 種常規(guī)提取方法的優(yōu)缺點。在膠原蛋白的提取中,酶提是比較有效的提取方法。在實際應用過程中,根據(jù)所需產物特性要求,也會選擇相應的提取方法,例如即食食品,更青睞熱水提取。

表2 魚皮膠原蛋白不同提取方法的比較Table 2 Comparison of different extraction methods of fish skin collagen

1.3 魚皮膠原蛋白的分離純化

膠原蛋白屬于大分子蛋白,主要使用鹽析、透析、離心、電泳、色譜法和離子交換層析等方法達到分離純化目的[31]。鹽析是最簡單、最常用的一種分離手段,鹽一般使用NaCl 或(NH4)2SO4,主要包括三種方式,即:加入NaCl 固體、加入高濃度的鹽溶液、用高濃度鹽溶液透析,通常在不同的等電點和不同的鹽濃度下膠原蛋白的溶解度不同,鹽析法可以實現(xiàn)不同類型膠原蛋白的分離。因為鹽析得到的膠原蛋白純度不高和膠原蛋白的復雜性,一般一種方法達不到分離純化的效果,試驗過程中需要進一步采用離子交換、高效液相等色譜技術幾種方法聯(lián)合使用和達到分離純化,獲得精制膠原蛋白的目的[32]。根據(jù)所需產物的特性性質,選用特定的純化方法或者利用粗提取液制作產品。

1.4 魚皮膠原蛋白的脫腥

從豬、牛皮骨等中提取的陸生性膠原蛋白通常無異味,從魚皮、魚鱗中提取的膠原蛋白,因為魚皮中攜帶的魚腥味以及提取過程(特別是酶解過程)較難控制,通常使提取液具有不良風味,嚴重制約魚皮膠原蛋白在功能性食品方面的開發(fā)及應用[33],故在制備膠原蛋白提取液時需考慮脫腥,尤其是直接利用粗提液時。常用的脫腥方法包括物理、化學和生物三種方法[34],物理方法包括通過添加呈味物質的掩蓋法、利用環(huán)糊精分子的環(huán)狀結構的包埋法、利用活性炭等吸附劑的吸附法、微膠囊法和減壓蒸餾法等[35-36];化學方法包括酸堿處理法、有機溶劑處理、抗氧化劑法、臭氧處理法,利用乙醇、碳酸氫鈉、檸檬酸、茶葉中的茶多酚[37]等對原材料進行浸泡去腥后提取,也有研究應用美拉德反應脫除酶解液腥味[38];生物方法是通過利用微生物本身新陳代謝產物的掩蓋作用或者使腥味物質和微生物產生反應生成無腥味物質來達到脫腥效果[39]。經過脫腥效果得到酶提液、酸提液、水提液等粗提液。根據(jù)所需產物特性進行相應處理,尤其在利用魚皮副產物提取膠原蛋白制作魚凍等可食用食品時,采用無害快速有效的去腥方法是值得研究的一個問題。

2 膠原蛋白在食品中的應用

在食品領域,膠原蛋白具有低免疫原性、成膜性好、良好生物相容性等,使膠原蛋白在保健食品、食品添加劑、食品包裝中得到很好的應用。

2.1 膠原蛋白在保健食品中的應用

補鈣,增強鈣吸收能力。膠原蛋白中含有賴氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和組氨酸等必需的氨基酸,其中膠原蛋白特征氨基酸羥脯氨酸有將血漿中的鈣運輸?shù)焦羌毎淖饔?羥脯氨酸越多,鈣的補充速度越快。Mizuno 等[40]研究發(fā)現(xiàn),骨髓細胞是多能細胞,骨髓細胞在I 型膠原蛋白凝膠培養(yǎng)時,顯示出較高的活性,說明I 型膠原蛋白能誘導骨髓細胞成骨細胞分化。Yuan 等[41]研究了用酶水解得到膠原蛋白之后,發(fā)現(xiàn)膠原蛋白具有高的鈣結合性,主要是因為氨基的氮和羧基的氧是Ca2+的主要結合位點。

預防疾病,增強免疫力。王毅虎等[42]給小鼠喂食膠原粉30 d 后對其進行測試,結果表明,所用的膠原粉能顯著提高小鼠的免疫力。耿黎明等[43]把高膽固醇患者分成2 組,每組60 人,分別口服膠原蛋白和辛伐他汀,結果表明,膠原蛋白能輔助提高藥物降血脂的作用。并可補充體內某些缺乏的必需微量元素,從而使其維持在一個相對正常的范圍內,是一種理想的減肥降血脂食品[44]。此外,Rafat[45]開發(fā)了膠原蛋白-殼聚糖復合水凝膠作為角膜植入,研究顯示膠原蛋白能夠提高角膜上皮細胞的修復能力和加速細胞生長。膠原蛋白還有加速血紅蛋白和紅細胞生成的功能,改善循環(huán),有利于防治冠心病、缺血性腦病[44]。

在其他特殊保健方面。尹利端等[46]研究表明,膠原蛋白有很強的皮膚鎖水功能,且對人體健康無害;膠原蛋白還具有抑制胃酸和胃原酶的分泌,減輕由胃酸分泌過多帶來的不適[47],減輕胃潰瘍患者的疼痛感,促進胃潰瘍愈合[48]。據(jù)報道,膠原蛋白可協(xié)助機體排出鋁元素,減少鋁在體內的聚積,從而降低某些疾病(如老年癡呆癥)的發(fā)生概率[49]。

2.2 膠原蛋白在食品添加劑中的應用

膠原蛋白作為食品添加劑,既能提高食品的品質,又能補充部分氨基酸(表3)。除了添加少量膠原蛋白,還可使用膠原蛋白提取液制作食品。如李江明等[50]將羅非魚魚鱗膠原蛋白提取液與菠蘿果汁混合,得到了一種營養(yǎng)豐富的膠原蛋白果味飲料。易翠平等[51]以鳡魚副產物為原料,采用提取、調味、成型等工藝開發(fā)出營養(yǎng)與風味俱佳的魚凍產品。

表3 膠原蛋白在食品添加劑中的應用Table 3 Application of collagen in food additives

2.3 膠原蛋白在食品包裝中的應用

膠原蛋白材料具有很強的韌性和優(yōu)良的成膜能力,用做香腸、肉類、魚類等的包裝材料。明膠制成的生物降解膜(可食包裝膜)擁有很好的性能,可以用于保鮮、食品包裝或直接食用,典型的可食膜是人工腸衣[58],膠原腸衣和肉制品收縮率一致且能固定化酶用于改善食品風味和質量。Fadini 等[59]用水解膠原蛋白和可可油在蔗糖塑化條件下制備的可食包裝膜,高濃度的水解膠原蛋白產生的薄膜使得更加均勻,起良好的包裝作用。樊世芳等[60]混合明膠、殼聚糖、蛋白肽后制成膜涂在鯽魚魚片表面,顯示這種涂膜劑能延長魚片在4 ℃環(huán)境下冷藏的貨架期,因為膠原包裝時很好的阻氣、阻油、阻濕等良好特性,減少氧化反應的產生和抑制美拉德反應。

3 結論與展望

制備膠原蛋白過程中,不同提取方法具有不同提取效果,得到的膠原蛋白也存在特性差異。熱水提取法所得膠原凝膠特性最好;酶法提取效果最佳,采用此法提取膠原蛋白成為近幾年的研究熱點,不過酶切位點的不確定性是研究的難點。在研究中也不斷涌現(xiàn)新型提取工藝,多種常規(guī)方法復合、超聲波輔助等。另外,膠原蛋白因其特性應用十分廣泛,有很高的研究價值,但在市場上有不少商家夸大膠原蛋白功效借機謀取暴利。同時研究發(fā)現(xiàn),從魚皮中提取的膠原蛋白應用在食品中有腥味,對熱敏感,加熱時易發(fā)生熱變性,三螺旋結構被破壞,其特性隨之改變。

因此,膠原蛋白的未來研究可著眼于以下6個方面:(1)提高膠原蛋白的應用潛力,明確膠原蛋白對人體的功效及產生功效的機理,從人體細胞學、代謝組學和預防醫(yī)學的角度入手,致力于研發(fā)出魚皮等副產物的高性價比產品;(2)目前,膠原蛋白的稱謂界定不明確,同時膠原蛋白的提取過程、提取率計算有待標準化,從參考文獻看出,不同計算方法下的提取率不具備可比性;(3)提高魚皮膠原蛋白提取分離純化技術和減短提取時間,增加產量,深入研究膠原蛋白肽,基于水產品膠原蛋白熱穩(wěn)定差的研究基礎上,如何增加保護機制,減少溫度的限制;(5)在提取魚皮膠原蛋白過程中,建立對提取液有效脫腥的方法;(6)完善膠原蛋白結構指紋圖譜,為膠原蛋白生產提供有效依據(jù)。