李澤明，黃傳君，徐淑靜，張才擎

（1.山東中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，山東 濟南 250014；2.山東大學 藥學院，山東 濟南 250012；3.山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，山東 濟南 250013）

流行性感冒（Influenza），簡稱為流感（flu），是一種由流感病毒引起的急性呼吸道疾病[1]。流感的主要表現為高熱、頭痛、乏力、咳嗽和全身肌肉酸痛，可有鼻塞、流涕、胸骨后不適等，體溫可達39 ～ 40 ℃。流感病毒容易發(fā)生變異，主要通過飛沫及接觸傳播，傳染性強。潛伏期一般為1 ～ 7 d，多為2 ～ 4 d[2]。流感病毒屬于正粘病毒科，是一種負義單鏈RNA 病毒。流感病毒根據內部核蛋白和基質蛋白抗原屬性不同,可分為4 個亞型，分別為甲型（influenza virus A）、乙型（influenza virus B）、丙型（influenza virus C）、丁型流感病毒 （influenza virus D）[3]。其中甲型和乙型流感病毒呈季節(jié)性流行，據WHO 報道，全球流感流行每年造成約300 萬至500 萬嚴重病例，其中約有29 萬至65 萬死亡病例[4]。目前西醫(yī)治療流感的藥物主要有扎那米韋、磷酸奧司他韋、帕拉米韋和辛酸拉尼米韋。

中醫(yī)藥治療流感具有悠久的歷史，并顯示出廣闊的前景[5]。黃芩-黃連藥對是臨床上典型的清熱解毒藥對之一，前者善清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎，后者長于清中上二焦?jié)駸?。兩藥常相須為用，為臨床常用藥對[6]?；趯ΜF代藥理學的研究，網絡藥理學作為一種新的藥物設計與開發(fā)策略被提出，它是在系統(tǒng)生物學的基礎上，從整體的角度探討“藥物-靶點-疾病”之間的關系，因此對新藥的研發(fā)具有指導意義[7]。它強調了藥物可以通過多途徑調節(jié)信號通路，以提高藥物的療效并降低毒副作用[8]。中醫(yī)藥講究整體觀、辨證論治的原則，這與網絡藥理學所強調的整體性、系統(tǒng)性相一致[9]。因此，在網絡藥理學方法的基礎上，本研究從系統(tǒng)、整體水平分析黃芩-黃連藥對抗流感病毒“多因、多效、多靶點”的作用機制。

1 材料與方法

1.1 黃芩、黃連化學成分收集

利 用TCMSP 數 據 庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和相關文獻對黃芩、黃連的化學成分進行檢索和收集。

1.2 黃芩-黃連藥對作用靶點的篩選

在TCMSP 數據庫中檢索黃芩、黃連的靶點信息，將藥物的類藥性（DL）＞0.18，口服生物利用度（OB）＞30%作為篩選參數。然后利用Uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org/）矯正藥物的靶點名稱，最 后 在Swiss Target Prediction 數 據 庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）中補充藥物的靶點信息從而得到相關靶標蛋白。

1.3 流感作用靶點的獲取

以“Influenza”為關鍵詞在GeneCards 數據庫（https:// www.genecards.org/）中檢索以獲得流感的作用靶點。

1.4 預測黃芩-黃連藥對抗流感的靶點

將黃芩、黃連與流感的靶點分別錄入到Venny在線軟件（版本2.1，https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/ venny/）中，繪制韋恩圖，進而得到黃芩-黃連藥對抗流感的靶點。

1.5 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡構建

運用Cytoscape 軟件（版本3.7.1）對黃芩-黃連藥對的有效活性成分、活性成分調控的靶點、靶點與流感的關聯進行分析來構建“藥物-成分-疾病-靶點”相互作用網絡圖。

1.6 構建蛋白相互作用（PPI）網絡

以minimum required interaction score ＞0.4 為 篩選參數，用STRING 數據庫（https://string-db.org/）檢索上述得到的黃芩-黃連藥對抗流感的潛在靶點，得到靶點相互作用的網絡關系數據，然后將數據導入Cytoscape 軟件中，繪制出蛋白相互作用網絡圖。

1.7 通路富集分析

將Bioconductor 軟 件 包“org.Hs.eg.db” 安 裝在R 軟件（版本3.6.0）中并運行，然后將上述得到的藥物-疾病共同靶點轉換成entrezID。接著將“clusterProfiler”軟件包安裝在R 軟件中，以P ＜ 0.05，Q ＜ 0.05 為參數，利用已轉換的entrezID，進行關鍵靶基因GO（gene ontology）與KEGG（KEGG pathway analysis）功能富集分析，并將結果以條形圖形式輸出。

2 結果

2.1 黃芩-黃連藥對的有效成分

在TCMSP 數據庫中設定DL 0.18、OB 30%，結合文獻[10]補充納入黃芩苷，共得到有效成分49 個。黃芩、黃連有效成分的編號、名稱和藥材歸屬，見表1。其中黃芩中的黃芩新素（neobaicalein）、降穿心蓮黃酮（panicolin）、5,7,4'-三羥基-8-甲氧基黃酮（5,7,4'-trihydroxy-8-methoxyflavanone）、黃芩黃酮II（Skullcapflavone II）、2,6,2',4'-四羥基-6'-甲氧基查爾酮（2,6,2',4'-tetrahydroxy-6'-methoxychaleone）、二氫木蝴蝶素 （dihydrooroxylin），黃連中的黃麻甙A（corchoroside A ）、穆坪馬兜鈴酰胺（moupinamide）、巴馬?。╬almatine）、廣玉蘭內酯（magnograndiolide）等成分具有較高的OB 值，表明在黃芩-黃連藥對抗流感的過程中，這些成分可能發(fā)揮重要作用。

2.2 黃芩-黃連藥對的作用靶點

在UniProt 數據庫中輸入上述得到的49 個有效成分對應的靶點，然后使用Swiss Target Prediction 數據庫補充相應的靶點信息，刪除去重后共得到276 個藥物靶點，含有黃芩186 個，黃連158 個，共同靶點68 個（見圖1）。

2.3 流感的作用靶點

在GeneCards 數據庫中檢索關鍵詞“Influenza”，去重后共得到疾病靶點2 503 個。

2.4 黃芩-黃連藥對抗流感的靶點

將276 個藥物靶點、2 503 個疾病靶點輸入到Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺上，并繪制韋恩圖，兩者取交集后得到藥物-疾病共同靶點123 個（見圖2）。

表1 黃芩-黃連藥對的有效成分Tab.1 Active components of herb pair containing Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma

2.5 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡分析

在Cytoscape 軟件中輸入黃芩-黃連藥對的49 個有效成分與123 個藥物-疾病共同靶點，然后繪制出“藥物-成分-疾病-靶點”相互作用的網絡圖（見圖3）。圖中綠色代表123 個共同靶點，藍色代表中藥黃芩-黃連藥對中的36 種有效成分（13 個有效成分的靶點與疾病靶點無交集），紅色代表疾病，紫色代表藥物。使用Network Analyzer 對網絡圖進行分析發(fā)現：槲皮素（quercetin）、黃芩苷（baicalin）、漢黃芩素（wogonin）、黃芩黃素（baicalein）、β-谷甾醇 （β-sitosterol）、黃連堿（coptisine）、刺槐素（acacetin）、表小檗堿（epiberberine）等能夠連接10個以上的靶點，表明這8 個成分可能在黃芩-黃連藥對抗流感的過程中發(fā)揮重要作用；靶點PTGS2、PTGS1 與活性成分連接次數達30 次以上，對黃芩-黃連藥對抗流感具有重要意義；靶點NOS2、PRSS1的連接次數達20 次以上，靶點ESR1、CASP3 的連接次數達9 次以上，證明它們也可能是黃芩-黃連藥對抗流感過程中的有效靶點。

圖1 藥物靶點分布情況統(tǒng)計圖Fig. 1 Statistical chart of drug target distribution

圖2 黃芩-黃連藥對治療流感靶點韋恩圖Fig. 2 Vene diagram of herb pair containing Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma on influenza target

圖3 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖Fig. 3 “Drug-ingredient-disease-target”network diagram

2.6 蛋白相互作用（PPI）網絡分析

將上述得到的123 個共同靶點輸入到STRING 數據庫中，經過分析得到蛋白相互作用的網絡圖（見圖4）。每條邊代表蛋白與蛋白之間的相互作用關系，線條越多表示關聯度越大，得到PPI 圖中的靶點排序（排名前30 見圖5）。結果顯示，靶點蛋白AKT1、VEGFA、IL6、TNF、CASP3、EGFR、JUN、MYC、CXCL8、MAPK1、CCL2、IL1B、PTGS2、IL10、MMP9、ICAM1、IL2、FN1、FOS、CYCS、ESR1、RELA 的Degree 值大于50（Dgree 值表示活性成分與作用靶點的關聯個數，Degree 值越大表明該靶點越重要），推測這些靶點有助于黃芩-黃連藥對抗流感作用的發(fā)揮。將“藥物-成分-疾病-靶點”網絡中的關鍵作用靶點映射到PPI 網絡中，發(fā)現CASP3、PTGS2、ESR1 等可能是黃芩-黃連藥對的有效成分發(fā)揮抗流感作用的關鍵靶點。

圖4 靶點相互作用PPI 圖Fig. 4 PPI diagram of target interaction

2.7 GO 及KEGG 通路富集分析結果

圖5 PPI 圖中的靶點排序（排名前30）Fig. 5 Target ranking in PPI （top 30）

經R 語言運行后，123 個共同靶點的GO 富集結果包括三部分，分別是生物學過程、細胞組分及分子功能。GO 結果表明，在生物學過程中，共富集了1 800 條交集基因集合，其中，有341 條富集基因的數目大于10個，主要包括response to oxidative stress（氧化應激反應，36 個基因）、response to toxic substance（對有毒物質的反應，35 個基因）、response to molecule of bacterial origin（對細菌來源分子的反應，34 個基因）、reactive oxygen species metabolic process（活性氧代謝過程，29 個基因）、cellular response to drug（細胞對藥物的反應，27 個基因）、regulation of apoptotic signaling pathway（細胞凋亡信號通路的調控，26 個基因）等（見圖6），表明黃芩-黃連藥對可能在多個生物學過程的共同作用下發(fā)揮其抗流感的療效；在細胞組分表達過程中，共富集了52 條交集基因集合，其中，有14 條富集基因數目大于10 個，主要包括membrane raft（膜筏，14 個基因）、membrane microdomain（膜微區(qū)，14 個基因）、membrane region（膜區(qū)，14 個基因）、vesicle lumen（囊腔，12 個基因）等（見圖7）；在與分子功能相關的過程中，共富集了132 個交集基因集合，其中，有17 條富集基因數目大于10 個，主要包括cofactor binding（輔因子結合，19 個基因）、cytokine receptor binding（細胞因子受體結合，18 個基因）、protein heterodimerization activity（蛋白質異二聚活性，16 個基因）、endopeptidase activity（內肽酶活性，14 個基因）、receptor ligand activity（受體配體活性，14 個基因）等（見圖8）。經過R語言運行后，123 個共同靶點共得到158 條KEGG 通路，KEGG 功能富集的條形圖中排名前20 的結果見圖9，其中，P 表示富集的顯著性，顏色越紅說明顯著性越高。結果表明黃芩-黃連藥對治療流感的共同靶點主要涉及Influenza A（甲型流感，27 個基因）、PI3K-Akt signaling pathway （PI3K-Akt 信號通路，22個基因）、MAPK signaling pathway （MAPK 信號通路，19 個基因）、Toll-like receptor signaling pathway （Toll樣受體信號通路，18 個基因）、NOD-like receptor signaling pathway （NOD樣受體信號通路，17個基因）、HIF-1 signaling pathway（HIF-1 信號通路，17 個基因）、NF-kappa B signaling pathway （NF-κB 信號通路，14 個基因）等，表明黃芩-黃連藥對的有效成分可能在多個信號通路的協同分工下發(fā)揮抗流感的作用。

圖6 黃連-黃芩藥對抗流感的GO 富集分析-生物過程Fig. 6 GO enrichment analysis of herb pair containing Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma against influenza-biological process

圖7 黃連-黃芩藥對抗流感的GO 富集分析-細胞組分Fig. 7 GO enrichment analysis of herb pair containing Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma against influenza-cellular component

圖8 黃連-黃芩藥對抗流感的GO 富集分析-分子功能Fig. 8 GO enrichment analysis of herb pair containing Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma against influenza-molecular function

圖9 黃連-黃芩藥對抗流感的KEGG 富集分析Fig. 9 KEGG enrichment analysis of herb pair containing Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma against influenza

3 討論

藥理學研究表明，黃芩中主要含有黃酮類、揮發(fā)油和多糖等成分，具有解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗炎、抗菌、抗氧化及抗腫瘤等藥理作用[11]。生物堿類化合物是黃連的主要成分，此外，黃連中還含有木脂素類、黃酮類等成分[12]，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用[13]。

從黃芩-黃連藥對抗流感的韋恩圖可知，黃芩-黃連藥對中49 個活性成分作用于123 個靶點。主要活性成分包括槲皮素、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、β-谷甾醇、黃連堿、刺槐素、表小檗堿等，目前已有文獻報道了槲皮素、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素等黃酮類化合物治療流感的相關研究。槲皮素可以降低流感病毒感染的小鼠死亡率，抑制病毒復制, 減輕肺部炎癥, 從而對流感病毒感染的小鼠有治療保護作用[14]。黃芩苷可通過下調TLR7/MYD88 介導的信號通路來抑制甲型流感病毒感染的小鼠肺組織的病理損傷和炎癥反應[15]。漢黃芩素可以抑制甲型流感病毒感染后肺泡巨噬細胞內各種炎癥相關因子的產生[16]。黃芩素在體外可能通過干擾流感病毒H1N1中后期mRNA 的合成抑制病毒的復制而具有抗流感病毒活性[17]。且槲皮素屬于黃連成分，黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素屬于黃芩成分，這為兩藥配伍治療流感提供了合理的理論基礎。在細胞水平上，IL6、TNF[18]、CASP3[19]、EGFR[20]、NOS2[21]已 被 證 明 是 流感的主要靶點，提示黃芩-黃連藥對可能是通過這些靶標調節(jié)細胞凋亡，減少病毒復制，抑制流感的疾病進程。此外，還有部分關聯性較高的靶點在目前的研究中還沒有得到明確的證實，如AKT1、ESR1、PTGS2、PTGS1、PRSS1 等，這可以作為解釋黃芩-黃連藥對抗流感分子作用機制的一個新方向。

GO 分析結果表明，抗流感病毒靶點的基因所涉及的生物過程不僅與抗病毒靶點的作用密切相關，而且能夠參與并影響藥物發(fā)揮抗病毒活性的整個藥理過程。進一步分析發(fā)現疾病靶點主要發(fā)生在生物學過程環(huán)節(jié)，如氧化應激反應、對有毒物質的反應、細胞凋亡信號通路的調控等。KEGG 通路富集分析結果顯示，甲型流感、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、Toll 樣受體信號通路、NOD 樣受體信號通路、HIF-1信號通路、NF-κB 信號通路等是黃芩-黃連藥對抗流感的潛在靶點涉及的主要通路。甲型流感病毒傳播迅速、傳染性強且易發(fā)生變異，是流感病毒中最常見的一種類型，而黃芩-黃連藥對靶基因富集通路甲型流感，說明它能夠有效治療流感。PI3K/AKT 信號通路可以通過凋亡信號調節(jié)激酶1（ASK1）負調控c-Jun 氨基末端激酶（JNK）通路抑制甲型流感病毒誘導的Bax 介導的細胞凋亡[22]。p38 MARK、JNK MARK 等通路屬于MAPK 家族，它們在炎癥介質的調控過程中起著重要的作用，與流感的治療也有密切的聯系[23]。TOLL 樣受體和NOD 樣受體為模式識別受體，與流感病毒相關的信號通路主要集中在TLR4和TLR7[24]及NLR3 亞型中[25]。HIF-1 信號通路與重癥流感患者密切相關[26]。NF-κB 信號通路是流感病毒感染后激活的一個重要的細胞通路，它可以不同程度的調節(jié)病毒RNA 的合成，促進病毒的復制[27]。由此可以推測，有多條信號通路與黃芩-黃連藥對抗流感的作用機制有關。

4 結論

本研究在網絡藥理學及相關文獻研究的基礎上，對黃芩-黃連藥對抗流感的主要成分和潛在靶點進行了預測，最終發(fā)現49 個活性成分，123 個潛在靶點。根據通路富集分析的結果可推測黃芩-黃連藥對發(fā)揮其抗流感作用的藥效基礎主要集中在甲型流感、PI3K-Akt 信號通路和MAPK 信號通路上。因此，本研究初步證明了黃芩-黃連藥對可以在多成分、多靶點、多通路共同作用下起到抗流感的效果，但作為作用機制的理論探討，后續(xù)還需利用動物實驗進行驗證。