張 靜，柳 舒，黃吉成，岳占碰，楊占清，郭 斌

(吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

鹿茸角是哺乳動物唯一失去后可完全再生的附屬器官，可年周期性的脫落和再生。在快速生長期，鹿茸角的生長速度遠(yuǎn)超過癌細(xì)胞的增殖速度，可達(dá)2.75 cm/d，但卻能精確調(diào)控而不發(fā)生癌變，因此是研究創(chuàng)傷修復(fù)及器官再生的理想動物模型[1]。在鹿茸角生長過程中，各種細(xì)胞不斷增殖與分化，處在一個動態(tài)平衡中，維持著鹿茸角的生長發(fā)育[2]。

YAP (Yes-associated protein，即yes相關(guān)蛋白)是Hippo信號通路中的關(guān)鍵效應(yīng)因子，可促進(jìn)細(xì)胞生長并抑制細(xì)胞凋亡[3]。在小鼠胚胎干細(xì)胞中，YAP高表達(dá)有助于促進(jìn)干細(xì)胞增殖并保持未分化狀態(tài)[4]。在小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞中，YAP過表達(dá)可抑制其向軟骨細(xì)胞分化[5]。然而，有關(guān)YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖與分化的影響，目前尚未見報道?；钚匝?(reactive oxygen species,ROS) 在多種生命過程中扮演重要的角色，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、壞死等。當(dāng)機(jī)體內(nèi)過量的ROS不能被及時清除時就會導(dǎo)致氧化應(yīng)激[6]。有研究表明，ROS能夠影響干細(xì)胞的分化，抗氧化劑治療可抑制間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞分化為功能細(xì)胞[7]。但有關(guān)YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中ROS水平的影響目前尚不清楚。

本試驗以梅花鹿為研究對象，分離培養(yǎng)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞，添加YAP抑制劑Verteporfin，采用流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量PCR等方法，研究YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖與分化的影響，并探討其調(diào)節(jié)機(jī)理，研究結(jié)果將為進(jìn)一步探明鹿茸角發(fā)育與再生的分子機(jī)理、充分開發(fā)和利用我國的梅花鹿鹿茸資源等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物試驗所用2～3歲的雄性梅花鹿取自長春市世友梅花鹿養(yǎng)殖場，割取生長約60 d的茸角用于試驗。

1.2 主要試劑胰蛋白酶(Amresco公司產(chǎn)品)；PI/RNase Staining Buffer(BD Biosciences公司產(chǎn)品)；Ⅰ型膠原酶(Gibco公司產(chǎn)品)；DMEM/ HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基(HyClone公司產(chǎn)品)；胎牛血清(Clark公司產(chǎn)品)；熒光定量試劑盒(Roche公司產(chǎn)品)；MitoSOXTM紅色熒光染料(Invitrogen公司產(chǎn)品)；Verteporfin(R&D Systems)；BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、超氧化物陰離子熒光探針(Dihydroethidium,DHE)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)購自碧云天生物公司。

1.3 鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)取鹿茸尖端長約5 cm的鹿茸組織，75%酒精消毒，置入添加雙抗的PBS中清洗，在超凈臺分離鹿茸間充質(zhì)組織，切成碎塊，用不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基清洗，加入Ⅰ型膠原酶消化、離心后，獲取鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞，將其放于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 EdU檢測細(xì)胞增殖鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞經(jīng)Verteporfin處理36 h后，于10 μmol/L EdU中孵育2 h；去除培養(yǎng)液，經(jīng)4%多聚甲醛固定、洗滌后，于含0.3% TritonX-100的PBS中室溫孵育15 min；添加Click Additive Solution，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的增殖活性。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞經(jīng)血清饑餓后與Verteporfin孵育36 h，將細(xì)胞消化并1 200 r/min離心，棄上清，PBS重懸細(xì)胞后，4℃固定于70%冰乙醇，經(jīng) PI/RNase染色緩沖液染色15 min，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。

1.6 熒光定量PCR根據(jù)NCBI中相關(guān)基因序列設(shè)計引物(表1)，提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在LightCycler?96熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.7 ROS的檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平按照碧云天活性氧檢測試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.8 超氧陰離子的檢測細(xì)胞中超氧陰離子水平通過碧云天超氧化物陰離子熒光探針進(jìn)行測定，按照說明書步驟操作。

1.9 細(xì)胞線粒體中ROS的檢測MitoSOXTM紅色熒光染料具有活細(xì)胞滲透性，可快速靶向線粒體，高度選擇性地檢測活細(xì)胞線粒體中的超氧化物，進(jìn)入線粒體后，可被氧化并顯示紅色熒光。參照試劑盒說明書檢測細(xì)胞線粒體中ROS水平。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。單因素方差分析(ANOVA)用于比較不同組的平均值。兩組之間比較用t檢驗，P<0.05為顯著性差異。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物片段大小

2 結(jié)果

2.1 YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響為了檢測YAP對細(xì)胞增殖的影響，鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞血清饑餓后添加YAP抑制劑Verteporfin作用36 h，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示，與對照組相比，添加Verteporfin后可顯著抑制鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的增殖(圖1)。

2.2 YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖周期的影響為了研究YAP對細(xì)胞增殖周期的影響，鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞經(jīng)血清饑餓后，與YAP抑制劑Verteporfin孵育36 h，PI染色后，通過流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，添加Verteporfin后鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞滯留在G0/G1期，導(dǎo)致G0/G1期細(xì)胞數(shù)量增多，S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖2)。

2.3 YAP對細(xì)胞周期蛋白及蛋白激酶在鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的影響有研究證實，細(xì)胞周期蛋白及蛋白激酶與細(xì)胞增殖周期進(jìn)程密切相關(guān)[8]。本試驗應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測了Verteporfin對細(xì)胞周期蛋白CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1以及細(xì)胞周期蛋白激酶CDK2、CDK4、CDK6表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，Verteporfin可顯著降低CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDK2、CDK4和CDK6在鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)(圖3)。

2.4 YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞分化的影響為了研究YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞分化的影響，將分離培養(yǎng)的間充質(zhì)細(xì)胞與含有YAP抑制劑Verteporfin的間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基孵育12，24，36，48，72 h后，通過熒光定量PCR檢測了軟骨細(xì)胞標(biāo)志性分子COLⅡ、SOX9和AGC表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，Verteporfin顯著提高了COLⅡ、SOX9和AGC mRNA水平，并且隨著時間的增加，COLⅡ、SOX9和AGC的表達(dá)量也在增加(圖4)。

2.5 YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中ROS含量的影響ROS可參與細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程[9]。為了研究YAP對間充質(zhì)細(xì)胞中ROS含量的影響，分離培養(yǎng)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞后，添加Verteporfin作用24 h，裝載熒光探針DCFH-DA，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中ROS含量的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，添加Verteporfin后間充質(zhì)細(xì)胞中ROS的含量顯著上升(圖5)。

A.流式細(xì)胞圖；B.YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響柱狀圖。*P<0.05；DMSO.對照組；VCR.試驗組。下同

A.流式細(xì)胞圖；B.YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期的影響柱狀圖

A.Verteporfin對細(xì)胞周期蛋白CCND1、CCND2、CCND3和CCNE1表達(dá)的影響；B.Verteporfin對細(xì)胞周期蛋白激酶CDK2、CDK4和CDK6表達(dá)的影響

A.YAP對間充質(zhì)細(xì)胞中COLⅡ表達(dá)的影響；B.YAP對間充質(zhì)細(xì)胞中SOX9表達(dá)的影響；C.YAP對間充質(zhì)細(xì)胞中AGC表達(dá)的影響

A.流式細(xì)胞圖；B.YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中ROS含量的影響柱狀圖

2.6 YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中超氧陰離子的影響超氧陰離子(O2-)是細(xì)胞中主要的ROS，可與其他酶相互作用，產(chǎn)生其他的ROS[10]。為了研究YAP對間充質(zhì)細(xì)胞中O2-含量的影響，添加Verteporfin作用24 h后，裝載熒光探針Dihydroethidium，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中O2-含量的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，添加Verteporfin后間充質(zhì)細(xì)胞中O2-含量顯著升高，與ROS的變化趨勢一致(圖6)。

A.流式細(xì)胞圖；B.YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中O2-的影響柱狀圖

2.7 YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中線粒體ROS的影響ROS的主要來源之一是線粒體，稱為線粒體ROS(mitochondrial ROS,mtROS)[11]。為了研究YAP對間充質(zhì)細(xì)胞中mtROS含量的影響，添加Verteporfin作用24 h，與MitoSOXTM紅色熒光染料孵育后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測mtROS含量的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，添加Verteporfin后間充質(zhì)細(xì)胞中mtROS的含量顯著上升(圖7)。

A.流式細(xì)胞圖；B.YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中mtROS的影響柱狀圖

2.8 YAP可通過ROS來調(diào)節(jié)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的分化GSH和NAC是常用的抗氧化劑，可清除細(xì)胞中的ROS[12]。為了研究YAP是否可通過ROS來調(diào)節(jié)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的分化，先用YAP抑制劑Verteporfin處理間充質(zhì)細(xì)胞2 h后，再分別添加GSH和NAC作用24 h，通過實時熒光定量PCR檢測軟骨細(xì)胞標(biāo)志性分子COLⅡ、SOX9、AGC表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，GSH和NAC可顯著降低COLⅡ、SOX9和AGC mRNA在Verteporfin處理鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)(圖8)。

3 討論

鹿茸角是哺乳動物唯一在失去后可完全再生的附屬器官，鹿茸角的再生是基于干細(xì)胞的增殖與分化過程。眾所周知，鹿茸角的生長中心位于其頂端。鹿茸角的快速生長主要是通過保留在間充質(zhì)層中的細(xì)胞增殖來實現(xiàn)的，一些細(xì)胞傳導(dǎo)途徑和細(xì)胞因子參與了鹿茸角的再生過程[13]。

A.NAC減弱Verteporfin對間充質(zhì)細(xì)胞分化的影響；B.GSH減弱Verteporfin對間充質(zhì)細(xì)胞分化的影響

細(xì)胞增殖、凋亡和分化之間的平衡對于準(zhǔn)確地形成和維持組織器官至關(guān)重要。Hippo信號通路在器官發(fā)育、腫瘤發(fā)生、組織再生和干細(xì)胞自我更新中發(fā)揮重要的作用[14]。YAP是Hippo信號通路中的轉(zhuǎn)錄共激活因子，當(dāng)YAP活躍時，可進(jìn)入細(xì)胞核，與TEAD轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，誘導(dǎo)涉及細(xì)胞增殖、存活和遷移的多種基因的表達(dá)[15]。但是，YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖與分化的影響尚不明確。因此，本試驗以梅花鹿為研究對象，通過流式細(xì)胞術(shù)和熒光定量PCR等方法研究了YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖與分化的影響。

為了研究YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，通過EdU法檢測了間充質(zhì)細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示Verteporfin抑制了間充質(zhì)細(xì)胞的增殖。細(xì)胞的增殖過程分為以下4個階段： G1期、S期、G2期和M期。參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的關(guān)鍵機(jī)制能夠協(xié)調(diào)細(xì)胞增殖過程。調(diào)節(jié)該機(jī)制的關(guān)鍵成分是細(xì)胞周期蛋白，它們可結(jié)合并激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶并向細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶提供底物，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖[16]。為了進(jìn)一步證實YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，在鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中添加Verteporfin，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測間充質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期的變化，同時通過熒光定量PCR檢測CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDK2、CDK4和CDK6的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Verteporfin處理后間充質(zhì)細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)量增多，S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少。CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDK2、CDK4和CDK6 mRNA水平也顯著下降。這進(jìn)一步證實了Verteporfin對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖有抑制作用。最近的研究表明，YAP是小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞分化的負(fù)性調(diào)控因子，YAP過表達(dá)會抑制其向軟骨細(xì)胞分化[5]。為了研究YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞分化的影響，在鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中添加Verteporfin處理12，24，36，48，72 h，通過熒光定量PCR檢測了軟骨細(xì)胞的標(biāo)志性分子COLⅡ、SOX9和AGC的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，添加Verteporfin后間充質(zhì)細(xì)胞中COLⅡ、SOX9和AGC mRNA水平均顯著上升，72 h時表達(dá)水平最高。這與已有研究結(jié)果相一致。

目前，對于氧化應(yīng)激的研究越來越多。研究發(fā)現(xiàn)，Hippo/YAP通路與氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)有關(guān)，在特異性缺失YAP的小鼠心臟中ROS的含量升高[17]。但是，在SCC(肺鱗狀細(xì)胞癌)中，YAP激活會導(dǎo)致ROS積累升高。為了探究YAP對鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中ROS含量的影響，在間充質(zhì)細(xì)胞中添加Verteporfin后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測間充質(zhì)細(xì)胞中ROS的含量。結(jié)果顯示，添加Verteporfin后，與對照組相比，間充質(zhì)細(xì)胞中ROS含量升高。O2-是組成ROS的主要成分[18]，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了間充質(zhì)細(xì)胞中O2-的含量。結(jié)果顯示，添加Verteporfin后，間充質(zhì)細(xì)胞中O2-含量升高，與ROS變化趨勢一致。線粒體是ROS的重要來源[19]，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了間充質(zhì)細(xì)胞中mtROS的含量。結(jié)果顯示，添加Verteporfin后，間充質(zhì)細(xì)胞中mtROS含量升高，進(jìn)一步明確了YAP對間充質(zhì)細(xì)胞中ROS的作用。ROS是能對細(xì)胞生物分子造成氧化損傷的反應(yīng)性物質(zhì)，同時ROS還充當(dāng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使以介導(dǎo)細(xì)胞氧化還原信號傳導(dǎo)，從而產(chǎn)生特定的生理反應(yīng)[9]。為了研究ROS與間充質(zhì)細(xì)胞分化間的關(guān)系，在添加Verteporfin后，又添加了抗氧化劑GSH和NAC，通過熒光定量PCR檢測了間充質(zhì)細(xì)胞中COLⅡ、SOX9和AGC mRNA水平變化。結(jié)果顯示，添加GSH和NAC后，Verteporfin處理的間充質(zhì)細(xì)胞中COLⅡ、SOX9和AGC mRNA水平顯著降低,這說明YAP可通過ROS來調(diào)節(jié)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的分化。

綜上所述，YAP可促進(jìn)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的增殖，抑制其向軟骨細(xì)胞分化，進(jìn)而參與梅花鹿茸角的再生。