布魯菌介導(dǎo)細(xì)胞自噬的研究進(jìn)展

顧國(guó)婧，李博文，李文杰，周志雄，羅藝晨，帥學(xué)宏，趙 宇，陳吉軒，黃慶洲,伍 莉,焦寒偉

(西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心/獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，重慶 402460 )

布魯菌為球桿形革蘭陰性胞內(nèi)寄生菌，可侵入宿主細(xì)胞引起布魯菌病(簡(jiǎn)稱布病，又稱馬爾他熱)。布病對(duì)關(guān)節(jié)、神經(jīng)、生殖和免疫系統(tǒng)都會(huì)造成損害[1]，給人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展帶來嚴(yán)重威脅。自噬是真核生物細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下維持機(jī)體生態(tài)平衡的一種生理機(jī)制，在大多數(shù)情況下自噬處于未激活狀態(tài)，病原菌入侵或外界環(huán)境發(fā)生改變會(huì)激活自噬。據(jù)報(bào)道，布魯菌可以抑制宿主細(xì)胞的凋亡通路，從而介導(dǎo)自噬，為其在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存繁殖創(chuàng)造有利條件。隨著自噬相關(guān)研究的深入，布魯菌介導(dǎo)細(xì)胞自噬成為探究其致病機(jī)制的新熱點(diǎn)。

1 布魯桿菌引發(fā)自噬

巨噬細(xì)胞是布魯菌的主要宿主，布魯菌侵染巨噬細(xì)胞可激活自噬的發(fā)生。而在成骨細(xì)胞中，牛種布魯菌(Brucellaabortus,B.abortus)對(duì)于自噬途徑的激活還參與了成骨細(xì)胞功能和骨形成的調(diào)節(jié)[2]。布魯菌感染會(huì)誘導(dǎo)TGF-β1分泌、誘導(dǎo)膠原沉積、抑制mmp-9分泌，從而誘導(dǎo)自噬途徑的激活[3]。有研究表明，羊種布魯菌(Brucellamelitensis,B.melitensis) 16M侵染巨噬細(xì)胞后，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化率將會(huì)提升，自噬途徑隨即被激活；Beclin1是抑制、干擾細(xì)胞自噬的關(guān)鍵基因，添加該基因后可以抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生，降低B.melitensis16M在宿主細(xì)胞中存活和繁殖的能力。因此推測(cè)B.melitensis16M可以激活自噬途徑并促進(jìn)B.melitensis16M在宿主細(xì)胞中的存活[4]。B.melitensis16M激活的自噬途徑可以降低布魯菌與溶酶體的融合率，從而減少了B.melitensis16M被溶酶體內(nèi)水解酶的降解，是自噬有利于B.melitensis16M在宿主細(xì)胞內(nèi)生存繁殖的機(jī)制之一。

綜合多個(gè)不同的研究結(jié)果來看，B.abortus和B.melitensis在復(fù)制前可能遵循不同的胞內(nèi)通路，有的表明B.abortus的轉(zhuǎn)運(yùn)和復(fù)制與經(jīng)典的大自噬途徑無關(guān)，但有的卻顯示大自噬有利于B.melitensis的存活和復(fù)制。還有試驗(yàn)結(jié)果表明，B.abortusS2308和B.melitensis16M菌株都能夠侵襲缺乏ATG5的成纖維細(xì)胞并在其中進(jìn)行復(fù)制，而ATG5是典型的大自噬途徑的核心成分，這表明布魯菌的復(fù)制并不依賴于經(jīng)典的大自噬途徑[5]。這種不依賴于ATG5的自噬反應(yīng)被稱為非典型的自噬。最近的研究表明，非典型自噬途徑在宿主-病原相互作用中起著關(guān)鍵作用，并且具有與典型自噬途徑相同的上游調(diào)節(jié)因子。

吞噬過程中，布魯菌在含有布魯菌的液泡(BCV)內(nèi)存活，與早期核內(nèi)體(EE)、晚期核內(nèi)體(LE)相互作用，并與溶酶體(lysosomes,Lys)部分融合形成eBCV。eBCV促進(jìn)Ⅳ型病毒分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system,T4SS)的誘導(dǎo)，T4SS又傳遞效應(yīng)蛋白，控制eBCV與ER出口位點(diǎn)(ERES)的相互作用[6]。STARR等[7]研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)布魯菌通過形成eBCV從內(nèi)泡室向ER(endoplasmic reticulum,ER)運(yùn)輸，并產(chǎn)生一個(gè)ER衍生的復(fù)制液泡(rBCV)。布魯菌控制eBCV向rBCV的轉(zhuǎn)化的機(jī)制在很大程度上仍不清楚，但rBCV的產(chǎn)生并沒有通過ER和高爾基體之間的依賴于ARF1的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。目前已明確證實(shí)，T4SS可以通過病毒基因的突變將eBCVs中相應(yīng)的細(xì)菌突變體隔離，使其無法與ERES相互作用并將eBCV轉(zhuǎn)化為rBCV[8-11]。相反，在rBCV成熟期間，eBCVs定位于ER出口位點(diǎn)ERES，如果滅活小GTPase Sar1則會(huì)抑制rBCV的產(chǎn)生，表明布魯菌阻斷ER的早期分泌途徑，促進(jìn)eBCV向rBCV轉(zhuǎn)化[8]。Rab2和GAPDH是形成rBCV和細(xì)菌復(fù)制所必需的，這也能表明布魯菌改變?cè)缙诜置谕緩降奶囟ǔ煞忠垣@得ER結(jié)構(gòu)。細(xì)菌的分裂和復(fù)制都發(fā)生在rBCVs內(nèi)[10]，這表明細(xì)菌會(huì)在eBCV中為增殖做好準(zhǔn)備。布魯菌在ER中增殖后，rBCV轉(zhuǎn)換為具有自噬特征的間隔(aBCV)，侵染流程如圖1所示。aBCV具有與成熟的自噬體一致的晚期內(nèi)質(zhì)體特征，而不顯示ER標(biāo)記，所以它們?cè)诠δ苌吓crBCVs不同。aBCVs與細(xì)菌釋放和細(xì)胞間傳播相關(guān)，并有助于布魯菌在ER中增殖后完成細(xì)胞內(nèi)周期[7]。

圖1 布魯菌胞內(nèi)侵染流程[12]

aBCV的形成需要自噬起始蛋白ULK1、Beclin1和ATG14L以及PI3K的活化，而與ATG5、ATG16L1、ATG4B、ATG7無關(guān)。另外，還與規(guī)范的自噬不同的是，這個(gè)過程需要ATG9和WIPI1，但不需要DFCP1。有研究表明eBCV向rBCV的成熟則并不需要自噬起始蛋白ULK1和Beclin1以及自噬延長(zhǎng)蛋白ATG5、ATG7、ATG16L1和LC3B[13]。還有研究指出非典型通路依賴于ULK1和Beclin1，但與LC3和ATG7以及ATG5無關(guān)[14-15]。在布魯菌感染巨噬細(xì)胞的晚期，自噬基因AMPK、ULK3和VPS34的miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變[16]，表明該細(xì)菌可能為了形成aBCV而改變了相關(guān)自噬基因的表達(dá)。袁莎[17]研究發(fā)現(xiàn)，16M感染巨噬細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞因子IL-6分泌，IL-6能抑制IFN-γ的產(chǎn)生，達(dá)到抑制IFN-γ誘導(dǎo)的典型自噬的目的。綜上所述，細(xì)菌可能根據(jù)它們?cè)诎麅?nèi)生存復(fù)制的不同階段選擇性利用了宿主細(xì)胞的自噬相關(guān)機(jī)制。

2 布魯菌介導(dǎo)細(xì)胞自噬相關(guān)的重要毒力因子和信號(hào)通路

布魯菌主要借助LPS、外膜蛋白、VirB編碼的T4SS、雙組分調(diào)控系統(tǒng)等毒力因子的作用得以在宿主細(xì)胞中生存、繁殖[18-19]。這些因子是布魯菌能夠侵入宿主細(xì)胞并在胞內(nèi)生存復(fù)制的必需因素。

2.1 布魯菌LPS介導(dǎo)細(xì)胞自噬研究表明，LPS是布魯菌的主要毒力因子之一[20]。LPS在結(jié)構(gòu)和功能整合中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)也是先天免疫系統(tǒng)的主要靶點(diǎn)[21]。它不僅在引導(dǎo)細(xì)菌改變胞內(nèi)運(yùn)輸途徑方面發(fā)揮著重要作用，還保護(hù)細(xì)菌免受惡劣的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響，抑制促炎癥和抗菌宿主反應(yīng)，并干擾巨噬細(xì)胞中的抗原提呈[20]。有研究表明，與大腸桿菌相比，布魯菌LPS的活性及毒力要弱幾百倍[22]，這說明布魯菌LPS屬于非典型的LPS。LPS的O抗原能夠阻礙機(jī)體細(xì)胞誘發(fā)凋亡，避免激活細(xì)胞先天性免疫系統(tǒng)。但是，目前研究中發(fā)現(xiàn)，布魯菌的LPS只與其在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存有關(guān)。

2.2 T4SS介導(dǎo)細(xì)胞自噬T4SS對(duì)布魯菌在宿主細(xì)胞內(nèi)免疫逃避、存活、增殖有著密切的作用。通常情況下，宿主細(xì)胞吞噬布魯菌后，隨即形成含有BCV的吞噬小體，與Lys融合后，通過水解酶的作用，就能將布魯菌溶解。但是在T4SS的作用下，布魯菌可以阻止Lys與吞噬小體的結(jié)合，從而逃脫降解過程。布魯菌憑借T4SS系統(tǒng)的幫助在胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，最終到達(dá)ER，在T4SS編碼的VirB操縱子表達(dá)誘導(dǎo)下產(chǎn)生酸性的BCV，BCV的酸性環(huán)境利于布魯菌的生存[23]。

T4SS不僅阻礙了BCV與Lys的融合，同時(shí)促進(jìn)細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)到了ER并衍生出適合布魯菌復(fù)制的位點(diǎn)，復(fù)制過程中需要ER跨膜蛋白Irela的參與[31]。Irela是一個(gè)應(yīng)激ER的未折疊蛋白反應(yīng)的傳感器，它也有助于誘導(dǎo)自噬。

表1 布魯菌T4SS效應(yīng)分子功能

2.3 UPR介導(dǎo)細(xì)胞自噬有研究通過非折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的激活，提供了自噬和布魯菌感染之間的潛在聯(lián)系[13,28,31-32]。UPR是一種ER應(yīng)激反應(yīng)，通過嚴(yán)格控制促進(jìn)ER功能基因的轉(zhuǎn)錄，來恢復(fù)ER應(yīng)激時(shí)的穩(wěn)態(tài)，包括脂質(zhì)合成、ER相關(guān)降解(ERAD)和蛋白質(zhì)的合成[33]。UPR途徑由3個(gè)感受ER應(yīng)激的ER相關(guān)受體控制，即IRE-1α、PERK和ATF6[34]。在一些報(bào)道中均表明了UPR過程中自噬的激活是由IRE1-TRAF2-JNK途徑介導(dǎo)的[13,28,35]。自噬在ER應(yīng)激時(shí)也被激活，以恢復(fù)內(nèi)環(huán)境平衡和促進(jìn)細(xì)胞存活[35]。

UPR是布魯菌復(fù)制所必需的，但目前還不清楚布魯菌感染是否會(huì)引發(fā)完全的UPR反應(yīng)。有研究表明B.abortus和豬布魯菌(Brucellasuis,B.suis)只激活I(lǐng)RE1α，后者與宿主細(xì)胞對(duì)T4SS分泌的感知有關(guān)[32]，而B.melitensis通過分泌效應(yīng)子TcpB觸發(fā)UPR的所有3個(gè)途徑(IRE1α、PERK和ATF6依賴性通路)來誘導(dǎo)ER應(yīng)激[28]。包括BspC、BspG、BspH和BspK在內(nèi)的許多附加效應(yīng)器在上皮細(xì)胞中的表達(dá)也會(huì)觸發(fā)ER應(yīng)激，這表明布魯菌誘導(dǎo)UPR的機(jī)制是復(fù)雜的，涉及到很多宿主蛋白[27]。并不是所有的UPR調(diào)節(jié)蛋白都對(duì)細(xì)菌的復(fù)制很重要，但所有研究都支持IRE1α可以被布魯菌感染激活[28,32,36]。

2.4 IRE1α介導(dǎo)細(xì)胞自噬有試驗(yàn)表明布魯菌感染4 h后在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到IRE1α被激活，表明IRE1α在布魯菌胞內(nèi)循環(huán)的早期發(fā)揮作用，其激活需要自噬蛋白ATG9和WIPI。宿主蛋白Yip1A在IRE1α的激活下產(chǎn)生，并與IRE1α結(jié)合后磷酸化，觸發(fā)XBP-1依賴性轉(zhuǎn)錄[13]。IRE1α對(duì)Yip1A的激活與GTPase-Sar1和COPⅡ-coat復(fù)合物亞單位的上調(diào)有關(guān)，后者是ERES和早期分泌轉(zhuǎn)運(yùn)的重要組成部分，是產(chǎn)生rBCV所必需的[8]。COPⅡ成分和GTPase Sar1的上調(diào)可能會(huì)增強(qiáng)ERES的功能并促進(jìn)ER囊泡出芽，以促進(jìn)ER膜的獲得。IRE1α活化可以誘導(dǎo)膜磷脂的合成，從而增加粗糙ER的表面積和體積，而ER膜可被病原體利用以擴(kuò)大其復(fù)制生態(tài)位的大小和提高其質(zhì)量[37-38]。IRE1α可以獨(dú)立于其他ER相關(guān)信號(hào)分子來參與調(diào)節(jié)自噬。

還有研究結(jié)果表明，IRE1-ULK1信號(hào)軸被細(xì)菌顛覆后會(huì)促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)的寄生。沿該軸的關(guān)鍵信號(hào)成分，包括IRE1α、BAK/BAX、ASK1和JNK，以及宿主自噬系統(tǒng)ULK1、ATG9a和Beclin1的缺失或失活會(huì)顯著干擾布魯菌的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和復(fù)制。IRE1α-ULK1軸上的宿主激酶，包括IRE1α、ASK1、JNK1和/或AMPKα以及ULK1，在病原體感染時(shí)也以依賴于IRE1α的方式協(xié)同磷酸化[39]。

2.5 Yip1A介導(dǎo)細(xì)胞自噬Yip1A被認(rèn)為在膜轉(zhuǎn)運(yùn)中具有多種功能，包括參與ERES處COPⅠ囊泡出芽[40]、囊泡與高爾基膜的連接[41]和不依賴于COPⅠ的逆行囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)[42]。通過TAGUCHI等[12]的研究可以知道，在布魯菌感染的細(xì)胞中，ER衍生液泡在復(fù)制的細(xì)菌附近形成，Yip1A是一種IRE1活化和ER衍生空泡形成所必需的宿主因子，同時(shí)，功能性ERES和COPⅡ囊泡也均參與了布魯菌的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。

在感染過程中，布魯菌可能通過分泌系統(tǒng)向宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)分泌效應(yīng)分子來參與觸發(fā)IRE1的激活。IRE1分子借助Yip1A在ERES上形成高階配合物，再通過自磷酸化激活，然后觸發(fā)ER衍生的自噬空泡的形成。同時(shí)，COPⅡ組分Sar1、Sec23和Sec24的上調(diào)也促進(jìn)了液泡的形成。這些液泡會(huì)與溶酶體小泡融合。布魯菌可以阻斷UPR誘導(dǎo)的液泡形成過程，并獲得ER衍生膜。

2.6 GTPase Rab 2介導(dǎo)細(xì)胞自噬GAPDH和小GTPase Rab 2是布魯菌復(fù)制的關(guān)鍵酶，定位于囊泡管狀簇(vesicle tubules cluster,VTC)上。GAPDH在宿主細(xì)胞內(nèi)具有多種功能，如參與糖酵解和凋亡[43-44]。小GTPase Rab 2在BCV發(fā)生的早期阻止BCV與ER的融合。而Rab 2在布魯菌建立了2次復(fù)制生態(tài)位后，對(duì)其生存也是必要的。當(dāng)GAPDH和Rab 2的表達(dá)被抑制時(shí)，布魯菌的復(fù)制也會(huì)被強(qiáng)烈地抑制。此外，以GDP鎖定的形式來阻斷小GTPase Rab 2也抑制了布魯菌的復(fù)制。這些結(jié)果表明了GAPDH和小GTPase Rab 2在宿主細(xì)胞內(nèi)布魯菌毒力中的重要作用。GAPDH與小GTPase Rab 2的相互作用還控制了ER和高爾基體之間的囊泡逆行運(yùn)輸[45]。

最初的研究表明，Rab 2的非活性形式對(duì)囊泡從ER到高爾基體的順行運(yùn)輸有負(fù)面影響[46]。最近，Tisdale小組已經(jīng)證明Rab 2通過向VTCs招募GAPDH來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)從高爾基向ER的逆行轉(zhuǎn)運(yùn)，從而允許逆行性囊泡的釋放[47-48]。這種逆行運(yùn)輸需要一個(gè)功能性的GAPDH/COPⅠ/Rab 2/PKCi/l復(fù)合物。

2.7 miRNA介導(dǎo)細(xì)胞自噬Fas-l、Bcl-2、IL-1、IL-3R、Cn和AMPK都參與自噬途徑[49-51]，這些基因都受miRNAs調(diào)控。病原菌可以誘導(dǎo)miRNA在細(xì)胞中的差異表達(dá)，反過來miRNA也可以調(diào)節(jié)宿主對(duì)病原菌的反應(yīng)。由于NF-κB信號(hào)通路調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，LPS可以誘導(dǎo)miRNA的表達(dá)，比如miR-146b-5p。miR-146b-5p靶向于Tbc1d14，Tbc1d14與自噬激酶ULK1共定位并相互作用。Tbc1d14的過度表達(dá)上調(diào)了介導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞自噬激活的miR-146b-5p，同時(shí)還誘導(dǎo)了4個(gè)自噬相關(guān)基因Iigp1、Irgm1、Trp53inp1和Nrbp2的差異表達(dá)[52]。除此以外。在布魯菌感染后，miR-1981在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)也會(huì)上調(diào)。但總的來說miRNAs在布魯菌感染過程中介導(dǎo)自噬的具體作用在很大程度上仍是未知的。

2.8 p38 MAPK通路介導(dǎo)細(xì)胞自噬p38 MAPK通路和自噬機(jī)制的交叉是布魯菌細(xì)胞內(nèi)生命周期的關(guān)鍵組成部分。吞噬小體成熟和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制都需要p38 MAPK刺激，反過來，p38 MAPK又受細(xì)胞內(nèi)感染的誘導(dǎo)和調(diào)控。在BCV沿著內(nèi)吞途徑成熟后，毒力因子轉(zhuǎn)位到宿主細(xì)胞，刺激p38磷酸化和自噬。在沙林鼠種布魯菌(Brucellaneotomae,B.neotomae)通過內(nèi)小體運(yùn)輸?shù)倪^程中，B.neotomae可能會(huì)誘導(dǎo)依賴于VirB4的BCV轉(zhuǎn)化，這就與p38磷酸化和自噬小體形成相關(guān)。MAP激酶的誘導(dǎo)和自噬溶酶體的成熟與rBCV的形成有關(guān)，也是在巨噬細(xì)胞中形成高效的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制生態(tài)位所必需的。

B.neotomae在整個(gè)感染過程中都刺激了p38的磷酸化，并且依賴于p38的激活來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)。此外，B.neotomae對(duì)p38磷酸化的誘導(dǎo)依賴于完整的T4SS，這表明T4SS、p38和細(xì)菌胞內(nèi)生長(zhǎng)之間存在聯(lián)系。而一些B.abortus、B.melitensis、B.suis也可刺激小鼠巨噬細(xì)胞中的p38磷酸化，但并沒有研究它們對(duì)于T4SS的依賴性[53]。

2.9 ROS通路介導(dǎo)細(xì)胞自噬布魯菌可以通過ROS途徑改變自噬相關(guān)基因表達(dá)，提高自噬活性。AIR結(jié)構(gòu)域也可以通過ROS信號(hào)途徑參與布魯菌促進(jìn)的NLRP3的炎癥反應(yīng)和活化[54]。由此可見，ROS與細(xì)胞自噬存在著密切的聯(lián)系。那么布魯菌是否也會(huì)通過ROS這一通路介導(dǎo)吞噬細(xì)胞的自噬？有研究人員探索了B.melitensis16M侵染過程中AIR結(jié)構(gòu)域和ROS對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞自噬及炎癥的影響，指出AIR結(jié)構(gòu)域能夠通過ROS通路影響16M侵染，同時(shí)也提出干擾AIR結(jié)構(gòu)域能夠促進(jìn)吞噬小體的成熟，促進(jìn)自噬的發(fā)生；16M侵染細(xì)胞引起的自噬對(duì)炎癥小體的激活有反向調(diào)節(jié)作用，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的作用[55]。布魯菌誘導(dǎo)細(xì)胞自噬分泌IL-1β與NLRP3炎性小體的活化有關(guān)，而ROS在此過程中也發(fā)揮重要的作用。

2.10 PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞自噬PI3K/Akt信號(hào)通路是重要的細(xì)胞信號(hào)通路之一，與很多疾病有關(guān)。其中，PI3K在細(xì)胞中對(duì)S型和R型的布魯菌感染有不同的調(diào)節(jié)作用，而Akt在促進(jìn)細(xì)胞生存、生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移等方面都起到關(guān)鍵作用，PI3K/Akt信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[56]，也與一些病毒的生存繁殖密切相關(guān)。有試驗(yàn)指出，布魯菌感染能激活PI3K/Akt信號(hào)通路，當(dāng)該通路被抑制劑和RNA阻斷時(shí)，可有效降低布魯菌的存活率，誘導(dǎo)B.melitensis16M介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和抑制B.melitensis16M介導(dǎo)的細(xì)胞自噬[57]。