席 啦，凌 霞，劉長玲，楊 江，張振東，郭 壯*

（1.湖北文理學院湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北襄陽 441053；2.襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北襄陽 441001）

酸魚是侗族和苗族等少數(shù)民族制作的一種特色食品，因其口感美味和營養(yǎng)豐富而廣受歡迎[1]。酸魚是在密封環(huán)境下自然發(fā)酵而成的，主要原料為新鮮的淡水魚，包括青魚、草魚和鯽魚等[2]，制作過程大致為清洗原料魚、放置腌料（腌料的主要成分為胡椒、辣椒、小米、鹽、糖和酒等）和裝壇發(fā)酵，樣品需要經(jīng)過至少半個月的時間進行發(fā)酵[3]。民間傳統(tǒng)的發(fā)酵方法不僅需要較長的發(fā)酵周期，且發(fā)酵標準和產(chǎn)品品質(zhì)無法得到保障，這制約了傳統(tǒng)發(fā)酵食品的現(xiàn)代化和工業(yè)化發(fā)展。為改善這種情況，BAO R等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)接種乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）M10和食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）M3可在降低發(fā)酵周期的同時保持發(fā)酵魚的品質(zhì)，且二者還能增強發(fā)酵魚風味的形成；ZANG J H等[5]對酸魚發(fā)酵過程中微生物群落的多樣性進行了研究，發(fā)現(xiàn)酸魚在發(fā)酵過程中細菌和真菌的結(jié)構(gòu)是隨著發(fā)酵時間而變化的，且在相同的發(fā)酵環(huán)境中，真菌的多樣性大于細菌的多樣性；夏秀東等[2]發(fā)現(xiàn)添加辣椒可抑制酸魚發(fā)酵前期的菌落數(shù)量，并減少發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮的含量，但是具體的影響機制還仍待討論。目前有關(guān)酸魚的研究仍相對較少，并且對成品酸魚的群落細菌多樣性及功能預(yù)測分析還尚未開展。

近幾年來，隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，以Illumina MiSeq為代表的第二代高通量測序技術(shù)因具有測序成本低、操作簡單和結(jié)果準確等特點[6-7]而被廣泛關(guān)注和使用，目前在酸奶[8]、臘魚[9]、風干豬肉[10]、泡菜[11]和辣椒醬[12]等方面均有所應(yīng)用。隨著人們對16S rRNA序列認識的深入和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)基于16S擴增子分析所獲得的信息相對有限，因此研究者開始探討如何將分類單元操作（operational taxonomic unit，OTU）與細菌基因組功能建立聯(lián)系，于是PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）技術(shù)應(yīng)運而生，自此為16S擴增子的相關(guān)研究提供了研究方向，近幾年來已被廣泛的用于土壤[13]和食品[14]微生物類群揭示及其功能預(yù)測分析。

本研究從湖南省張家界市采集7 個酸魚樣品，采用Illumina MiSeq測序技術(shù)對其細菌多樣性進行了解析，用PICRUSt技術(shù)對其微生物基因功能進行預(yù)測，以期為后續(xù)酸魚生產(chǎn)用微生物菌株篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸魚：采集自湖南省張家界市慈利縣，樣品編號分別為SY1、SY2、SY3、SY4、SY5、SY6和SY7。

脫氧核糖核苷三磷酸、10×聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司；338F/806R正反向引物：武漢天一輝遠生物科技有限公司；微生物基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；R930機架式服務(wù)器：美國DELL公司；Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；FluorChem FC3化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司；CR21N型高速離心機：日本日立金屬株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集及細菌基因組DNA提取

樣品采集自湖南省張家界市慈利縣慈利大市場、城西農(nóng)貿(mào)市場和生活家菜市場，選取以草魚和紅辣椒為原料、發(fā)酵20～30 d左右且采用土陶壇發(fā)酵的酸魚，裝入采樣袋后置于裝有冰袋的樣品箱。7個酸魚樣品由不同農(nóng)戶手工制作，樣品運送回實驗室后去除魚頭和魚刺，魚肉使用組織攪拌機打碎后，使用基因組提取試劑盒進行微生物宏基因組提取。

1.3.2 細菌16S rRNA擴增及高通量測序

以基因組為模板，使用帶有7 個核苷酸序列的338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物，參照王玉榮等[15]的擴增體系對細菌16S rRNA序列V4-V5區(qū)進行PCR擴增，結(jié)束后進行檢測和清潔。使用Illumina MiSeq PE300平臺進行高通量測序。參照ZHANG W等[16]的方法將下機序列進行拼接，并按照王玉榮等[17]的方法進行序列質(zhì)量控制，進而得到質(zhì)量控制合格的有效序列。

1.3.3 生物信息學分析

將質(zhì)控合格的有效序列上傳至QIIME分析平臺進行生物信息學分析。其主要分析流程如下：（1）使用PyNAST軟件對序列進行校準與對齊處理[18]。（2）使用UCLUST算法分別按照100%和97%對序列進行OTU的建立[19]。（3）使用ChimeraSlayer去除含有嵌合體序列的OTU。（4）將每個OTU中第一條序列分別與Greengenes、RDP和SILVA數(shù)據(jù)庫[20]進行比對分析，以便在門、綱、目、科和屬水平上對酸魚樣品的細菌群落進行分析，進而計算超1（Chao1）和香農(nóng)（Shannon）指數(shù)。

1.3.4 PICRUSt基因功能預(yù)測

將合格的高質(zhì)量序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫進行比對，用PICRUSt軟件[20]對酸魚的基因功能進行預(yù)測，然后基于蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫[21]（Clusters of Orthologous Groups of proteins，COGs）進行功能注釋。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

用SAS軟件進行相關(guān)性分析，用R軟件進行UpSet圖、相關(guān)性圖和熱圖的繪制，其他圖形都是采用Origin8.6軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品序列多樣性及豐富度分析

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對7個酸魚樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)進行了解析。序列經(jīng)過質(zhì)控后，7個酸魚樣品共產(chǎn)生了274 102條高質(zhì)量序列，平均每個樣品39 157條。經(jīng)與16S rRNA標準數(shù)據(jù)庫比對得到274 098條序列，其中有4 條序列比對失敗，因而共有274 098條序列參加分類單元操作劃分。7個酸魚樣品的測序結(jié)果以及分類學地位如表1所示。

表1 酸魚樣品測序結(jié)果及各分類地位數(shù)量Table 1 Sequencing results of sour fish and number of classified positions

由表1可知，樣品SY3的超1指數(shù)最高，而樣品SY1的香農(nóng)指數(shù)最高，這說明樣品SY3中細菌的豐富度最大，而樣品SY1中細菌的多樣性最高。由表1亦可知，按97%相似性進行分類單元操作劃分共得到3 612個OTU，平均每個樣品1 218 個，在分類單元操作劃分的基礎(chǔ)上，將所有序列劃分為7個門、19個綱、64個目、94個科和148個屬。

2.2 基于各分類學地位酸魚細菌相對含量的構(gòu)成分析

本研究將酸魚樣品中平均相對含量＜1.0%的細菌歸為其他，基于門水平細菌構(gòu)成情況如圖1所示。

圖1 酸魚樣品中平均含量高于1.0%的細菌門Fig.1 Bacteria phylum with average content higher than 1.0% in sour fish samples

由圖1可知，平均相對含量高于1.0%的有3 個門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對含量分別為95.49%、2.29%和1.96%，其中有0.2%鑒定不到門序列。酸魚樣品中平均相對含量＞1.0%的細菌屬構(gòu)成如圖2所示。

圖2 酸魚樣品中平均含量高于1.0%的細菌屬Fig.2 Bacteria genera with average content higher than 1.0% in sour fish samples

由圖2可知，酸魚中平均相對含量大于1.0%的細菌屬主要有隸屬于Firmicutes的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）和乳球菌屬（Lactococcus），其平均相對含量分別為66.53%、11.77%、8.10%、3.07%和2.99%；隸屬于Actinobacteria的棒狀桿菌屬（Corynebacterium），其平均相對含量為2.20%；隸屬于Proteobacteria的醋酸桿菌屬（Acetobacter），其平均相對含量分別為1.15%。Lactobacillus、Tetragenococcus和Lactococcus均為乳酸菌，三者的累計平均相對含量為81.29%，由此可見，酸魚樣品中蘊含了豐富的乳酸菌。單玉鑫等[22]通過對貴州和湖南地區(qū)酸魚微生物群落結(jié)構(gòu)與品質(zhì)的聯(lián)系研究發(fā)現(xiàn)，酸魚產(chǎn)品的主要優(yōu)勢細菌為Lactobacillus和Tetragenococcus，研究結(jié)論與本研究相同。Halanaerobium是一種嗜鹽且嚴格厭氧的細菌，其可利用碳水化合物和果膠等物質(zhì)來產(chǎn)酸和產(chǎn)氫，李春生等[23]研究魚露發(fā)酵過程中細菌的演替以及品質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)Halanaerobium會通過抑制乙酸乙酯的生成進而促進三甲胺的釋放，從而可能會導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)生魚腥味，降低品質(zhì)。

游剛等[24]研究表明使用復(fù)合乳酸菌發(fā)酵劑可以增加六齒金線魚肉中醇、醛和酮類物質(zhì)的含量，降低胺類物質(zhì)的產(chǎn)生，進而改善了產(chǎn)品的風味品質(zhì)；鄭心如等[25]亦評價了復(fù)合發(fā)酵劑對發(fā)酵魚肉香腸品質(zhì)的影響，研究發(fā)現(xiàn)使用復(fù)合發(fā)酵劑可顯著降低總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值，同時使得氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）值顯著升高，進而使得產(chǎn)品品質(zhì)提高。由此可見，為了縮短發(fā)酵時間、提高產(chǎn)品品質(zhì)和提升發(fā)酵魚產(chǎn)品的安全性，在對酸魚樣品中優(yōu)勢細菌屬進行分析的基礎(chǔ)上，對其中的優(yōu)勢類群進行分離，同時對優(yōu)良發(fā)酵特性菌株進行篩選并確定其最佳的發(fā)酵復(fù)配方案，進而實現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵劑在酸魚生產(chǎn)中的應(yīng)用是一個比較可行的研究思路。

本研究進一步對酸魚樣品中OTU的含量及分布情況進行分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 基于OTU水平的UpSet圖Fig.3 UpSet diagram based on OTU level

由圖3可知，有76 個OTU存在于所有的樣品中，共包含188 289條序列，占序列總數(shù)的68.69%；同時分別有563、300、198、75和50個OTU僅存在于SY1、SY4、SY3、SY7和SY5樣品中，分別包含了5 270、1 136、678、269和159條序列，分別占總序列數(shù)的1.92%、0.41%、0.25%、0.10%和0.06%。由此可見，7 個酸魚樣品中存在大量的核心細菌類群，雖然部分樣品可能含有特殊的細菌類群，但其相對含量較少。將在所有樣品中均存在的OTU定義為核心OTU，進一步分析發(fā)現(xiàn)其中8 個核心OTU的相對含量大于1.0%，其結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，8 個核心OTU被注釋為3 類細菌屬，其分別為Lactobacillus、Tetragenococcus和Staphylococcus。OTU11996注釋為Tetragenococcus，其平均含量為9.89%，OTU4509、OTU5083、OTU3571、OTU7361、OTU1144和OTU11972均注釋為Lactobacillus，其平均含量分別為1.11%、1.18%、1.42%、1.45%、1.95和43.27%，OTU6717注釋為Staphylococcus，且其平均含量為5.50%。值的一提的是，注釋為乳酸菌的7 個核心OTU平均含量累計達60.27%，由此可知，乳酸菌在酸魚中為主要的優(yōu)勢菌，這和圖2的結(jié)論是一致的。進一步對核心OTU之間的相關(guān)性進行研究，結(jié)果如圖5所示。

圖4 平均相對含量大于1.0%的核心OTUFig.4 Core OTU with average relative content higher than 1.0%

圖5 核心OTU之間的相關(guān)性Fig.5 Correlation between core OTUs

由圖5可知，OTU7361（鑒定為Lactobacillus）與OTU4509（鑒定為Lactobacillus）的相關(guān)系數(shù)為1.00，相關(guān)性極顯著（P＜0.001）；OTU7361（鑒定為Lactobacillus）與OTU1144（鑒定為Lactobacillus）的相關(guān)系數(shù)為0.87，相關(guān)性非常顯著（P＜0.01）；OTU4509（鑒定為Lactobacillus）與OTU1144（鑒定為Lactobacillus）的相關(guān)系數(shù)亦為0.87，相關(guān)性亦非常顯著（P＜0.01）。由此可見，酸魚樣品中部分Lactobacillus類群可能具有一定的共生關(guān)系。

2.3 PICRUSt功能預(yù)測

本研究使用PICRUSt軟件對酸魚中細菌微生物的基因功能進行預(yù)測，同時參考蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫（COGs）對功能類別進行了注釋，其結(jié)果如圖6所示。

圖6 酸魚樣品細菌的功能預(yù)測Fig.6 Functional prediction of bacteria in sour fish samples

由圖6可知，從納入本研究的7個酸魚樣品中分析得到4 048個COG，且其隸屬于21個功能類別，其中“氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝”和“碳水化合物運輸和代謝”等功能在酸肉細菌類群中表達較高，而“RNA的加工與修飾”、“染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學”、“細胞周期控制、細胞分裂、染色體分割”、“細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生”、“次生代謝產(chǎn)物的合成轉(zhuǎn)運和分解代謝”和“細胞骨架”等功能表達則相對較低。

3 結(jié)論

使用Illumina MiSeq技術(shù)對張家界市7個酸魚樣品進行細菌多樣性解析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢細菌門為Firmicutes、Actinobacteria和Proteobacteria，三者累計相對含量可達99.74%，優(yōu)勢細菌屬主要為Lactobacillus、Tetragenococcus、Staphylococcus、Halanaerobium、Lactococcus、Corynebacterium和Acetobacter，相對含量占細菌屬的95.81%。酸魚樣品中含有大量的Lactobacillus、Tetragenococcus及Lactococcus核心類群，含量占總細菌類群的60%左右，且其細菌類群具有較強的氨基酸和碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝功能。