（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省分析測(cè)試中心/山東省大型精密儀器分析應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014）

【研究意義】標(biāo)準(zhǔn)樣品是一類有證書的實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)參照物，具有均勻的一種或多種性能特征［1］，在分析檢測(cè)和質(zhì)量控制中必不可少。標(biāo)準(zhǔn)樣品在檢測(cè)結(jié)果溯源、方法開發(fā)與驗(yàn)證、儀器核查和校準(zhǔn)、檢測(cè)人員技術(shù)評(píng)估及產(chǎn)品質(zhì)量控制等方面均具有重要作用，保證相關(guān)工作的準(zhǔn)確可靠。隨著中醫(yī)藥的國(guó)際化，生產(chǎn)及科研工作中都急需與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Standards Organization，ISO）對(duì)接的標(biāo)準(zhǔn)樣品，而我國(guó)研發(fā)的中藥標(biāo)準(zhǔn)樣品難以滿足需求，嚴(yán)重制約了相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制水平，因而研制具備量值傳遞功能且可溯源的計(jì)量有證國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，相關(guān)研究正在廣泛開展［2-5］。

【 前人研究進(jìn)展】 栝樓（Trichosanthes kirilowiiMaxim.）始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是葫蘆科栝樓屬多年生藤本植物［6-7］，其果皮瓜蔞皮是我國(guó)藥典規(guī)定的中藥［8-9］，味甘，性寒，歸肺、胃經(jīng)，具有清化熱痰、理氣寬胸作用，可用于治療痰熱咳嗽、胸悶脅痛等［10-11］，屬中醫(yī)臨床上的常用藥物。腺苷是瓜蔞皮中重要的含氮化合物，具有鎮(zhèn)靜、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、鎮(zhèn)痛、抗缺氧、降低膽固醇等作用，是瓜蔞提取物抗血栓的主要藥效成分［12-16］，1998 年獲得了美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，應(yīng)用于心血管疾病的臨床診斷與治療，是治療轉(zhuǎn)復(fù)陣發(fā)性室上性心動(dòng)過速的一線藥物。腺苷是瓜蔞皮中與藥理活性、臨床療效密切相關(guān)的化學(xué)成分，其含量對(duì)瓜蔞皮制劑的療效和內(nèi)在質(zhì)量起關(guān)鍵作用，已有研究建立了腺苷的HPLC-MS/MS 定量分析方法，可用于臨床應(yīng)用廣泛的瓜蔞皮注射液的質(zhì)量控制［17］。

【本研究切入點(diǎn)】目前藥典中尚未有瓜蔞的成分檢測(cè)指標(biāo)，僅瓜蔞子的質(zhì)量控制指標(biāo)為栝樓仁三醇，有研究報(bào)道采用總皂苷、腺苷含量等作為瓜蔞藥材質(zhì)量的控制指標(biāo)是可行的［18］。目前瓜蔞中腺苷的制備尚未見報(bào)道，市場(chǎng)上的腺苷純品主要是對(duì)照品，沒有具備溯源性的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品，純度及質(zhì)量不一，亟需研制具備均一性、穩(wěn)定性且可溯源的標(biāo)準(zhǔn)樣品?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究參照 ISO Guide 35［19］和GB/T15000.3-2008［20］，研制腺苷國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品，以期為瓜蔞飲片等相關(guān)產(chǎn)品的分析檢測(cè)及質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

成熟的瓜蔞采自濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)，為栝樓果實(shí)，采后自然晾干。

主要試劑：GF254 薄層板及柱層析用硅膠（青島海洋化工有限公司）、色譜純甲醇（美國(guó)天地有限公司），其他試劑為分析純。

主要儀器設(shè)備：Waters 高效液相色譜儀、二極管陣列檢測(cè)器（E2695）、島津熱重分析儀（TG-40 DTA-40M）、島津紫外可見分光光度計(jì)（UV-2550）、瓦里安核磁共振波譜儀（INOVA 600 MHz）、Agilent 液質(zhì)聯(lián)用儀（6520 Q-TOF）、BUCHI 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-3）、寧波新芝冷凍干燥儀（10N）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 腺苷粗提物的制備 將瓜蔞果皮剝離，自然晾干，50 ℃恒溫干燥，粉碎，采用5 倍量蒸餾水回流提取4 次，合并提取液后減壓濃縮，加入乙醇使含醇量達(dá)到70%左右，靜置72 h 后過濾，上層清液減壓濃縮，得浸膏150 g。

1.2.2 腺苷的分離純化 浸膏經(jīng)D101 大孔樹脂依次用不同濃度的乙醇（0、10%、30%、50%、70%、95%）洗脫，每種溶劑均洗脫5 個(gè)柱體積，HPLC 檢測(cè)合并相同流分。其中，30%乙醇洗脫的流分過Sephadex LH-20 凝膠，經(jīng)甲醇洗脫得腺苷，純度為90%；經(jīng)制備型HPLC 分離，純度大于99%。制備條件為甲醇∶水=15 ∶85（V/V），流速為：10 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm。

1.2.3 純度分析 分別采用HPLC、LC-MS、熱重分析技術(shù)、薄層色譜法進(jìn)行樣品純度分析：

高效液相色譜采用Nano-micro C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm，樣品濃度0.35 mg/mL，進(jìn)樣量10 μL。等度分析流動(dòng)相為乙腈/水（5 ∶95，V/V）、甲醇/水（15 ∶85，V/V）；運(yùn)行時(shí)間分別為25、30 min。梯度分析流動(dòng)相為甲醇/水（V/V），梯度洗脫0～15 min，5%～40%甲醇；15～30 min，40%～100%甲醇。

熱重分析初溫為30 ℃，以10 ℃/min 的速率升溫至終溫600 ℃；氣體N2，流量 100 mL/min。

LC-MS條件：色譜柱Navo-micro C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇/水，梯度洗脫0～30 min，10%～100%甲醇；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；運(yùn)行時(shí)間30 min。MS條件：ESI電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓4.0 kV，載氣為普氮，流速10 L/min，溫度300 ℃，掃描范圍為m/z=100～1000。

薄層色譜法以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸（16 ∶2.5 ∶0.6，V/V）和乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸（1 ∶18 ∶1.2，V/V）作為展開劑，梯度點(diǎn)樣20、40、60、80、100 μg，采用硫酸乙醇顯色劑顯色法、熒光法檢測(cè)目標(biāo)樣品的純度。

1.2.4 結(jié)構(gòu)鑒定 制備的腺苷分別采用紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）、質(zhì)譜（MS）、核磁共振（NMR）等技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及確證。UV法測(cè)試溶劑為甲醇，掃描范圍為200～400 nm；IR法采用KBr壓片，掃描波數(shù)范圍為 400～4000 cm-1；MS分析條件參數(shù)同1.2.3；NMR的氘代試劑為DMSO。

1.2.5 均勻性檢驗(yàn) 在相對(duì)獨(dú)立和潔凈空間對(duì)制備的腺苷進(jìn)行分裝（4 mL 棕色瓶），依據(jù)GB/T 15000.3-2008 的要求，采取隨機(jī)順序重復(fù)測(cè)量的方法抽取樣品10 瓶，從每瓶中稱取3 份均為0.35 mg 的樣品分別溶于1.0 mL 色譜純的甲醇中，進(jìn)行HPLC 分析，以峰面積計(jì)算樣品的純度值，以方差分析法判斷均勻性。

1.2.6 穩(wěn)定性檢驗(yàn) 樣品分裝后于2～8 ℃保存。選擇2 年實(shí)驗(yàn)周期，對(duì)制備的腺苷標(biāo)準(zhǔn)品取樣進(jìn)行HPLC 分析，每份樣品重復(fù)測(cè)定5 次，統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)法［21］。

1.2.7 定值 按照GB/T15000.3-2008 要求，由8家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作試驗(yàn)進(jìn)行定值［20］，共隨機(jī)選擇24瓶樣品，平均寄送至8 家實(shí)驗(yàn)室，每份樣品通過HPLC 重復(fù)檢測(cè)2 次，讀取峰面積經(jīng)歸一化法［21］計(jì)算純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 腺苷純度分析

制備的腺苷單體經(jīng)HPLC 法進(jìn)行分析，結(jié)果除溶劑峰外，各檢測(cè)波長(zhǎng)下無其他雜峰出現(xiàn)。在258 nm 下，扣除溶劑色譜峰后，對(duì)樣品色譜峰進(jìn)行面積歸一法定量，等度分析條件下流動(dòng)相為乙腈/水和甲醇/水時(shí)腺苷純度分別為99.84%和99.85%，梯度條件下腺苷純度為99.86%。由熱重分析結(jié)果（圖1）可見，TG 曲線在28.0～202.0 ℃范圍內(nèi)為水平線，該溫度范圍內(nèi)腺苷穩(wěn)定性良好，達(dá)到235 ℃時(shí)開始分解。

經(jīng)薄層色譜分析，二氯甲烷∶甲醇∶甲酸（16 ∶2.5 ∶0.6，V/V）和乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸（1 ∶18 ∶1.2，V/V）兩種展開體系Rf均為0.45，符合化合物薄層測(cè)試的范圍要求，經(jīng)顯色觀察樣品無明顯雜質(zhì)，判斷樣品純度高。

2.2 腺苷結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.2 質(zhì)譜分析 對(duì)所制備的腺苷樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，檢測(cè)正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜結(jié)果，顯示m/z268.1 [M+H]+、290.1 [M+Na]+、266.1[M-H]-、302.1 [M+Cl]-、312.1 [M+COOH]-、533.2 [2M-H]-，即分子量為267.1。

圖1 腺苷的TG 曲線Fig.1 TG curve of adenosine

圖2 腺苷的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of adenosine

2.2.3 核磁共振分析1H-NMR 和13C-NMR 結(jié)果見表1、表2。1H-NMR 譜（表1）中，化學(xué)位移8.35（1H,s）、8.14（1H,s）顯示2 位、8 位質(zhì)子信號(hào)，化學(xué)位移 7.35（2H,brs）顯示氨基質(zhì)子信號(hào)。13C-NMR 譜（表2）中，156.6 顯示6 位碳信號(hào)，152.9 顯示 2 位碳信號(hào)，88.4、86.4、73.9、71.1、62.2 提示該化合物結(jié)構(gòu)中有五碳糖。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［22］結(jié)果一致，鑒定該化合物為腺苷。

表1 腺苷的核磁共振氫譜檢測(cè)數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMR data of adenosine

表2 腺苷的核磁共振碳譜檢測(cè)數(shù)據(jù)Table 2 13C-NMR data of adenosine

2.3 腺苷均勻性檢驗(yàn)

均勻性描述標(biāo)準(zhǔn)樣品的空間分布特征，以F檢驗(yàn)確定腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，分析腺苷樣品的瓶間均勻性和瓶?jī)?nèi)均勻性，結(jié)果見圖3、表3。

從均勻性試驗(yàn)方差分析結(jié)果（表3）可見，υ1（組間）=9、υ2（組內(nèi)）=20，經(jīng)查表得F0.05（9，20）=2.94，由于F=MS間/MS內(nèi)=1.04 ＜F0.05（9，20），因此本樣品是均勻的。

2.4 腺苷穩(wěn)定性檢驗(yàn)

圖3 腺苷樣品均勻性檢驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Result of homogeneity test of adenosine samples

表3 腺苷樣品均勻性試驗(yàn)的方差分析Table 3 Variance analysis of homogeneity test of adenosine

圖4 腺苷樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Result of stability test of adenosine samples

從圖4 可見，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，24 個(gè)月內(nèi)腺苷樣品檢測(cè)值未見顯著升高或降低，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以直線為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察斜率是否有顯著變化，進(jìn)行穩(wěn)定性變化的預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示斜率變化不顯著，未觀測(cè)到腺苷樣品出現(xiàn)明顯的不穩(wěn)定性，即本試驗(yàn)的腺苷樣品在兩年內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.5 定值

對(duì)8 家協(xié)作定值實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，腺苷純度的定值結(jié)果（表4）經(jīng)Grubbs（格拉布斯）檢驗(yàn)法分析，結(jié)果呈正態(tài)分布，未見異常值。

根據(jù)GB/T 15000.3-2008 的要求，定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值與不確定度計(jì)算獲得。依據(jù)協(xié)作定值實(shí)驗(yàn)室的腺苷HPLC 檢測(cè)結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)值99.89%，腺苷的測(cè)量不確定度U合成由u定（標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度）、u均（均勻性檢驗(yàn)中取得的不確定度）和u穩(wěn)（穩(wěn)定性檢驗(yàn)中取得的不確定度）組成，經(jīng)計(jì)算得u穩(wěn)=0.08%、u均=0.01%、u定=0.09%，三部分不確定度的分量沒有相關(guān)性，需要進(jìn)行合成，在95%置信區(qū)間，k=2 條件下進(jìn)行擴(kuò)展，最終U合成的計(jì)算公式為：

表4 腺苷純度協(xié)作定值數(shù)據(jù)Table 4 Data of collaborative certification of adenosine purity

計(jì)算得到腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的最終不確定度U合成為0.18%。

3 討論

標(biāo)準(zhǔn)樣品在生產(chǎn)質(zhì)量控制中必不可少，具有高度均勻性、量值準(zhǔn)確性和良好的穩(wěn)定性，以其作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，可以確保分析測(cè)試的質(zhì)量，使測(cè)試結(jié)果具有計(jì)量學(xué)溯源性、準(zhǔn)確性與合法性。作為實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品為科研生產(chǎn)、技術(shù)創(chuàng)新和法律法規(guī)的實(shí)施提供了有效支持，在保證不同國(guó)家/地區(qū)和不同時(shí)期測(cè)量結(jié)果的一致性和可比性、管理產(chǎn)品質(zhì)量、保護(hù)環(huán)境、消除貿(mào)易壁壘、保障人民生活等方面發(fā)揮了積極作用［23］。

本研究研制中藥天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品有助于解決目前我國(guó)中藥等天然產(chǎn)物提取、保健品及食品生產(chǎn)、化妝品開發(fā)等領(lǐng)域因標(biāo)準(zhǔn)樣品缺乏而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量控制和檢測(cè)難的問題，分析檢測(cè)中采用標(biāo)準(zhǔn)樣品能保證結(jié)果在國(guó)際貿(mào)易中的可比性、可溯源性，提升認(rèn)可度。目前中藥領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)樣品的發(fā)展仍較緩慢，標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類不多［24］，尚未形成系統(tǒng)化和規(guī)?；难兄?。隨著中藥越來越被國(guó)際認(rèn)可，標(biāo)準(zhǔn)樣品將有較大的需求和廣闊的發(fā)展空間。

本研究建立的腺苷單體的制備方法具有成本低、操作簡(jiǎn)便、效率高的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)較大量從瓜蔞中分離制備出高純度腺苷單體成分。對(duì)于有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的鑒定，通常采用四大波譜，即紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振確定［25］，也可采用 HPLC 法，認(rèn)為在同一分析條件下，同一保留時(shí)間的組分峰是同一化合物的可能性較大。本研究對(duì)所制備的腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了四大波譜分析，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，符合國(guó)際通用技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，具有準(zhǔn)確性。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)委員會(huì)（REMCO）是目前國(guó)際上最權(quán)威、最具影響的國(guó)際組織，ISO Guide 35 和中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)CNAS-GL29 規(guī)定了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法［25］，定值主要有單一方法測(cè)定、一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較定值、多種有效方法和/或多個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定3 種方式，由6～8家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作測(cè)試定值是國(guó)內(nèi)較常用的方法，因此本研究采用此法定值的結(jié)果具有權(quán)威性。

4 結(jié)論

本研究建立了一種從瓜蔞中分離制備腺苷單體的方法，按照ISO 和國(guó)標(biāo)的標(biāo)樣研制規(guī)程，研制了腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品，經(jīng)8 家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值，獲得了標(biāo)準(zhǔn)值為99.89%、置信度 95%下不確定度為0.18% 的腺苷國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品，均勻性符合標(biāo)準(zhǔn)，2～8 ℃條件下24 個(gè)月內(nèi)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性良好，該標(biāo)準(zhǔn)樣品已獲得專家組驗(yàn)收，解決了腺苷國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品缺乏的問題，為我國(guó)瓜蔞藥材及相關(guān)制品的生產(chǎn)質(zhì)量控制及分析檢測(cè)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。