何盛梅， 李昌亞， 孟令輝， 趙厚育

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科， 貴州 貴陽 550004)

喉癌是一種發(fā)生于頭頸部的常見腫瘤，由于發(fā)病位置特殊，可影響患者發(fā)音、呼吸和吞咽功能，因此嚴重影響患者的生活質量[1]。除了手術治療，大部分喉癌需要結合化療，其中順鉑是喉癌等頭頸部鱗癌的一線化療用藥，具有便宜、高效等特點[2]。然而，喉癌細胞對順鉑(cisplatin，DDP)的敏感性下降，直接影響治療效果，但目前癌細胞對DDP耐藥機制尚不清楚[3]。凋亡是化療藥物誘導腫瘤細胞死亡的主要模式，凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)家族在調節(jié)腫瘤細胞的凋亡敏感性方面起著核心作用[4]。Livin是IAP家族新成員，具有強大的抗凋亡能力，特異性表達于人的胚胎組織及許多腫瘤組織中，在正常成人組織中低表達或無表達，是當今腫瘤治療的一個新靶點[5]。課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，Livin在喉癌中高表達且和不良預后相關[6]，因此本研究通過RNAi沉默Livin的表達而獲得喉癌細胞對DDP的敏感度提升，可能為喉癌增敏治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與主要試劑 人喉鱗癌Hep2細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫； RPMI-1640培養(yǎng)基和Trizol RNA提取試劑(美國Gibco)，Lipofectamine 2000(美國Invitrogen)，小鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology)，鼠抗人Livin單克隆抗體(美國Chemicon)，兔抗人Caspase 3多克隆抗體(武漢博士德)，噻唑藍[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，MTT；美國Sigma]，洗滌緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)和磷酸緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)由實驗室配制， DDP購自山東齊魯制藥廠。

1.1.2主要儀器 臺式低溫高速離心機(beckMAN COULTER.INC)，蛋白半干式轉膜儀(美國BioRad)，Power PAC-300電泳儀(美國Bio-Rad)，RNA/DNA定量儀(美國Pharmacia)，凝膠成像系統(tǒng)(日本Olympus)，磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠)，恒溫干燥箱(上海醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

1.2.1靶向Livin的siRNA真核表達載體的構建、細胞培養(yǎng)及轉染 依據GenBank中Livin基因已知序列(NM-139317)，結合網上在線設計軟件，對它們的共同序列篩選出3條干擾序列，并合成3對siRNA。siRNA1：靶序列為5′ -CCGTGTCCATCGTCTTTGT-3′，正義鏈為5′ -CCGUGUCCAUCGUCUUUGU dTdT-3′，反義鏈為3′ -dTdT GGCACAGGUA GCAGAAACA -5′。siRNA2：靶序列為5′- GGAAGAGACTTTGTCCACA -3′，正義鏈為5′ -GGAAGAGACUUUGUCCACA dTdT-3′，反義鏈為3′-dTdTCCUUC UCUGAA ACAGGUGU-5′。siRNA3：靶序列為5′- AGAGAGGTCCAGTCTG AAA -3′，正義鏈為5′-AGAGAGGUCCAGUCUG AAA dTdT-3′，反義鏈為3′ -dTdTUCUCUCCAGGUCAGACU UU-5′。siRNA序列由廣州瑞博生物科技有限公司合成，所得siRNA分別命名為：Livin-siRNA1、Livin-siRNA2、Livin-siRNA3及control-siRNA。同時設計出非特異性靶序列作為陰性對照。Hep-2 細胞在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中、37 ℃的5%CO2培養(yǎng)，細胞轉染過程按轉染試劑盒說明書進行，以6孔培養(yǎng)板，轉染終濃度為50 nmol/L，用Lipofectamine 2000為轉染試劑，按說明書進行轉染。研究分為Hep2細胞+control-siRNA組(Hep2-con組)、Hep2細胞+ Lipofectamine 2000組(Hep2-L組)、Hep2細胞+Livin-siRNA1轉染組(Hep2-s1組)、Hep2細胞+Livin-siRNA2轉染組(Hep2-s2組)、Hep2細胞+Livin-siRNA3轉染組(Hep2-s3組)及Hep2細胞+PBS空白對照組(Hep2組)。根據Livin-siRNA轉染喉鱗癌Hep2細胞對Livin表達的影響結果，在后續(xù)實驗中，合成的3對siRNA僅保留干擾效果最好Hep2-s1，即后續(xù)實驗中僅有Hep2-con組、Hep2-L組、Hep2-s1組及Hep2組。

1.2.2Western blot檢測Livin蛋白表達水平 收集需要檢測蛋白的細胞并提取細胞總蛋白，取蛋白樣品各10 μL進行聚丙烯酰胺凝膠電泳3 h，將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，硝酸纖維素膜浸泡于10%脫脂奶封閉液，室溫下緩慢搖動1 h，加鼠抗人Livin單克隆抗體(1 ∶400)，4 ℃振搖孵育過夜；洗滌緩沖液(tris buffered saline tween,TBST)洗膜，加用辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液室溫下振搖孵育1 h，將PVDF膜浸于顯色液中觀察結果，用凝膠成像分析儀進行攝像。

1.2.3MTT檢測細胞活力 培養(yǎng)細胞，調整濃度為2×107個/L，細胞按100 μL (2×103個/孔)接種于96孔培養(yǎng)板，每組接種21個孔；37 ℃的5%CO2孵箱及飽和濕度條件下培養(yǎng)7 d，每孔加5 g/L MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清；每孔加二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)150 μL，振蕩10 min，充分溶解結晶，選擇490 nm波長于酶標儀上測定各孔光吸收值(optical density，OD)，記錄結果。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期變化及凋亡 對數生長期Hep2細胞按5×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，細胞貼壁生長24 h，按“1.2.1”項下分組分別進行轉染，0.25%胰蛋白酶消化各組Hep2細胞，1 000 r/min 4 ℃離心10 min，去上清，PBS洗2次，緩慢加入無水乙醇2.1 mL，使乙醇終濃度達70%以固定細胞，4 ℃過夜；加碘化丙啶(propidium Iodide，PI)染液500 μL，4 ℃避光反應30 min；流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡，分別計算各組細胞G0/G1期、S期、G2/M期各期細胞所占的百分率，觀察是否存在亞二倍體凋亡峰，計算各組細胞凋亡率[細胞凋亡率=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%]。

1.2.5平板克隆形成實驗 對數生長期Hep2細胞按5×105個/孔濃度接種于6孔培養(yǎng)板，每組細胞分別接種5個孔，細胞貼壁生長24 h，根據分組分別進行轉染，待細胞長滿至80%～85%底面積時，每組分別加入DDP至終濃度為0.00 、0.01、0.10、1.00及10.00 mg/L進行化療；0.25%胰蛋白酶消化并用吸管吹打成單個細胞，按每皿50、100及200個細胞的梯度密度將4組細胞各劑量分別接種于培養(yǎng)皿中，以十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細胞分散均勻；肉眼觀察培養(yǎng)皿中克隆形成情況，倒置顯微鏡(100×)下計數大于50個細胞的克隆數，計算集落形成率[集落形成率(%)=集落數/接種細胞數×100%]；重復3次，取平均值，計算各組細胞集落抑制率[集落抑制率=(1-實驗組集落形成率/對照組集落形成率)×100%]。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Livin-siRNA轉染喉鱗癌Hep2細胞對Livin表達的影響

Western blot 檢測結果顯示，Hep2-s1、Hep2-s2及Hep2-s3組分別與Hep2組相比，人喉鱗癌Hep2細胞Livin蛋白的表達水平降低(P<0.05)；Hep2-con組和Hep2- L組分別與Hep2組相比，人喉鱗癌Hep2細胞Livin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：(1)與Hep2組比較，P<0.05。圖1 各組細胞中 Livin蛋白的表達Fig.1 Expression levels of Livin protein in the cells of each group

2.2 Livin-siRNA轉染喉鱗癌Hep2細胞對其生長抑制及凋亡的作用

細胞生長曲線顯示，與Hep2組相比，Hep2-s1組人喉鱗癌Hep2細胞生長曲線上升平緩，各檢測點光OD下降(P<0.05)；Hep2-con組、Hep2- L組分別與Hep2組比較，各檢測點光OD基本一致 (P>0.05)，說明Livin-siRNA可抑制Hep2細胞的生長。見圖2。

注：(1)與Hep2組比較，P<0.05。圖2 各組細胞的生長曲線Fig.2 Proliferation curves of the cells in each group

2.3 細胞周期和凋亡

細胞周期結果顯示，與Hep2組相比，Hep2-s1組人喉鱗癌Hep2細胞被阻滯于G0/G1期(P<0.05)，S期細胞及G2/M期細胞明顯減少(P<0.05)，并在G1期前出現(xiàn)一明顯的亞二倍體凋亡峰，但Hep2-con組和Hep2- L組細胞周期無變化(P>0.05)；細胞凋亡結果顯示，與Hep2組相比，Hep2-s1組人喉鱗癌Hep2細胞凋亡率升高(P<0.05)，Hep2-con組和Hep2- L組分別與Hep2組比較、細胞凋亡率無變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組細胞的細胞周期和細胞凋亡率比較Tab.1 Comparison of cell cycle and apoptosis rate in the cells of each

2.4 Livin-siRNA轉染喉鱗癌Hep2細胞對其化療敏感性的影響

2.4.1平板克隆形成實驗 結果顯示，不同濃度DDP處理的Hep2-s1組與Hep2組比較， Hep2細胞克隆形成率均降低，尤以0.10、1.00和10.00 mg/L的DDP下降明顯(P<0.05)；不同濃度DDP處理的Hep2-con組、Hep2-L組分別與Hep2組比較， Hep2細胞克隆形成率無變化(P>0.05)。見圖3。

注：(1)與同濃度Hep2組比較，P<0.05。圖3 各組細胞各化療劑量下的細胞克隆形成率Fig.3 Colony formation rates of each group at different chemotherapy doses

2.4.2MTT檢測 在同一DDP藥物濃度下，Hep2-s1組與Hep2組相比，Hep2細胞存活率降低(P<0.05)；Hep2-con組、Hep2- L組分別與Hep2組比較，細胞存活率無差異(P>0.05)。見圖4。

注：(1)與同濃度Hep2組比較，P<0.05。圖4 不同濃度DDP作用后各組細胞的存活率Fig.4 Cell viability rates of each group after different concentrations DDP treatment

2.4.3DDP作用后細胞生長抑制情況 5 mg/L DDP作用后各組Hep2細胞生長抑制率均隨時間延長呈升高趨勢，Hep2-s1組與 Hep2組比較，各時間點細胞生長抑制率明顯增加(P<0.05)；Hep2-con組、Hep2- L組分別與Hep2組比較，各時間點人喉鱗癌Hep2細胞凋亡率和生長抑制率均無差異(P>0.05)。見圖5。

注：(1)與同時點Hep2組比較，P<0.05。圖5 DDP作用后不同時間點各組細胞生長抑制率Fig.5 Cell growth inhibition rates of each group at different time points after DDP treatment

3 討論

本實驗結果顯示，通過RNA干擾方法沉默Livin在喉癌中的表達，獲得良好效果，觀察到喉癌細胞中Livin蛋白表達顯著減少。IAP家族中的一個重要成員Livin，在成人的正常組織中幾乎無表達，但在多種常見惡性腫瘤中高表達，如有研究發(fā)現(xiàn)Livin在腮腺腫瘤[7]、骨肉瘤[8]、卵巢癌[9]中高表達，且和不良預后有關。由于Livin有強大的凋亡抑制能力和腫瘤組織內特異性分布，并且是影響細胞周期和細胞凋亡的關鍵分子和維持腫瘤細胞存活的必要條件[10]，因此以Livin為目的基因的腫瘤基因治療可以有效地殺死腫瘤細胞，逆轉腫瘤的惡性表型，并且能最大限度地減少對正常細胞的毒性作用[11-13]。因此以Livin基因作為腫瘤基因治療的靶點是很好的基因治療策略，本實驗利用RNA干擾技術沉默其表達，以對其功能進行進一步研究。

Livin基因作為IAP家族中的一個重要成員，不僅有強大的抗細胞凋亡作用，還可以調節(jié)細胞周期分布、抑制細胞增殖[10]。本研究探討了Livin基因對細胞凋亡和細胞周期的影響，流式細胞儀檢測結果顯示，Livin表達下調后，G0/G1期細胞增加，S期細胞及G2/M期細胞減少，提示細胞增殖能力下降，細胞增長趨勢受到抑制；通過MTT比色法繪制細胞生長曲線觀察到Livin表達下調使Hep2細胞增殖受抑，細胞生長曲線低平，缺乏指數增殖特征。另外，流式細胞儀結果還顯示，Livin表達下調后，使其主要的拮抗細胞凋亡功能喪失，細胞凋亡率升高。同時，細胞周期檢測圖也顯示在G1期前出現(xiàn)一明顯的亞二倍體凋亡峰，提示Livin RNAi有誘導細胞凋亡的作用。同樣，Wang等[14]采用RNAi沉默Livin在惡性黑色素瘤細胞中的表達后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的增殖受到抑制。

細胞凋亡存在3條通路，即死亡受體通路、線粒體通路及內質網通路，并最終都通過Caspases起作用[15-17]。IAP家族具有BIR結構域能與Caspase結合,抑制后者的活性,從而抑制細胞的凋亡[18]。在IAP家族成員中，僅有Livin具有α和β亞基，每個亞基各有1個BIR序列，Livin可通過BIR結構域與Caspase-3結合，發(fā)揮抑制細胞凋亡的功能[19]。本實驗探討了沉默Livin后，細胞對DDP敏感性的變化。靶向Livin可能通過復雜的分子機制逆轉腫瘤化療耐藥，如沉默結腸癌細胞中的Livin表達，可能通過調節(jié)細胞凋亡與自噬的串擾而實現(xiàn)癌細胞對5-氟尿嘧啶的增敏[20]；Livin可能介導了前列腺癌細胞對紫杉醇的耐藥，而柚皮苷可能通過降低其表達而獲得癌細胞對該化療藥的增敏[21]；在腎癌細胞中，沉默Livin表達后，不僅可以促進細胞自噬性死亡，還可以增加腎癌細胞對DDP的化療敏感性[22]。本研究通過沉默Livin在喉癌細胞中的表達，也獲得了癌細胞對DDP的增敏作用。因此，基于Livin僅在癌細胞中表達、有正常組織中不表達的特點， Livin有望成為腫瘤治療的一個重要靶點。

Livin促進腫瘤發(fā)展的機制十分復雜，目前還未了解清楚。比如，Livin在促進下咽癌發(fā)生發(fā)展過程中，可能有JNK和AKT信號通路參與[23]；乳腺癌中，Livin可能通過p38/GSK3β路徑激發(fā)上皮間質化過程，從而增強癌細胞的侵襲和轉移能力[24]。除了該通路，Livin還可以通過激活NF-κB而誘導結腸癌細胞上皮間質化進程，增強細胞轉移能力[25]。因此，Livin促進喉癌細胞DDP耐藥的分子機制也十分復雜，需要將來的研究中進一步探索。

綜上所述，以Livin為靶點的RNAi能特異性抑制Livin的表達，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。Livin可作為包括頭頸部惡性腫瘤在內的人類多種惡性腫瘤基因治療的一個潛在靶點。