張雨晴，武玉欽，袁建敏

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

在現(xiàn)代畜禽生產(chǎn)中，養(yǎng)殖場(chǎng)常通過提高飼養(yǎng)密度來降低成本，導(dǎo)致家禽發(fā)生高密度氧化應(yīng)激[1]。高密度氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致家禽血清中皮質(zhì)酮水平升高[2]，生產(chǎn)性能、胴體品質(zhì)下降[3]，產(chǎn)生炎性介質(zhì)致使細(xì)胞死亡[4]。核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）信號(hào)通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵通路，可轉(zhuǎn)錄大量炎性因子[5]。研究發(fā)現(xiàn)，煙酰胺（NAM）可通過磷酸戊糖途徑改善細(xì)胞氧化還原平衡[6]，提高免疫細(xì)胞的增殖潛能[7]。丁酸鈉可通過改善線粒體功能，提高機(jī)體抗氧化能力，維持小鼠腸道屏障完整性[8]。

目前，飼糧中添加煙酰胺和丁酸鈉能否緩解高密度應(yīng)激導(dǎo)致的肉雞炎癥、改善畜禽健康，還未見報(bào)道。本試驗(yàn)旨在研究煙酰胺和丁酸鈉對(duì)高密度籠養(yǎng)肉雞生產(chǎn)性能、血清及肝臟中抗氧化指標(biāo)、盲腸扁桃體炎癥因子的影響，為改善高密度飼養(yǎng)肉雞的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及動(dòng)物 試驗(yàn)動(dòng)物為AA+雄性肉雞，1 日齡雛雞購(gòu)于北京某公司；煙酰胺（99%）購(gòu)于江西兄弟醫(yī)藥有限公司；包被丁酸鈉（有效成分30%）購(gòu)于杭州康德權(quán)飼料有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧 1 日齡肉雞在相同的環(huán)境和飼養(yǎng)管理飼養(yǎng)至26 日齡后，選擇342 只體重相近約為1.2 kg 的肉雞隨機(jī)分為5 組，分別為正常密度組（12.9 只/m2）、高密度組（17.1 只/m2）、高密度+煙酰胺組（50 mg/kg）、高密度+丁酸鈉組（500 mg/kg）和高密度+復(fù)合添加劑組（50 mg/kg 煙酰胺+500 mg/kg 丁酸鈉）。每組6個(gè)重復(fù)，正常密度組每個(gè)重復(fù)9 只，高密度組每個(gè)重復(fù)12 只，飼養(yǎng)至46 日齡?；A(chǔ)飼糧參考NRC（1994）肉雞營(yíng)養(yǎng)需要配制玉米-豆粕型顆粒飼料，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州養(yǎng)殖基地進(jìn)行，試驗(yàn)期20 d。采用籠養(yǎng)（籠底面積0.7 m2），低密度9 只/籠（12.9 只/m2），高密度12 只/籠（17.1 只/m2），飼養(yǎng)管理參照AA+肉雞飼養(yǎng)管理手冊(cè)執(zhí)行，自動(dòng)化控制雞舍溫度、濕度和通風(fēng)，并進(jìn)行消毒、免疫。

1.4 樣品采集和測(cè)定指標(biāo) 46 日齡時(shí)，雞只空腹12 h 后，以重復(fù)為單位進(jìn)行稱重，記錄采食量，計(jì)算26～46 日齡體增重、采食量、耗料增重比。從每個(gè)重復(fù)選擇1 只接近平均體重的雞，翅靜脈采血，2 500 r/min 離心10 min得到血清，置于-20℃儲(chǔ)存待測(cè)。之后靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉劑將肉雞處死，迅速打開腹腔，采集肝臟、盲腸扁桃體分子樣品，迅速放液氮中，而后置-80℃冰箱待測(cè)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 血清氧化還原酶活性 取待測(cè)血清，使用南京建成生物工程研究所試劑盒按照說明書測(cè)定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，cat#A005）、超氧化物歧化酶（SOD，cat#A001-3）活性。

1.5.2 肝臟、盲腸扁桃體 mRNA 相對(duì)表達(dá)量 肝臟、盲腸扁桃體RNA 使用Trizol 試劑（TaKaRa，日本）進(jìn)行提取，用核酸測(cè)定儀（Nano-drop2000）測(cè)定RNA的純度和濃度。當(dāng)OD260nm/OD280nm在1.8～2.0 說明RNA 質(zhì)量較好，用于下一步試驗(yàn)。參照TaKaRa Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa，日本）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（RR420A，TaKaRa，日本）說明書進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)儀器為7500 熒光檢測(cè)系統(tǒng)（Applied Biosystems），PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s 后，進(jìn)行95℃變性5 s，60℃復(fù)性34 s，40 個(gè)循環(huán)反應(yīng)。引物DNA 由上海生工生物工程公司合成。PCR擴(kuò)增完成后觀察熔解曲線，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增基因片段是否符合設(shè)計(jì)長(zhǎng)度，驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。肝臟抗氧化基因所用引物序列見表2，盲腸扁桃體免疫相關(guān)基因所用引物序列見表3，基因表達(dá)的結(jié)果采用2-ΔΔCT進(jìn)行分析比較，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為參照基因校準(zhǔn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS（v.20.0，SPSS Institute，Chicago，IL）的ANOVA 進(jìn)行組間單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan's 多重比較，P＜0.05 時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響如表4 所示，飼養(yǎng)密度對(duì)肉雞采食量、末重和體增重均有顯著影響，高密度組采食量、末重和體增重均低于低密度對(duì)照組（P＜0.05）。高密度單獨(dú)添加煙酰胺或丁酸鈉對(duì)采食量、體增重和耗料增重比均沒有緩解效果，但高密度添加煙酰胺有提高末重的效果，高密度聯(lián)合添加煙酰胺和丁酸鈉可緩解高密度造成的末重和體增重下降，達(dá)到正常密度效果。

2.2 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對(duì)肉雞血清抗氧化酶活的影響 由表5 可知，高密度組添加丁酸鈉和煙酰胺對(duì)肉雞血清中GSH-Px、SOD 活性沒有顯著性影響。

表2 肝臟抗氧化相關(guān)基因 Real-time PCR 引物序列

表3 盲腸扁桃體免疫相關(guān)基因 Real-time PCR 引物序列

表4 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

表5 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對(duì)肉雞血清抗氧化酶活的影響

2.3 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對(duì)高密度飼養(yǎng)肉雞肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的影響 如表6 所示，與正常密度組相比，高密度組的肝臟HO-1mRNA 表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05）；高密度組單獨(dú)添加丁酸鈉、復(fù)合添加煙酰胺和丁酸鈉后進(jìn)一步上調(diào)了肝臟HO-1mRNA 表達(dá)（P＜0.05）；高密度降低了肝臟GSH-PxmRNA 的表達(dá)（P＜0.05），高密度組添加煙酰胺和丁酸鈉后可以提高GSH-PxmRNA 表達(dá)（P＜0.05），達(dá)到正常密度的效果。

2.4 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對(duì)高密度飼養(yǎng)肉雞盲腸扁桃體炎癥相關(guān)基因表達(dá)量的影響 如表7 所示，高密度組的盲腸扁桃體促炎因子TNF-αmRNA 低于正常密度組（P＜0.05），促炎因子IL6、抑炎因子IL10mRNA高于正常密度組（P＜0.05）；高密度組單獨(dú)添加煙酰胺或丁酸鈉均可提高TNF-αmRNA 表達(dá)（P＜0.05），但高密度添加丁酸鈉導(dǎo)致TNF-αmRNA 表達(dá)高于正常密度組，高密度添加煙酰胺+丁酸鈉可以提高TNF-αmRNA 表達(dá)（P＜0.05），達(dá)到正常密度的效果。

高密度組單獨(dú)添加煙酰胺或丁酸鈉以及復(fù)合添加組均可以降低IL6mRNA 表達(dá)（P＜0.05），達(dá)到正常密度效果。高密度復(fù)合添加煙酰胺和丁酸鈉組可降低盲腸IL10mRNA 表達(dá)（P＜0.05），達(dá)到正常密度組一致的效果。

2.5 煙酰胺和丁酸鈉對(duì)高密度飼養(yǎng)肉雞 Keap1-Nrf2-ARE 抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響 由表8 可知，在Keap1-Nrf2-ARE 通路中，與正常密度組相比，高密度組盲腸扁桃體Nrf2mRNA 上調(diào)（P＜0.05），高密度組單獨(dú)添加丁酸鈉或復(fù)合添加煙酰胺+丁酸鈉進(jìn)一步上調(diào)了Nrf2mRNA 表達(dá)（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 煙酰胺和丁酸鈉對(duì)高密度飼養(yǎng)肉雞生產(chǎn)性能的影響 高飼養(yǎng)密度可降低肉雞采食量、體增重和出欄重。Piva 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在高飼養(yǎng)密度下，高劑量煙酰胺（150 mg/ kg）可使24 日齡和40 日齡肉雞體重分別提高6.8%和2.4%；Song 等[10]研究表明，丁酸是腸細(xì)胞首選的能量來源，日糧補(bǔ)充丁酸鈉會(huì)降低肉雞的平均日采食量、耗料增重比和死亡率。本試驗(yàn)中，高密度組的采食量、末重和體增重均顯著低于低密度組，生產(chǎn)性能下降；單獨(dú)添加煙酰胺和復(fù)合添加組均可改善高密度造成的肉雞末重下降，復(fù)合添加劑組還可緩解高飼養(yǎng)密度引起體增重的降低，說明丁酸鈉和煙酰胺具有協(xié)同效應(yīng)，并且可以達(dá)到正常密度的效果。

3.2 煙酰胺和丁酸鈉對(duì)肉雞抗氧化功能的影響 肉雞產(chǎn)業(yè)中，高飼養(yǎng)密度會(huì)對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)健康造成許多負(fù)面影響[11]。越來越多的證據(jù)表明，家禽生產(chǎn)中的大部分問題都與氧化應(yīng)激有關(guān)[12]，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，產(chǎn)生大量活性氧[13]。氧化應(yīng)激還會(huì)產(chǎn)生大量應(yīng)激蛋白（如CRP、熱休克蛋白）并激活機(jī)體氧誘導(dǎo)的限速酶（如HO-1）加速組織氧化損傷[14]。CAT、SOD 和 GSH-Px 是機(jī)體最主要的酶促抗氧化系統(tǒng)，其主要作用是清除自由基和活性氧、防止過氧化物產(chǎn)生。Wu 等[15]試驗(yàn)表明，日糧添加丁酸鈉可提高血清SOD 和CAT 活性，降低血清MDA 水平，還可提高肉雞空腸黏膜的總抗氧化能力，降低空腸和回腸黏膜的MDA 含量。Choi 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，添加煙酰胺可抑制ROS 生成，降低脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化水平，提高線粒體還原水平。盡管本研究發(fā)現(xiàn)高密度添加煙酰胺+丁酸鈉并沒有改善血清中GSH-Px、SOD 含量，但肝臟的抗氧化基因GSH-PxmRNA 表達(dá)發(fā)生顯著性差異，說明高密度添加煙酰胺和丁酸鈉對(duì)肝臟的抗氧化能力產(chǎn)生了調(diào)節(jié)效應(yīng)。本試驗(yàn)中添加丁酸鈉和煙酰胺對(duì)高密度組肝臟中血紅素加氧酶具有顯著性調(diào)控作用，但對(duì)應(yīng)激蛋白沒有顯著影響，有待于進(jìn)一步研究。

表6 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對(duì)高密度飼養(yǎng)肉雞肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的影響

表7 飼糧添加煙酰胺和丁酸鈉對(duì)高密度飼養(yǎng)肉雞盲腸扁桃體炎癥相關(guān)基因表達(dá)量的影響

3.3 煙酰胺和丁酸鈉對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)的影響 細(xì)胞因子雖在機(jī)體內(nèi)含量較低，但作用高效，在機(jī)體免疫防御過程中發(fā)揮重要作用。Yarahmadi 等[17]研究表明，密度應(yīng)激能夠提高促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的釋放，促炎因子可以介導(dǎo)炎癥發(fā)生，但是有研究發(fā)現(xiàn)適量的TNF-α增加能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力[18]。這解釋了本試驗(yàn)中高密度組TNF-αmRNA 表達(dá)低于正常密度組，說明密度應(yīng)激后抗感染能力下降，復(fù)合添加丁酸鈉和煙酰胺可以提高TNF-αmRNA 表達(dá)，細(xì)胞因子的增加激活了機(jī)體第二道免疫防線。Lappas 等[19]研究表明，煙酰胺（NAM）可降低LPS 刺激的胎盤中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6以及炎性介質(zhì)前列腺素PGE2等基因的表達(dá)。Yanez 等[20]研究其抗炎機(jī)制發(fā)現(xiàn)NAM 可通過抑制核因子κB，激活二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP1）生成，減少促炎因子IL8 的產(chǎn)生。丁酸鈉不但可調(diào)節(jié)肉雞盲腸扁桃體中免疫相關(guān)基因的表達(dá)，降低十二指腸黏膜中促炎因子水平以及NF-κB 的活化水平[21]，還可降低雞血清中抑炎因子IL10 的水平[22]。本試驗(yàn)中高密度單獨(dú)添加煙酰胺或丁酸鈉以及復(fù)合添加劑組均降低了促炎因子IL6mRNA 表達(dá)，只有復(fù)合添加劑組IL10mRNA 表達(dá)顯著降低。因?yàn)榇傺滓蜃雍鸵盅滓蜃泳哂袇f(xié)同作用，炎癥早期，機(jī)體向促炎性免疫一端傾斜，加速免疫細(xì)胞進(jìn)行病原體清除，說明營(yíng)養(yǎng)調(diào)控對(duì)早期的炎癥起了作用。IL10 是潛在抗炎因子，在炎癥后期分泌，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受，此結(jié)果說明煙酰胺和丁酸鈉有助于恢復(fù)后期過度的炎癥反應(yīng)。

3.4 煙酰胺和丁酸鈉對(duì)Keap1-Nrf2-ARE 通路的調(diào)控Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）-核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）-抗氧化反應(yīng)元件（ARE）信號(hào)通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵通路，其調(diào)控下游相關(guān)代謝酶和抗氧化蛋白酶的合成[23]?？寡趸窌?huì)影響炎癥反應(yīng)通路，活性氧在NF-κB 炎癥信號(hào)通路中可以激活巨噬細(xì)胞表面上的Toll 樣受體（TLR4），增加炎性因子IL6、IL8、TNF-α的基因表達(dá)，同時(shí)iNOS 會(huì)被激活[24]。另一方面，當(dāng) NF-κB 分子在信號(hào)通路被激活時(shí)，會(huì)引起一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)和泛素化修飾，啟動(dòng)促炎因子的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[25]。iNOS 是體內(nèi)生成NO 的主要催化酶之一，在正常情況下并不表達(dá)，但受促炎因子和LPS 等刺激后會(huì)大量產(chǎn)生[26]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加煙酰胺和丁酸鈉后，Keap1-Nrf2-ARE 通路中Nrf2基因表達(dá)具有顯著性變化。Nrf2 的化學(xué)組分是堿性亮氨酸，可以加速清除體內(nèi)多余氧自由基。本試驗(yàn)中高密度組Nrf2基因表達(dá)明顯升高，說明Nrf2 是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，機(jī)體出現(xiàn)了應(yīng)激反應(yīng)。營(yíng)養(yǎng)調(diào)控后進(jìn)一步升高了Nrf2基因表達(dá)，說明活化的Nrf2 從Keap1 解離后進(jìn)入細(xì)胞核，與Maf 蛋白結(jié)合為異二聚體后再同ARE 序列結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化蛋白基因轉(zhuǎn)錄[27]?？寡趸分蠯eap-1 沒有顯著性變化，可能是Nrf2 的氨基酸有6 個(gè)保守的功能區(qū)，有的區(qū)域有絲氨酸殘基，對(duì)Nrf2 的調(diào)節(jié)不依賴于Keap-1。另外，Nrf2本身含有氧化應(yīng)激感受器，在氧化還原不平衡狀態(tài)下較為敏感。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在高密度籠養(yǎng)條件下，家禽飼糧中添加煙酰胺和丁酸鈉可以提高肉雞的生產(chǎn)性能，緩解高密度氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肉雞炎癥基因表達(dá)。Keap1-Nrf2-ARE 信號(hào)通路可能參與了煙酰胺和丁酸鈉對(duì)肉雞抗氧化能力的調(diào)控。