劉璐, 名曉東, 張曉艷, 郝俊杰, 付麗平, 王乾坤, 呂鑫, 陳旺, 劉全蘭*

(1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院， 山東 青島 266042; 2.青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 山東 青島 266100)

蠶豆(ViciafabaL.)屬豆科蝶形花亞科野豌豆族野豌豆屬，起源于亞洲西南部和非洲北部[1-2]。蠶豆?fàn)I養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、膳食纖維以及鈣、鐵、胡蘿卜素、維生素等；蠶豆中含有人體中不能合成的8種必需氨基酸，其中賴氨酸含量較高[3]。蠶豆還有利濕消腫、清熱健脾、促進骨骼生長的作用；其含有的腦磷脂和膽堿是大腦和神經(jīng)組織的重要組成成分[4]。不僅如此，蠶豆還在飼料和綠肥領(lǐng)域具有廣泛的用途，這些優(yōu)點使蠶豆受到聯(lián)合國糧農(nóng)組織的支持發(fā)展。中國是蠶豆種植面積較大的國家之一，青海、甘肅和云南等省區(qū)是主要種植地區(qū)。張小娟等[5]分析了青海省不同生態(tài)區(qū)蠶豆主栽品種青蠶 14 中的6個根瘤菌株，發(fā)現(xiàn)它們分屬 4 個菌屬；Sa?di等[6]從蠶豆根瘤中分離了104株內(nèi)生細(xì)菌，其中9株菌回接后可提高蠶豆的生物學(xué)產(chǎn)量，這些研究表明蠶豆中內(nèi)生細(xì)菌含量豐富。

植物內(nèi)生菌是指其生活史的一定階段或全部階段定殖于植物器官、組織內(nèi)部、細(xì)胞間隙以及細(xì)胞內(nèi)的微生物，一般分為內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌及內(nèi)生真菌等三大類[7- 8]。種子是植物重要的繁殖器官，具有重要的經(jīng)濟價值，也被證實攜帶有大量的微生物種群[9-11]?；?6S rDNA高通量測序研究種子內(nèi)生細(xì)菌的相關(guān)工作已開展，結(jié)果表明，水稻種子內(nèi)生細(xì)菌中門水平且豐度大于1%的優(yōu)勢菌群是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)[12]；玉米種子中的優(yōu)勢細(xì)菌群有泛菌屬 (Pantoea)、 鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、 不動桿菌屬(Acinetobacter)、 假單胞菌屬 (Pseudomonas)、 勒克氏菌屬(Leclercia)和腸桿菌屬(Enterobacter)[11]。內(nèi)生細(xì)菌的種類豐富度因世代傳遞和種子成熟度而呈動態(tài)變化特征，玉米種子內(nèi)生細(xì)菌在上下代傳遞時表現(xiàn)為父母本種子內(nèi)生細(xì)菌在子代的豐度不同于父母本[11]；成熟與未成熟喜樹種子中有共有屬水平的細(xì)菌，但內(nèi)生細(xì)菌的豐度有差異[13]。本研究選用口感好的兩個加工型蠶豆品種為植物材料，利用基于Illumina MiSeq第二代高通量測序技術(shù)，探索這兩個加工型蠶豆種子內(nèi)生細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)特征和豐度，為蠶豆種子的應(yīng)用和推廣提供內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1蠶豆材料 供試兩個蠶豆品種為日本大白皮(S18P23)和啟豆2號(S18P24)，種植在青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，采集形態(tài)一致的籽粒若干于4 ℃保存?zhèn)溆?。每個蠶豆品種選取兩粒種子，編號為S18P23.1、S18P23.2、S18P24.1、S18P24.2。

1.1.2主要試劑 DNA marker、Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer、Mg2+購自生工生物工程(上海)股份有限公司；基因組DNA提取試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司，其余常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1蠶豆消毒 蠶豆種子放入無菌水中清洗3 min，70%的乙醇沖洗3 min，再用無菌水沖洗掉種子表面的乙醇。取最后一次清洗蠶豆的無菌水100 μL涂布于TSA固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h，用以檢測滅菌效果[14]。

1.2.2基因組DNA提取和PCR擴增 消毒的蠶豆種子用無菌研磨杯研磨成粉，混勻。DNA提取試劑盒提取蠶豆粉中細(xì)菌基因組DNA，無菌水稀釋DNA濃度至 10 ng·μL-1左右。以稀釋后的基因組DNA為模板，選擇16S rRNA V3～V4區(qū)(343F： 5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和798R：5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)，使用帶Barcode的特異引物和ExTaq高保真酶進行兩輪PCR擴增。 第一輪PCR反應(yīng)體系: 2 μL 10×PCR Buffer，2.0 mmol·L-1Mg2+，200 μmol·L-1dNTPs，3×10-6μmol引物，45 ng模板DNA， 1.5 UExTaq高保真酶，滅菌雙蒸水以補足至20 μL。第一輪PCR擴增程序：85 ℃ 5 min，50 ℃ 1 min，65 ℃ 3 min； 94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，67 ℃ 2 min，15個循環(huán)； 67 ℃ 5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后使用磁珠純化，將磁珠搖勻懸浮，10 μL 擴增產(chǎn)物 和 18 μL 磁珠懸浮液混勻后，室溫孵育 5 min后放到磁力架上，按照OMEGA試劑說明書進行純化。純化后的產(chǎn)物作為第二輪 PCR 模板進行二次擴增， 擴增體系和程序同第一輪，其中循環(huán)數(shù)為10個。檢測合格的 PCR 產(chǎn)物使用磁珠純化，純化后對 PCR 產(chǎn)物進行 Qubit 定量。每一個樣品二輪PCR擴增分別做三次重復(fù)，三次 PCR 擴增產(chǎn)物濃度調(diào)整為相同水平，等量混樣送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進行測序。

1.2.3生物信息分析 Illumina MiSeq 測序生成原始雙端序列數(shù)據(jù)，以 FASTQ 格式存儲。使用 Trimmomatic 軟件對原始雙端序列進行去雜，去除含有模糊堿基(ambiguous)、單堿基高重復(fù)區(qū)(homologous)的序列以及長度過短的序列，去雜后的雙端序列用 FLASH 軟件進行拼接[15]。同時，利用 UCHIME 檢測并去除序列中的嵌合體序列[16]。測序數(shù)據(jù)進行預(yù)處理生成優(yōu)質(zhì)序列之后，根據(jù)序列的相似性，采用 Vsearch 軟件將序列歸為多個 OTU。序列相似度≥97%被歸為一個 OTU 單元[17]。使用 QIIME 軟件包[18]挑選出各個 OTU 的代表序列，并將所有代表序列與 Greengenes 或者 Silva 數(shù)據(jù)庫進行比對注釋[19-20]，去除注釋為葉綠體、線粒體及非細(xì)菌界的 OTUs。Mother 軟件做稀釋曲線分析[21]，通過對 OUT 進行豐度和α -多樣性分析，得到微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性特征；物種比對注釋使用 RDP classifier 軟件，保留置信區(qū)間>0.7 的注釋結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列長度分析

表面消毒的蠶豆種子在培養(yǎng)基上于28 ℃溫度下培養(yǎng)48 h，無菌落生長，說明試驗中的蠶豆種子消毒徹底。蠶豆種子內(nèi)生菌總DNA經(jīng)

16S rRNA V3～V4區(qū)特異性PCR擴增，均獲得大小為700 bp左右的目的片段。PCR產(chǎn)物測得的序列在去除引物接頭序列和兩端信號不佳的序列后拼接拼接后的序列長度在400 bp左右。兩個蠶豆品種的四粒種子中共測得155 408條原始序列，經(jīng)拼接和過濾處理后，獲得133 855條優(yōu)化序列，兩個品種的樣品優(yōu)化序列數(shù)目較為接近(表1)。序列長度主要分布在400～ 450 bp 范圍內(nèi) (圖1)，與 16S rRNA V3～V4 區(qū)序列長度大致吻合。

表1 蠶豆種子內(nèi)生菌序列Table 1 Sequence number of endophytic genomes from faba bean seeds

圖1 蠶豆種子內(nèi)生細(xì)菌擴增序列長度特征Fig.1 Length character of sequence of endophytic genome from faba bean seeds

2.2 操作分類單元OTU數(shù)目統(tǒng)計

從蠶豆種子中共獲得1 598個細(xì)菌OTUs，不同品種間 OTUs 數(shù)量存在差異(圖2)。日本大白皮S18P23.2中的內(nèi)生細(xì)菌OTUs 數(shù)最高，達(dá)487個；日本大白皮S18P23.1中內(nèi)生細(xì)菌 OTUs 數(shù)含量為371個；啟豆S18P24.1中內(nèi)生細(xì)菌OTUs數(shù)374個，啟豆S18P24.2中內(nèi)生細(xì)菌 OTUs 數(shù)366個。這兩個蠶豆品種的四粒種子里有66個共有的 OTUs；日本大白皮的兩粒種子S18P23.1和S18P23.2中共有145個OTUs，啟豆的兩粒種子S18P24.1和S18P24.2中共有129個OTUs。可見，兩個蠶豆品種中含有豐富的內(nèi)生細(xì)菌種類，品種間共有的核心菌群小于品種內(nèi)共有的核心菌群。

圖2 不同蠶豆品種種子內(nèi)生細(xì)菌OTUs的分布Fig.2 Statistics of the number of OTUs in faba bean seeds

2.3 蠶豆種子內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA序列的測序深度和多樣性分析

基于OTU的稀釋曲線結(jié)果顯示，隨著測序數(shù)量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨于平坦，且所有樣品均已進入平臺期，說明測序數(shù)量已經(jīng)足夠大，可以基本反映樣品中絕大多數(shù)微生物信息，Good coverage曲線顯示蠶豆樣品的測序深度均達(dá)到99%以上(圖3)。

Chao 1指數(shù)可反映內(nèi)生細(xì)菌群落豐富度(community richness)，從表2可以看出S18P24.1的群落豐富度最高， S18P24.2的豐富度為其次，S18P23.2的豐富度為最低。內(nèi)生細(xì)菌群落的豐富度和均勻度可通過Shannon指數(shù)得到反映，如同Chao 1指數(shù)反映的規(guī)律，S18P24.1的群落多樣性度最高，S18P24.2次之，S18P23.2最低。

圖3 蠶豆種子內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA序列覆蓋度Fig.3 16S rRNA sequence converage of endophytic bacterial genomes from faba bean seeds

2.4 群落結(jié)構(gòu)組成分析

2.4.1內(nèi)生細(xì)菌門水平上的群落結(jié)構(gòu)組成分析

從門的分類水平看，2個蠶豆品種中內(nèi)生細(xì)菌共檢測出17個門，蠶豆品種間內(nèi)生細(xì)菌所測到的細(xì)菌門種類相似，但其在各品種中所占比例不同(圖4)。整體而言，數(shù)量最多的5個門為擬桿菌門(Bacteroidetes，30%～33%)、變形菌門(Proteobacteria， 23%～25%)、厚壁菌門(Firmicutes， 23%～25%)、放線菌門(Actinobacteria， 5%～7%)?？梢?，擬桿菌門的比重最高，是優(yōu)勢門。軟壁菌門(Tenericutes)等常見細(xì)菌門在蠶豆種子中含量較少。

2.4.2內(nèi)生細(xì)菌屬水平上的群落結(jié)構(gòu)組成分析

按照至少在1 個種子中豐度≥1%的特征，所有OTU總共歸于擬桿菌屬(Bacteroides， 8%～17%)、乳桿菌屬(Lactobacillus， 7%～17%)、芽孢桿菌屬(Bacillus，豐度為6%～13%)、棒桿菌屬(Corynebacterium， 6%～11%)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella， 4%～14%)、普雷沃氏菌屬(Prevotella，1%～26%)、不動細(xì)菌屬(Acinetobacter， 1%～23%)、梭桿菌屬(Fusobacterium，2%～8%)、奈瑟菌屬(Neisseria， 2%～7%)、腸桿菌屬 (Enterobacter，2%～6%)、鏈球菌(Streptococcus，2%～4%)、Lachnoclostridium(1%～3%)等24個優(yōu)勢細(xì)菌屬(圖5)。日本大白皮蠶豆SP23.1的優(yōu)勢細(xì)菌菌屬是普雷沃氏菌屬，其豐度為26%左右；日本大白皮蠶豆SP23.2的優(yōu)勢細(xì)屬是不動細(xì)菌屬，其豐度為23%左右。啟豆蠶豆SP24.1的優(yōu)勢細(xì)菌菌屬是擬桿菌屬和乳桿菌屬，其豐度均為17%左右；啟豆蠶豆SP24.2的優(yōu)勢細(xì)菌菌屬是擬桿菌屬，其豐度為17%左右。從細(xì)菌菌屬的豐度分布看，日本大白皮蠶豆SP23兩粒種子內(nèi)生細(xì)菌的豐度在品種內(nèi)和品種間都有顯著不同的差異；相比較而言，啟豆蠶豆SP24兩粒種間子內(nèi)生細(xì)菌豐度的差異性低于日本大白皮蠶豆SP23。

表2 蠶豆種子內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA測序深度和多樣性Table 2 Sequencing depth and sequence diversity of 16S rRNA of endophytic bacterial genomes from faba bean seeds

圖4 蠶豆種子內(nèi)生細(xì)菌門的相對豐度分布Fig.4 Relative abundance distribution of endophytic bacteria at phylum levelin faba bean seeds

圖5 蠶豆種子內(nèi)生細(xì)菌屬水平的相對豐度Fig.5 Relative abundance of endophytic bacteria at genus level in faba bean seeds

3 討論

高通量技術(shù)在植物內(nèi)生菌研究中具有明顯優(yōu)勢，利用Illumina MiSeq第二代高通量測序技術(shù)分析16S rRNA，從基因組水平上解析微生物群落結(jié)構(gòu)，可以檢測到傳統(tǒng)方法難以檢測到的菌群。本研究發(fā)現(xiàn)，兩個蠶豆品種種子內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、放線菌門，這與其他植物種子內(nèi)生菌的優(yōu)勢菌門略有不同。如，水稻種子內(nèi)生菌的優(yōu)勢菌門是變形菌門、厚壁菌門和放線菌門[12]，這說明植物類型影響種子內(nèi)生菌的種類和豐富度。擬桿菌門包括擬桿菌綱(Bacteroidia)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)三大類細(xì)菌[22-24]，黃桿菌在番茄中高豐度的存在將有利于番茄抵抗土壤的病原體青枯菌[25]。變形菌門均為革蘭氏陰性菌，既有好氧菌也存在厭氧菌，既有自養(yǎng)型也有異養(yǎng)型，既存在光能型也存在化能型；根據(jù)rRNA序列，傳統(tǒng)上被分為五個綱，用希臘字母α、β、γ、δ、ε和ζ命名，它們在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥、衛(wèi)生、環(huán)保等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值[22-24]。厚壁菌門的細(xì)菌多數(shù)為革蘭氏陽性，菌體以球狀或桿狀為主，主要包括芽孢桿菌綱、梭菌綱、丹毒絲菌綱、熱石桿菌綱等，其中芽孢桿菌綱和梭菌綱是厚壁菌門的兩大主體[22-24]。放線菌門包括具有細(xì)菌形態(tài)的放線細(xì)菌和菌絲較為豐富的經(jīng)典放線菌[26],只有一個放線菌綱 (Actinobacteria)。放線菌綱包括酸微菌亞綱 (Subclass Acidimicrobidae)、紅細(xì)菌亞綱 (Subclass Rubrobacteridae)、紅蝽菌綱 (Subclass Coriobactridae)、球桿菌亞綱(Subclass Sphaerobacteridae)、放線菌亞綱 (Subclass Acinobacteridae)5個亞綱。這5個亞綱的特征預(yù)示著蠶豆種子內(nèi)生菌具有豐富的種群多樣性。

本研究進一步揭示了蠶豆種子內(nèi)生細(xì)菌豐度在1%以上的屬有24個屬，四粒種子中內(nèi)生細(xì)菌豐度在4%以上的屬有擬桿菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬和擬普雷沃菌屬5個屬，豐度在2%～8%的屬有梭桿菌屬、奈瑟菌屬、腸桿菌屬和鏈球菌4個屬，豐度差異大的屬有普雷沃氏菌屬和不動細(xì)菌屬。陳澤斌等[27]研究表明，花生仁內(nèi)生細(xì)菌主要有食酸菌屬(Acidovorax，83. 33%) 和希瓦氏菌屬(Shewanella，16.67%)；玉米種子內(nèi)生細(xì)菌的種類主要包括鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土地桿菌屬(Pedobacter)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、鹽單胞菌屬(Halomonas)和希瓦氏菌屬(Shewanella)6個屬[28]； 劉媛等[29]研究表明，棕櫚科不同植物的優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌屬不同，蒲葵種子中的優(yōu)勢細(xì)菌為芽孢桿菌屬(豐度45.8%)，棕櫚種子的優(yōu)勢菌屬為腸球菌屬(51.2%)，山棕種子的優(yōu)勢細(xì)菌屬為腸球菌屬(12.1%)，短穗魚尾葵種子的優(yōu)勢細(xì)菌屬為腸球菌屬(32.6%)，三藥檳榔種子的優(yōu)勢細(xì)菌屬為腸球菌屬(42.9%)，軟葉刺葵種子的優(yōu)勢細(xì)菌屬為腸球菌屬(28.3%)，加拿利海棗種子的優(yōu)勢細(xì)菌屬為糖多孢菌屬(31.2%)。這些結(jié)果說明，不同植物種子內(nèi)生細(xì)菌有差異，這種差異的機制尚需進一步研究。

日本大白皮兩粒種子內(nèi)生細(xì)菌在屬水平的豐度上存有明顯差異，兩粒種子中優(yōu)勢屬不同。日本大白皮SP23.1的優(yōu)勢菌普雷沃氏菌屬屬于擬桿菌門普雷沃氏菌科，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)在甘蔗糖蜜中的含量為2.1%±0.9%，它們在糖蜜添加到土壤的3 d后成為土壤的優(yōu)勢菌(328 OTUs)，36 d后僅有6個OTUs[30]，這些研究結(jié)果說明，普雷沃氏菌屬易因營養(yǎng)物質(zhì)的變化而發(fā)生大的波動。日本大白皮SP23.2的優(yōu)勢菌不動菌屬屬于變形菌門變形菌綱莫拉菌科(Moraxellaceae)，Shi等[31]從甜菜中分離的不動桿菌屬Acinetobacterjohnsonii3-1菌株有促進甜脆根生長的特性，Chen 等[32]從東南景天分離的內(nèi)生菌AcinetobactercalcoaceticusSasm3對硝酸鎘土壤有修復(fù)作用, Carvalheira 等[33]從生菜新鮮葉子、蘋果、梨、香蕉和草莓中分離的不動桿菌屬物種對多種抗生素有抗性，表明不動桿菌屬是植物中的常見內(nèi)生細(xì)菌。本研究中兩粒日本大白皮種子內(nèi)生細(xì)菌在優(yōu)勢菌屬和菌屬豐度上的差異，推測原因有兩個：一是高通量測序時取樣部位的差異導(dǎo)致了測序結(jié)果的差異；二是日本大白皮種子內(nèi)生細(xì)菌易受外界環(huán)境影響。

兩粒啟豆2號種子的內(nèi)生細(xì)菌在屬水平豐度上也存有一定差異，SP24.1的優(yōu)勢屬是乳桿菌屬和擬桿菌屬，SP24.2的優(yōu)勢屬是擬桿菌屬。與日本大白皮種子內(nèi)生菌的特征相比較，啟豆2號種子中內(nèi)生菌的益生菌含量更豐富。乳桿菌是許多作物種子的內(nèi)生細(xì)菌，如草莓果實[34]和小麥種子[35]等均有乳桿菌內(nèi)生菌的報道。近10年來，乳酸菌已成為有效的生物肥料、生控劑和生物刺激劑[36]，作為生物肥料，乳酸菌可提高來自有機肥和其他有機材料的營養(yǎng)物的供給；作為生物防控劑，乳酸菌還對廣譜的真菌和細(xì)菌病原菌有防控效果；作為生物刺激素，乳酸菌可以促進植物生長或種子發(fā)芽，減輕各種非生物壓力。擬桿菌屬是下一代益生菌，擬桿菌門在健康成年人體內(nèi)腸道菌群中的占比為20%～80%，擬桿菌綱是人體腸道革蘭氏陰性菌中含量最豐富的菌群(109～1011CFU·g-1糞便)[37-38]。啟豆2號蠶豆種子中含有大量的擬桿菌屬，說明這些種子有一定的益生功能。

本研究從兩個蠶豆品種的4粒種子中共獲得133 855條優(yōu)化序列，獲得1 598個細(xì)菌OTUs，4粒種子內(nèi)生細(xì)菌群落豐度在屬水平上有差異，但這些菌群對蠶豆種子品質(zhì)和發(fā)育的影響尚不清楚，應(yīng)進一步開展這些菌群代謝和功能的研究以便于揭示蠶豆-內(nèi)生細(xì)菌協(xié)作機制和規(guī)律。