王成坦，唐娟，毛福秀，楊玉瑩，袁珊，高蕊*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆 石河子 832000)

中風(fēng)是危害人類健康的一類頑疾，其預(yù)后取決于缺血再灌注損傷誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的受損情況。研究表明，卒中后神經(jīng)元死亡數(shù)目與缺血時間成正比[1]，因此，缺血性中風(fēng)的早期診斷對于該疾病的治療與預(yù)后意義非凡。然而，目前在臨床應(yīng)用方面尚未有一種可以單獨應(yīng)用于腦卒中診斷的外周血生物學(xué)標(biāo)志物[1]。MiRNA(micro RNA)在人類腦組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中富集[2]，且對中風(fēng)的發(fā)生、發(fā)展與預(yù)后發(fā)揮著重要作用[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后，低水平的miRNA-204可以減輕對其靶基因Nrn1的抑制作用，從而有助于形成適合神經(jīng)修復(fù)的微環(huán)境[4]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中腦源性miRNA可以釋放入血，引起外周血中miRNA水平改變[5]。

SONODA T等[6]通過miRNA芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)：外周血中有10個miRNA的表達變化與預(yù)測的中風(fēng)風(fēng)險之間存在顯著相關(guān)性，其中有7個(miR-1268a、miR-1268b、miR-4433b-3p、miR-6089、miR-6090、miR-6752-5p和miR-6803-5p)在缺血性腦中風(fēng)患者與正常受試者之間的表達具有顯著差異性。這表明外周血中腦源性miRNA的表達變化與卒中的病理生理進程密切相關(guān)，可能具有潛在的診斷與治療價值。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展與進步，利用生物信息學(xué)技術(shù)對前期腦卒中患者及動物卒中模型外周血中海量的實驗性測序數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)性的分析與挖掘，可能為尋找中風(fēng)診斷標(biāo)志物提供新的見解和方向。

大腦中動脈梗塞(MCAO，Middle Cerebral Artery Occlusion)模型是一種可以模擬腦缺血以及后續(xù)再灌注過程的動物模型，在研究缺血性中風(fēng)中應(yīng)用廣泛。我們通過GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫下載了MCAO模型組與假手術(shù)組大鼠的外周血miRNA表達譜，應(yīng)用R語言的limma包對測序數(shù)據(jù)進行miRNA差異分析，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測其靶基因，并根據(jù)靶基因功能預(yù)測以及互作分析的連接度初步鑒定出核心靶基因。將上述核心靶基因在GEO數(shù)據(jù)庫中的缺血性卒中患者外周血mRNA(message RNA)表達譜數(shù)據(jù)中進行鑒定，獲得11個表達顯著差異的關(guān)鍵基因。最后，結(jié)合miRNA-mRNA靶向數(shù)據(jù)以及關(guān)鍵基因的互作數(shù)據(jù)構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討上述調(diào)控通路在中風(fēng)發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 測序數(shù)據(jù)的獲取與差異分析

在GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中，獲取MCAO大鼠外周血miRNA表達數(shù)據(jù)集：GSE97532，其中包含3只MCAO大鼠與3只對照組大鼠。從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取人類外周血mRNA表達譜數(shù)據(jù)集：GSE16561，涵蓋39個缺血性中風(fēng)病人的外周血樣本與24個對照組受試者外周血樣本，兩組受試者的一般臨床信息見表格一。

差異分析使用基于R語言編寫的Limma軟件包，R語言是一種基于S語言的開源程序語言，因開源開放且具有完整的開發(fā)者生態(tài)對其進行拓展和維護，因此被廣泛應(yīng)用于統(tǒng)計分析、繪圖、數(shù)據(jù)挖掘等方面。使用Limma軟件包進行差異分析的流程是：(1) 讀取原始數(shù)據(jù)矩陣；(2) 矩陣清洗與標(biāo)準(zhǔn)化；(3) 分組與差異分析。差異篩選標(biāo)準(zhǔn)為：差異倍數(shù)≥1.5，P<0.05。

表1 缺血性卒中與對照組一般臨床信息

1.2 差異miRNA的保守性分析與靶基因預(yù)測

應(yīng)用miRbase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)鑒定差異miRNA在大鼠和人類序列之間的保守性，獲取與人類序列高度同源的miRNA。應(yīng)用miRDB軟件(http://www.mirdb.org/)預(yù)測保守miRNA的靶基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：Target Score>80。

1.3 核心靶基因篩選

將預(yù)測得到的miRNA靶基因上傳至string數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，預(yù)測靶基因之間的互作關(guān)系。將string數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果導(dǎo)入cytoscape軟件(下載地址：https://cytoscape.org/)，分析并鑒定出連接度(degree)位于前20的核心靶基因。

1.4 關(guān)鍵基因的外周血表達水平鑒定

應(yīng)用R語言的affy包對GSE16561芯片進行預(yù)處理，獲取芯片表達量，表達量的歸一化方法采用Z-Score法。提取20個核心基因在臨床外周血樣本中的表達信息，獲得缺血性卒中患者外周血中表達水平出現(xiàn)顯著改變的11個關(guān)鍵基因，差異分析使用 Student-T Test。

1.5 卒中后關(guān)鍵miRNA-mRNA表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將差異miRNA與11個關(guān)鍵基因的靶向關(guān)系以及關(guān)鍵基因之間的相互作用關(guān)系合并后導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建關(guān)鍵miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 關(guān)鍵基因的功能分析

使用R語言的ClusterProfile包對關(guān)鍵基因進行GO(Gene Ontology)與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠MCAO模型外周血差異miRNA的獲取與保守性分析

我們應(yīng)用R語言的limma包分析MCAO大鼠外周血miRNA表達譜GSE97532，得到15個差異miRNA，其中，上調(diào)miRNA有9個，下調(diào)有6個(圖1A)。將差異基因按照表達量進行聚類，以鑒定差異基因的表達模式，直觀展示差異miRNA表達水平(圖1B)。應(yīng)用miRbase數(shù)據(jù)庫分析得到11個在人類和大鼠之間高度保守的miRNA：miR-346、miR-182、miR-194-5p、miR-139-5p、miR-128-2-5p、miR-24-1-5p、miR-191b、miR-107-5p、miR-383-5p、miR-328b-3p、miR-23b-5p，它們的序列在人和大鼠之間高度同源(圖1C)。保守性高的miRNA往往提示其可能具有重要的生物學(xué)功能，因此在后續(xù)的分析過程中使用這11個miRNA。

圖1 大鼠MCAO模型外周血差異miRNA獲取與保守性分析

2.2 保守miRNA靶基因的預(yù)測與核心靶基因的篩選

MiRNA的生物學(xué)功能主要通過調(diào)控下游靶標(biāo)基因的表達水平來實現(xiàn)。因此，我們采用miRDB軟件預(yù)測miRNA的靶基因，設(shè)定嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)，11條保守miRNA共預(yù)測到1467個靶基因。隨后，應(yīng)用string數(shù)據(jù)庫，從基因共表達、基因融合、基因鄰接、文本數(shù)據(jù)挖掘、實驗證據(jù)證實等角度構(gòu)建了差異miRNA靶基因之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI network，Protein-protein Interaction Network)。在所有的1467個靶基因中，有1451個蛋白質(zhì)被納入本互作網(wǎng)絡(luò)，組成含有1451個節(jié)點和7961對相關(guān)關(guān)系的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)(圖2)。

一般認(rèn)為節(jié)點連接度(degree)越高的基因可能在互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮更重要的作用，所以，我們應(yīng)用cytoscape軟件分析該互作網(wǎng)絡(luò)并篩選出網(wǎng)絡(luò)中連接度位于前20的核心基因(hub gene)。在篩選出核心靶基因之后，我們進一步的使用cytoscape軟件從圖2的PPI網(wǎng)絡(luò)中提取出20個核心靶基因的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(圖3)。

圖2 靶基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

顏色從黃色到紅色代表著連接度(degree)由低到高，有互作關(guān)系的節(jié)點使用箭頭相連，箭頭所指為被調(diào)控關(guān)系圖3 TOP 20 核心基因互作關(guān)系圖

2.3 卒中患者核心靶基因外周血表達水平的鑒定

為了更進一步的明確核心靶基因與卒中疾病的關(guān)系，我們應(yīng)用另一個mRNA的表達芯片GSE16561(包括39個中風(fēng)病人外周血樣本與24個對照組外周血樣本)，檢測20個核心靶基因的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有11個核心基因表達水平出顯著差異(圖4)。我們將這些在卒中患者外周血中顯著變化且密切參與疾病發(fā)生發(fā)展互作網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點基因定為本研究的關(guān)鍵基因。絕大部分關(guān)鍵基因在卒中患者外周血中表達上調(diào)，僅有一個基因表達下調(diào)(圖4)。這些在疾病中發(fā)揮重要生物學(xué)作用的關(guān)鍵基因，也具有成為卒中后外周血診斷標(biāo)志物的潛能。

缺血性卒中組與對照組相比較，顯著性檢驗使用Student-T Test，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001圖4 卒中患者外周血關(guān)鍵基因的表達驗證

2.4 卒中后miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在篩選并鑒定出差異miRNA的關(guān)鍵下游靶基因后，結(jié)合miRNA-mRNA靶向數(shù)據(jù)和關(guān)鍵基因蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)，應(yīng)用cytoscape軟件構(gòu)建了卒中后miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)。從網(wǎng)絡(luò)互作角度分析卒中后關(guān)鍵差異表達miRNA可能的作用。發(fā)現(xiàn)有6個miRNA(miR-182、miR-191-5p、miR-383-5p、miR-139、miR-128-2-5p、miR-194-5p)靶向調(diào)控11個關(guān)鍵基因，其中miR-182靶向調(diào)控了CTTN，CREB1，GRB2，F(xiàn)OXO3，F(xiàn)BXW7五個關(guān)鍵基因(圖5)。

關(guān)鍵基因Notch1在互作網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點連接度僅次于miR-182,Notch1以及與其具有相互作用的3個基因共同被篩選為本研究的關(guān)鍵基因(圖5)。

紅色V形為miRNA，綠色圓形為靶基因，線段代表相連的兩節(jié)點之間具有互作關(guān)系圖5 卒中后關(guān)鍵miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 關(guān)鍵靶基因功能分析

我們應(yīng)用GO和KEGG富集分析，對這11個關(guān)鍵基因的功能進行了預(yù)測和分析。GO分析結(jié)果顯示：在生物學(xué)進程方面，造血調(diào)控、神經(jīng)元死亡調(diào)控、對缺氧的反應(yīng)等條目出現(xiàn)顯著富集(圖6A)；在分子功能方面，主要富集在與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子激活與結(jié)合領(lǐng)域(圖6B)，這些條目與卒中的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。KEGG富集結(jié)果顯示：PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路、Notch信號通路、MAPK信號通路等響應(yīng)缺血性卒中的重要信號通路出現(xiàn)顯著富集，且這幾個信號通路之間存在相互作用，可以協(xié)同影響卒中的發(fā)生發(fā)展(圖6C)。

圖6 關(guān)鍵靶基因GO與KEGG富集分析結(jié)果

3 討論

近年來缺血性卒中發(fā)病率不斷上升，已成為造成中國成年人死亡的第一大主因[7]。不同于出血性卒中，缺血性卒中起病時沒有典型的影像學(xué)特征表現(xiàn)，同時也缺乏可靠的分子診斷指標(biāo)。在中風(fēng)的相關(guān)研究中，有大量外周血表達變化的miRNA可能具有潛在的診斷和治療價值，LONG G等人證實miR-30a，miR-126和let-7b可用作診斷缺血性卒中的可靠標(biāo)志物[8]；MAKRIS K等發(fā)現(xiàn)miR-140-5p在卒中后外周血中表達顯著上調(diào)，可能具備作為中風(fēng)后抑郁的獨立風(fēng)險因素的價值[1]。LI等人報道，卒中后缺氧狀態(tài)下上調(diào)的HIF-1a可以激活miR-182，抑制氧依賴性HIF-1a的降解酶PHD2和FIH的激活，由此形成正反饋促進HIF-1a的不可逆激活[9]。但是在臨床應(yīng)用方面，尚未有一種miRNA可以獨立作為腦卒中的生物學(xué)診斷標(biāo)志物[1]。

本研究挖掘得到的15個差異miRNA，其中有11個是大在大鼠與人類中高度保守的miRNA，而原始文獻僅挖掘到7個差異miRNA，其中有5個與本研究相同[10]。原始文獻應(yīng)用的篩選軟件是Affymetrix TAC，該軟件屬于芯片公司開發(fā)的軟件，應(yīng)用人數(shù)較少，分析較粗糙。本研究使用基于R語言的Limma包，它有以下幾個優(yōu)點：(1) 采用線性模型，適用范圍廣，在復(fù)雜的實驗設(shè)計下也可以高效的處理數(shù)據(jù)；(2) 利用基因組數(shù)據(jù)的高度平行性，允許基因之間和樣本之間存在不同程度的變異性，即使在小樣本量的差異分析中也能保證分析的準(zhǔn)確性；(3) 對表達譜數(shù)據(jù)整體進行分析處理，分析結(jié)果可以用于高層次基因表達特征分析、加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析等后續(xù)分析[11]?；谝陨显?，limma包已成為應(yīng)用最廣泛的芯片分析方法[11]。本研究挖掘出來的miR-182、miR-128等關(guān)鍵miRNA，曾經(jīng)被多項研究證實在缺血性卒中病人的外周血中出現(xiàn)顯著表達變化[12-14]，可能在中風(fēng)的診斷、治療、預(yù)后等方面具有重要價值。

應(yīng)用miRDB軟件，11條高度保守的miRNA通過嚴(yán)格的篩選閾值，共篩選得到1467個靶基因。通過構(gòu)建靶基因之間的PPI網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)連接度，我們找出了連接度位于前20的核心基因。通過分析缺血性卒中患者外周血mRNA表達譜數(shù)據(jù)，鑒定出卒中患者外周血中表達顯著改變的11個關(guān)鍵基因。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，這些關(guān)鍵基因及其相關(guān)信號通路與缺血性卒中的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。cAMP通路是關(guān)鍵基因高度富集通路之一，11個關(guān)鍵基因中的FOS、 CREB1、RHOA、CREBBP等基因都與cAMP通路有關(guān)。cAMP通路可以調(diào)節(jié)卒中后的神經(jīng)再生、血管生成、神經(jīng)炎癥等生物學(xué)過程，是卒中后的重要調(diào)控通路[15]。CREB1是cAMP信號通路的關(guān)鍵蛋白，在癌癥合并缺血性中風(fēng)病人外周血中，CREB1基因顯著高表達[16]。此外，Notch1在卒中后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中被激活，可以直接調(diào)節(jié)中風(fēng)后的血管生成以及血腦屏障的完整性[17]。FOS基因在卒中梗死側(cè)的周圍持續(xù)高表達，并且在缺血性卒中病人的外周血中大量表達，這使其具備成為缺血性中風(fēng)候選診斷標(biāo)志物的潛能[18]。

結(jié)合miRNA-mRNA靶向數(shù)據(jù)、核心靶基因篩選、核心靶基因相互作用數(shù)據(jù)，本研究構(gòu)建了卒中后的miRNA-mRNA表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包含6個關(guān)鍵miRNA與11個核心基因。在這6個關(guān)鍵miRNA中，3個下調(diào)的miRNA:miR-194-5p、miR-182、miR-139調(diào)控了PPP2CA、FOS、Notch1、GRB2、CTTN、FOXO3、CREB1、FBXW7、ITPKB 9個功能基因的轉(zhuǎn)錄本，其中僅有ITPKB在卒中后表達下調(diào)，其余mRNA及其互補結(jié)合的miRNA的表達水平均呈反比關(guān)系。這與miRNA的作用方式有關(guān)，miRNA可以通過結(jié)合在靶基因的3’UTR區(qū)域沉默mRNA的表達[19]。3個上調(diào)的miRNA：miR-128-2-5p、miR-191-5p、miR-383-5p可能參與RHOA、CREBBP、FOS靶基因的調(diào)控。正如KEGG富集結(jié)果(圖6C)所示，靶基因所參與的是一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終所體現(xiàn)的表達水平變化是各因素綜合作用的結(jié)果。

結(jié)合靶基因所在的信號通路以及靶基因的表達譜數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)CREB1和Notch1在中風(fēng)患者的血液樣本中顯著高表達(圖4)，其相關(guān)通路——cAMP信號通路與Notch信號通路也被顯著富集并具有重要的互作調(diào)控關(guān)系(圖6C)。這提示我們，CREB1和Notch1以及靶向它的miR-182和miR-139可能在缺血性卒中的病理生理進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。前期研究表明，miR-182可作為中風(fēng)早期診斷的外周血標(biāo)志物[12]。miR-182可以通過調(diào)節(jié)靶基因的表達，影響中風(fēng)后的組織損傷與修復(fù)過程。YI等[20]研究證實miR-182可以通過靶向調(diào)節(jié)ASPP家族的抑制因子來加重腦缺血再灌注損傷。而本研究發(fā)現(xiàn)，miR-182可能通過調(diào)控CREB1、GRB2、CTTN、FOXO3、FBXW7這5個關(guān)鍵基因影響cAMP信號通路、Notch信號通路、MAPK信號通路進而影響卒中后的病理生理進程。研究表明，miR-139可以通過直接靶向c-Jun調(diào)控缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)[21]。miR-139也可以通過靶向抑制Notch1進而抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[22]。但是，miR-139靶向Notch1基因在腦卒中發(fā)生發(fā)展的作用尚未明確。我們證實了卒中后的關(guān)鍵作用因子miR-139和Notch1在外周血中的表達呈負(fù)相關(guān)，且miR-139和miR-182的靶基因作用途徑高度相關(guān)，miR-182的靶基因GRB2可與miR-139的靶基因Notch1的調(diào)節(jié)劑Deltex直接作用，抑制MAPK信號通路的激活[23]。這些結(jié)果表明，miR-182和miR-139可能通過調(diào)控下游一系列靶基因發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)進而影響信號通路的互作，參與缺血性中風(fēng)的病理生理進程，而其聯(lián)合應(yīng)用及作用機制有待更深入的探究。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)方法，鑒定了中風(fēng)后差異表達的15個miRNA，通過同源性分析鑒定出11個人和大鼠之間高度保守的miRNA，預(yù)測并篩選了其靶基因。應(yīng)用靶基因功能富集分析和靶基因之間的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)解析，并與卒中患者外周血mRNA表達譜數(shù)據(jù)相結(jié)合，交集篩選出可能在中風(fēng)的病理生理進程中起到關(guān)鍵作用的6個關(guān)鍵miRNA及其靶向的11個關(guān)鍵靶基因，構(gòu)建了miRNA-mRNA表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行深度的功能分析。最終篩選出在缺血性卒中發(fā)揮關(guān)鍵作用的兩對miRNA-mRNA靶向關(guān)系對：miR-182-CREB1和miR-139-Notch1，它們在缺血性卒中疾病中的聯(lián)合作用機制和聯(lián)合診斷價值值得更進一步的研究與關(guān)注。